Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Podsumowanie

Zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia w podocytach są jednym z najważniejszych sposobów kontrolowania funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. W tym miejscu wyjaśniamy podejście o wysokiej przepustowości, które umożliwia wykrywanie obchodzenia się z wapniem w czasie rzeczywistym i aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych.

Streszczenie

Podocyty (komórki nabłonka kłębuszków nerkowych) są znane z regulowania przepuszczalności kłębuszków nerkowych i utrzymywania struktury kłębuszków nerkowych; kluczowa rola tych komórek w patogenezie różnych chorób nerek została ustalona, ponieważ uszkodzenie podocytów prowadzi do białkomoczu i zaniku procesu łapowego. Wcześniej informowano, że różne czynniki endogenne mogą powodować dramatyczne przeciążenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca^{2 +} w podocytach, prawdopodobnie prowadząc do albuminurii, a to prawdopodobnie dzieje się za pośrednictwem kanałów jonowych przewodzących wapń. Dlatego ważne okazało się zbadanie obchodzenia się z wapniem w podocytach zarówno w normalnych warunkach, jak i w różnych stanach patologicznych. Jednak dostępne podejścia eksperymentalne pozostały nieco ograniczone do komórek hodowanych i transfekowanych. Chociaż stanowią one dobry podstawowy model dla takich badań, są one zasadniczo ekstrahowane z rodzimego środowiska kłębuszków nerkowych. W tym miejscu opisujemy metodologię badania podocytów jako części świeżo wyizolowanych całych kłębuszków nerkowych. Preparat ten zachowuje potencjał funkcjonalny podocytów, które są nadal przyczepione do naczyń włosowatych; Dlatego podocyty pozostają w środowisku, które chroni główne części aparatu filtracyjnego kłębuszków nerkowych. Niniejszy manuskrypt omawia dwa podejścia eksperymentalne, które pozwalają na 1) wykrywanie zmian stężenia wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą ratiometrycznej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz 2) rejestrację aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych. Metodologie te wykorzystują zalety rodzimego środowiska kłębuszków nerkowych, które umożliwiają naukowcom rozwiązanie ostrych zmian w wewnątrzkomórkowym obchodzeniu się z wapniem w odpowiedzi na zastosowanie różnych czynników, pomiar podstawowego stężenia wapnia w komórkach (na przykład w celu oceny postępu choroby) oraz ocenę i manipulowanie przewodnictwem wapnia na poziomie pojedynczych kanałów jonowych.

Wprowadzenie

Nerki utrzymują równowagę homeostatyczną dla różnych substancji i regulują objętość krwi w sposób, który określa całkowite ciśnienie krwi. Zaburzenia filtracji, wchłaniania zwrotnego lub wydzielania nerek prowadzą do lub towarzyszą stanom patologicznym, począwszy od nadciśnienia tętniczego lub niedociśnienia, a skończywszy na schyłkowej niewydolności nerek, która ostatecznie wymaga przeszczepu nerki. Nerkowa jednostka filtrująca (kłębuszek nerkowy) składa się z trzech warstw – śródbłonka naczyń włosowatych, błony podstawnej i jednokomórkowej warstwy komórek nabłonkowych – podocytów, które odgrywają główną rolę w utrzymaniu integralności i funkcji błony szczelinowej¹. Dysfunkcja permselektywnego filtra kłębuszkowego powoduje utratę makrocząsteczek z moczem, taką jak białkomocz. Różne czynniki mogą wpływać na strukturę podocytów i ich procesy stóp, które decydują o integralności bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych.

Podocyty są zaangażowane w utrzymanie funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. Ustalono, że niewłaściwe obchodzenie się z wapniem przez podocyty prowadzi do uszkodzenia komórek i odgrywa ważną rolę w progresji różnych postaci nefropatii^2,3. W związku z tym opracowanie modelu pozwalającego na bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowych zmian stężenia wapnia będzie miało zasadnicze znaczenie dla badań nad funkcją podocytów. Izolowane kłębuszki nerkowe były wcześniej wykorzystywane w licznych badaniach, w tym w pomiarze zmian współczynnika odbicia albuminy4 oraz ocenie integralnych prądów komórkowych w pomiarach elektrofizjologicznych klamer krosowych^{całej komórki 5,6}. W niniejszej pracy opisano protokół, który pozwala badaczowi mierzyć wewnątrzkomórkowe zmiany stężenia wapnia w odpowiedzi na zastosowanie środków farmakologicznych, oszacować podstawowe poziomy wapnia w komórkach oraz ocenić aktywność poszczególnych kanałów wapniowych. Do określenia zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w obrębie podocytów i aktywności kanału wykorzystano pomiary ratometryczne stężenia wapnia oraz elektrofizjologię patch-clamp.

Protokół

Wykorzystanie i dobrostan zwierząt powinny być zgodne z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Płukanie nerek

1. Użyć samców szczurów w wieku od 8 do 12 tygodni (sugerowany szczep Sprague Dawley, jednak można stosować inne szczepy w różnym wieku i o różnej płci, wprowadzając odpowiednie modyfikacje).
2. Zanurzyć zwierzę w narkozie zgodnie z procedurą dopuszczoną przez protokół IACUC; monitorować głębokość znieczulenia i zbadać zwierzę. Szczegółowy opis zabiegu chirurgicznego, który zostanie przeprowadzony w punktach 1.3 - 1.8, znajduje się w pracy Ilatovskaya et al.⁷
3. Po prawidłowym znieczuleniu umieścić zwierzę na stole operacyjnym z kontrolą temperatury, wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha (do 3 cali długości) i odsłonić żyłę główną oraz aortę.
4. Założyć ligaturę wokół tętnicy trzewnej, tętnicy krezkowej górnej oraz aorty brzusznej powyżej nich; nie podwiązywać.
5. Wyonać tępe rozdzielenie aorty brzusznej poniżej tętnic nerkowych i założyć wokół niej dwie ligatury, ale nie podwiązywać; następnie zacisnąć aortę powyżej ligatur i zawiązać dolną nitkę.
6. Wprowadzić do aorty cewnik z rurki polietylenowej PE50 (podłączonej do pompy strzykawkowej wypełnionej PBS) poniżej zacisku i przymocować cewnik drugą ligaturą; usunąć zacisk, włączyć pompę i podwiązać aortę oraz tętnicę krezkową wraz z tętnicą trzewną. Szybko wykonać nacięcie w żyle nerkowej, aby obniżyć ciśnienie.
7. Przeprowadzić perfuzję aorty schłodzonym PBS przez 2 lub 3 min z szybkością 6 ml/min.
8. Zatrzymać perfuzję, wyciąć i odtrułować⁷ nerki, a następnie umieścić je w roztworze PBS na lodzie. Uśmiercić zwierzę zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.

2. Izolacja kłębuszków nerkowych szczura

1. Przygotować 30 ml świeżego roztworu 5% BSA w RPMI 1640.
2. Za pomocą żyletki i nożyczek wyizolować korę obu nerek, a następnie rozdrobnić do uzyskania homogennej masy. Procedura ta została opisana wcześniej⁷.
3. Rozdrobnioną w poprzednim kroku tkankę przecisnąć szpachelką przez stalowe sito o oczkach 100 mesh (wcześniej namoczone w roztworze 5% BSA/RPMI). Zebrać przelewy i pozwolić im spłynąć grawitacyjnie przez sito o oczkach 140 mesh.
4. Przelewy zebrane z sita 140 mesh przefiltrować przez wcześniej namoczone sito o oczkach 200 mesh, odrzucić filtrat, a górną część sita przemyć 10 – 15 ml przygotowanego roztworu BSA/RPMI, aby zebrać kłębki nerkowe osadzające się na sicie.
5. Roztwór BSA/RPMI zawierający kłębki nerkowe umieścić w probówce 15 ml na lodzie i pozostawić kłębki do osadzenia na dnie probówki przez maksymalnie 20 min. Koncentrat kłębków nerkowych na dnie probówki będzie wyraźnie widoczny. Usunąć nadmiar roztworu, pozostawiając w probówce około 2 ml.

3. Jednokanałowa elektrofizjologia patch-clamp

1. Przygotować szkiełka nakrywkowe o wymiarach 5 x 5 mm, pokrywając je poli-ʟ-lizyną o MW 70 000 - 150 000, i pozostawić do wyschnięcia. Na każde szkiełko zużyć około 30 µl 0,01% sterylnego roztworu filtrowanego w wodzie.
2. Ogrzać roztwory eksperymentalne do RT i napełnić komorę do patch-clamp oraz pipetę. Do monitorowania kanałów TRPC zastosować roztwór kąpielowy, w mM: 126 NaCl, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 2 MgCl₂, 10 glukozy, pH 7,4; roztwór do pipety: 126 NaCl, 1,5 CaCl₂, 10 HEPES, 10 glukozy; pH 7,4.
   1. Bezpośrednio przed eksperymentem patch-clamp dodać do roztworu w pipecie inhibitory w celu zablokowania aktywności kanałów endogennych, które nie są istotne dla prowadzonych badań (zaleca się: 100 µM kwasu niflumowego lub DIDS (do blokowania kanałów Cl^- aktywowanych przez Ca²⁺), 10 mM TEA (do hamowania K⁺ kanałów zależnych od Ca²⁺ o dużym przewodnictwie), 10 nM iberiotoksyny (do blokowania K⁺ kanałów aktywowanych przez Ca²⁺), 10 µM nikardypiny (do blokowania Ca²⁺ kanałów typu N)).
3. Delikatnie wymieszać roztwór zawierający kłębki nerkowe, a następnie nanieść około 50 µl tego roztworu na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-ʟ-lizyną. Pozostawić kłębki do przytwierdzenia na około 5 min.
4. Przenieść szkiełka z kłębkami do komory patch-clamp uprzednio napełnionej roztworem kąpielowym; perfundować komorę z prędkością 3 ml/min przez 1 min, aby zapewnić usunięcie nieprzytwierdzonych kłębków.
5. Przeprowadzić konwencjonalny eksperyment patch-clamp w konfiguracji cell-attached⁷. Za pomocą szklanej pipety (oporność pipety 7 - 10 MΩ) utworzyć szczelne połączenie o wysokiej oporności (seal) między pipetą a błoną podocytu poprzez zastosowanie delikatnego ssania (pipetę przytwierdzoną do podocytu na powierzchni wyizolowanego kłębka przedstawiono na Rysunku 2, po lewej stronie).
6. Dla pomiarów w konfiguracji cell-attached zastosować filtr dolnoprzepustowy dla prądów przy 300 Hz za pomocą ośmiopolowego filtru Bessela.
7. Wyizolowane kłębki nerkowe można wykorzystywać w eksperymentach patch-clamp przez maksymalnie 4 - 6 h. Zapasową frakcję kłębków przechowywać w lodzie.

4. Ratiometryczne pomiary fluorescencyjne konfokalne wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w podocytach

1. Przenieś 500 µl frakcji kłębuszków (opisanej w punkcie 2.5) do stożkowej probówki o pojemności 0,5 ml i dodaj barwniki wapniowe Fura Red, AM oraz Fluo-4, AM. Użyj roztworów stokowych Fura Red, AM o stężeniu 2 mM i Fluo-4, AM o stężeniu 1 mM (przechowywać w -20 °C, rozpuszczone w DMSO), stosując 2,5 µl każdego barwnika na 500 µl frakcji kłębuszków. Natychmiast po dodaniu barwników owiń probówkę folią aluminiową.
2. Umieść probówki na wytrząsarce obrotowej na co najmniej 20 min, maksymalnie do 1 h w RT.
   Uwaga: Na tym etapie można dodać związki farmakologiczne.
3. Przygotuj szklane laminki, pokryj je poli-ʟ-lizyną i pozostaw do wyschnięcia na płycie grzewczej ustawionej na 70 °C.
4. Po zakończeniu obciążania barwnikami wapniowymi nanieś 100 µl roztworu zawierającego kłębuszki na pokryte poli-ʟ-lizyną laminki i pozostaw je na około 5 min, aby przylgnęły do powierzchni. Zamocuj laminki z przytwierdzonymi kłębuszkami w komorze obrazowania i przemyj roztworem kąpielowym (zawierającym (w mM): 145 NaCl, 2 CaCl₂, 4,5 KCl, 2 MgCl₂, 10 HEPES, pH 7,35) z przepływem 3 ml/min, aby usunąć nieprzylgnięte kłębuszki i pozostałe barwniki.
5. Ustaw konfokalny skaningowy mikroskop laserowy na długość fali wzbudzenia 488 nm oraz filtry emisyjne (odpowiednio 525/25 i 650/25 nm dla Fluo-4 i Fura Red). W oprogramowaniu do obrazowania ustaw pożądaną częstotliwość i rozdzielczość.
6. Zlokalizuj kłębuszki w świetle przechodzącym, a następnie włącz detekcję sygnału fluorescencji. Dostosuj intensywność lasera dla każdego barwnika, aby uniknąć nasycenia sygnału. Wybierz płaszczyznę ogniskową z podocytami, które przylegają bezpośrednio do szkła. Minimalizuje to efekt spowodowany skurczem kłębuszka w odpowiedzi na aplikację leku. Upewnij się, że wybrany kłębuszek jest dobrze przylegający do szkła.
7. Rozpocznij obrazowanie wybranej płaszczyzny ogniskowej (wykonuj obrazy 512 x 512 z częstotliwością ustawioną na 4 s, aby zwizualizować szybkie zmiany przejściowe Ca²⁺; użyj obiektywu 60X/NA 1,4 lub podobnego dla uzyskania obrazu o wysokiej rozdzielczości), podaj badane leki i zarejestruj odpowiedź.
   1. Wybierz pożądaną płaszczyznę ogniskową (jak najbliżej powierzchni szkła, aby zapewnić obrazowanie podocytów na powierzchni kłębuszka). Sprawdź intensywność fluorescencji w kanałach Fluo4 i FuraRed i upewnij się, że kłębuszek jest wyraźnie widoczny w świetle przechodzącym.
   2. Rozpocznij obrazowanie. Przed aplikacją jakichkolwiek leków zarejestruj co najmniej 1 min fluorescencji bazowej, aby upewnić się, że sygnał jest stabilny (brak nagłych skoków lub zanikania sygnału).
   3. Podaj odpowiednie leki za pomocą mikropipety; zachowaj ostrożność i upewnij się, że lek mógł się odpowiednio rozprzestrzenić i dotrzeć do kłębuszka. W razie potrzeby delikatnie wymieszaj roztwór kąpielowy, monitoruj wybraną płaszczyznę ogniskową i sprawdź, czy nie wyszła ona z ostrości w wyniku aplikacji leku.
   4. Zarejestruj zmiany intensywności fluorescencji dla sygnałów Fluo4 i FuraRed. Upewnij się, że rejestracja jest wystarczająco długa, czekając, aż sygnał osiągnie poziom plateau lub osiągnie szczyt, a następnie powróci do poziomu bazowego. W razie potrzeby wymień roztwór lub dodaj inne leki.
   5. Zatrzymaj rejestrację i zapisz plik w natywnym formacie oprogramowania.

5. Analiza obrazów dla pomiarów wapnia

1. Przeprowadź analizę obrazu przy użyciu otwartego oprogramowania ImageJ wyposażonego w wtyczkę ND Utility, która umożliwia importowanie obrazów w natywnym formacie ND2.
2. Zaimportuj sekwencję obrazów; pamiętaj o rozdzieleniu kanałów i zastosowaniu trybu skali szarości hyperstack.
3. W oprogramowaniu ImageJ przejdź ścieżką Analyze → Tools → ROI manager, aby otworzyć okno menedżera obszarów zainteresowania (ROI manager). Wybierz kilka obszarów zainteresowania (podocyty), korzystając z owalnego narzędzia zaznaczania oraz funkcji „Add (t)” w ROI Managerze. Jako ostatni ROI zaznacz obszar w tle; zapisz wybrane ROI (More → Save).
4. Zaznacz okno zawierające kanał wybrany do analizy. W ROI Managerze użyj funkcji More → Multi Measure, w wyskakującym oknie dialogowym zaznacz pole „one row per slice”, a następnie kliknij OK. Wyniki zostaną wyświetlone w formacie, który można skonfigurować w oknie Results: w opcji menu Results → Set Measurements zaznacz „Mean gray value” i oblicz wartości intensywności pikseli dla każdego ROI, które zostaną wyświetlone w oknie Results w oddzielnych kolumnach dla każdego ROI.
5. Skopiuj zmierzone wartości intensywności ROI dla każdego kanału (Fluo-4 i Fura Red) do preferowanego oprogramowania do analizy danych; od każdego punktu danych odejmij wartości intensywności tła.
6. Dla każdego punktu czasowego oblicz stosunek intensywności kanałów Fluo-4 do Fura Red. Przedstaw zmiany transientów Ca²⁺ w czasie na wykresie punktowym lub liniowym dla każdego ROI. Oblicz wartości Mean/SE dla wybranych kłębuszków.
   Uwaga: Kolumna czasu powinna być ustawiona zgodnie z częstotliwością obrazowania wybraną w punkcie 4.5.

6. Obliczenia wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia z wykorzystaniem sygnału fluorescencji Fluo-4

1. Pobrać próbkę kłębuszków i przeprowadzić protokół eksperymentalny do kroku 4.7. Po zarejestrowaniu fluorescencji tła dodać jonomycynę (stężenie końcowe w komorze kąpieli powinno wynosić 10 µM) do roztworu kąpieli i zarejestrować wzrost intensywności fluorescencji. Gdy intensywność osiągnie maksimum i rozpocznie się spadek, dodać MnCl₂ (stężenie końcowe powinno wynosić 5 mM), aby wygasić fluorescencję⁸.
2. Przeanalizować dane uzyskane w punkcie 6.1. Za pomocą preferowanego oprogramowania analitycznego skopiować wartości intensywności ROI sygnału Fluo-4 uzyskane zgodnie z protokołem opisanym w punktach 5.1 - 5.5.
3. Obliczyć wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia (w nM) w podocycie odpowiadającym ROI, korzystając ze wzoru:
   
   gdzie K_d to określona wcześniej stała dysocjacji dla Fluo-4 (345 nM), F to intensywność w punkcie czasowym, dla którego obliczane jest stężenie wapnia (linia bazowa), a F_min i F_max to odpowiednio wartości intensywności w punkcie maksymalnego obciążenia wapniem (po zastosowaniu jonomycyny) oraz po wygaszeniu fluorescencji (za pomocą MnCl₂) (patrz Rycina 3).

Wyniki

W niniejszej pracy zajęliśmy się problemem pomiaru gwałtownych zmian poziomu wapnia w podocytach. Rysunek 1 przedstawia schematyczny opis protokołu eksperymentalnego opracowanego w celu przeprowadzenia wysokorozdzielczego obrazowania konfokalnego fluorescencyjnego żywych komórek oraz rejestracji aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębków nerkowych gryzoni. W skrócie, po znieczuleniu szczura, nerki należy przepłukać roztworem PBS w celu usunięcia krwi. Następnie ner...

Dyskusja

Opisane tutaj podejście pozwala na analizę obchodzenia się z wapniem przez podocyty kłębuszków nerkowych gryzoni. Technika ta pozwala na zastosowanie jednokanałowej elektrofizjologii patch-clamp i fluorescencji ratiometrycznego obrazowania konfokalnego. Jednak oba podejścia mogą być stosowane oddzielnie, samodzielnie. Proponowany protokół składa się z kilku stosunkowo prostych kroków, w tym: 1) płukanie nerek; 2) izolacja kłębuszków nerkowych przez przesiewanie różnicowe; 3) wykonywanie eksperymentów elektrofizjologiczny...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluo4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl w DMSO
FuraRed AM	Life Technologies	F-3020
Poly-ʟ-lizyna	Sigma-Aldrich	P4707
Kwas pluronicowy	Sigma-Aldrich	F-68	roztwór
Ionomycyna	Sigma-Aldrich	I3909-1ML
Rotator do probówek	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753	Niemcy
Konfokalny mikroskop odwrócony Nikon	Nikon	Nikon A1R	Wzbudzanie laserowe 488 nm. Filtry emisyjne 500-550 nm oraz 570-620 nm
Obiektyw	Nikon	Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Szybko przykrywowe	Thermo Scientific	6661B52
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning		związek silikonowy
Oprogramowanie	Nikon	Nikon NIS-Elements
Komora rejestracyjna/perfuzyjna	Warner Instruments	RC-26
Wzmacniacz do patch-clampu	Molecular Devices	MultiClamp 700B
System akwizycji danych	Molecular Devices	Digidata 1440A	System Axon Digidata®
Filtr dolnoprzepustowy	Warner Instruments	LPF-8	8-biegunowy filtr Bessela
Kapilary borokrzemianowe	World Precision Instruments	1B150F-4
Wytwornica mikropipet	Sutter Instrument Co	P-97	Wytwornica mikropipet typu płomieniowego/Browna
Mikrokuźnia	Narishige	MF-830	Japonia
Zmotoryzowany mikromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-225
Mikroskop odwrócony	Nikon	Eclipse Ti
Stół izolujący mikrowibracje	TMC		wyposażony w klatkę Faradaya
Wielokanałowy system perfuzyjny z zaworami	AutoMake Scientific	Valve Bank II
Komora rejestracyjna/perfuzyjna	Warner Instruments	RC-26
Oprogramowanie	Molecular Devices	pClamp 10.2
Nikardypina	Sigma-Aldrich	N7510
Iberiotoksyna	Sigma	I5904-5UG
Kwas niflumowy	Sigma-Aldrich	N0630
DIDS	Sigma-Aldrich	D3514-25MG
Chlorek TEA	Tocris	T2265
RPMI 1640	Life Technologies	11835030	bez antybiotyków
BSA	Sigma-Aldrich	A8327	30% roztwór albuminy
Stół chirurgiczny z kontrolą temperatury	MCW core		dla gryzoni
Sita stalowe:			#100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200	Fisher Sci	50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270	Fisher Sci	50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400	Fisher Sci	50-871-320
Sito o oczkach 200	Sigma-Aldrich	s4145	ekran dla CD-1
Mikroskop binokularowy	Nikon	Eclipse TS100
Mikroskop binokularowy	Nikon	SMZ745
System perfuzyjny oparty na pompie strzykawkowej	Harvard Apparatus
Przewody polietylenowe	Sigma-Aldrich	PE50
Znieczulenie izofluranem	VetEquip, Inc.	911103
Inne podstawowe odczynniki	Sigma-Aldrich