Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52892

⸱

23 czerwca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Streszczenie

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są bardzo powszechne, stanowią istotną przyczynę zachorowalności i są coraz bardziej odporne na leczenie antybiotykami. Kobiety są nieproporcjonalnie częściej dotknięte ZUM: 50% wszystkich kobiet będzie miało ZUM w ciągu swojego życia. Ponadto 20-40% tych kobiet, które mają początkowe ZUM, będzie cierpieć na nawrót, przy czym niektóre będą cierpieć na częste nawroty z poważnym pogorszeniem jakości życia, bólem i dyskomfortem, zakłóceniami codziennych czynności, zwiększonymi kosztami opieki zdrowotnej i niewielkimi możliwościami leczenia innymi niż długoterminowa profilaktyka antybiotykowa. Uropatogenna Escherichia coli (UPEC) jest głównym czynnikiem wywołującym zakażenie układu moczowego nabytego przez społeczność. Zakażenie układu moczowego związanego z cewnikiem (CAUTI) jest najczęstszą infekcją szpitalną, która odpowiada za milion przypadków rocznie w USA i ogromne koszty opieki zdrowotnej. Podczas gdy UPEC jest również główną przyczyną CAUTI, inne czynniki sprawcze mają coraz większe znaczenie, w tym Enterococcus faecalis. Tutaj wykorzystujemy dwa dobrze znane modele mysie, które podsumowują wiele cech klinicznych tych chorób u ludzi. W przypadku ZUM model C3H/HeN podsumowuje wiele cech wirulencji UPEC obserwowanych u ludzi, w tym odpowiedzi gospodarza, tworzenie IBC i filamentację. W przypadku CAUTI wykazano, że model wykorzystujący myszy C57BL/6, które zachowują implanty pęcherza moczowego z cewnikiem, jest podatny na zakażenie pęcherza E. faecalis. Te reprezentatywne modele są wykorzystywane do uzyskania nowych, uderzających informacji na temat patogenezy choroby ZUM, co prowadzi do opracowania nowych metod leczenia i strategii leczenia lub profilaktyki.

Wprowadzenie

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są jednymi z najczęstszych infekcji bakteryjnych i można je podzielić na dwie kategorie w zależności od mechanizmu nabycia, ZUM nabyte w pobliżu i szpitalne. Pozaszpitalne ZUM często występują u zdrowych kobiet, a badania wykazały, że około 50% kobiet będzie miało co najmniej jedno ZUM w ciągu swojego życia 1. Dodatkowo poważnym problemem jest nawrót. Kobieta, u której wystąpiła początkowa ostra infekcja, ma 25-40% szans na drugą infekcję w ciągu sześciu miesięcy pomimo odpowiedniego leczenia antybiotykami, a wiele kobiet nadal ma częste nawroty 2. Bakterie, które powodują te infekcje, stają się również coraz bardziej odporne na antybiotyki, co dodatkowo zakłóca protokoły leczenia 3-6. Zakażenie układu moczowego dotyka miliony osób każdego roku, kosztując około 2,5 miliarda dolarów wydatków związanych z opieką zdrowotną w USA, co podkreśla wpływ i rozpowszechnienie choroby 1,7. Szpitalne nabyte ZUM są głównie związane z obecnością ciał obcych, takich jak cewniki na stałe. Zakażenia układu moczowego związane z cewnikiem (CAUTI) pozostają najczęstszymi szpitalnymi zakażeniami układu moczowego, stanowiąc ~70-80% takich zakażeń 8. Ponadto CAUTI wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością oraz jest najczęstszą przyczyną wtórnych zakażeń krwi 9.

23. W ten sposób nisza IBC pozwala na szybki wzrost bakterii w środowisku chronionym przed odpowiedziami immunologicznymi gospodarza i antybiotykami 25. Odrębne etapy infekcji UPEC, które obserwuje się u myszy, obserwuje się również u ludzi, takie jak IBC i filamentacja, co potwierdza mysi model ZUM jako korzystne narzędzie, które można wykorzystać do modelowania ZUM u ludzi 22,26-28.

Podczas gdy większość kobiet doświadcza ZUM w swoim życiu, wynik tych infekcji może wahać się od ostrej samoograniczającej się infekcji bez nawrotu, do częstego nawracającego zapalenia pęcherza moczowego. Co więcej, badania wykazały silne rodzinne występowanie ZUM, co sugeruje, że komponent genetyczny przyczynia się do podatności na ZUM 29. Odkryliśmy, że różne wyniki ZUM obserwowane w klinikach mogą być odzwierciedlone przez różne wyniki eksperymentalnego zakażenia UPEC wśród wsobnych szczepów myszy 30. Na przykład myszy C3H/HeN, CBA, DBA i C3H/HeOuJ są podatne, w sposób zakaźny zależny od dawki, na długotrwałe, przewlekłe zapalenie pęcherza moczowego charakteryzujące się utrzymującymi się bakteriami o wysokim mianie (>104 jednostki tworzące kolonie (CFU)/ml), obciążeniem pęcherza bakteryjnego o wysokim mianie w momencie uśmiercenia >4 tygodnie po zakażeniu (WPI), przewlekłym zapaleniem i martwicą dróg moczowych. Myszy te wykazują również podwyższone poziomy IL-6, G-CSF, KC i IL-5 w surowicy w ciągu pierwszych 24 hpi, które służą jako biomarkery rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego. Może to dokładnie odzwierciedlać naturalny przebieg ZUM u niektórych kobiet, ponieważ badania placebo wykazały, że duży odsetek kobiet doświadczających ZUM utrzymuje wysoki poziom bakterii w moczu przez kilka tygodni po wystąpieniu pierwszych objawów zapalenia pęcherza moczowego, jeśli nie zostanie podany antybiotykoterapię 31,32. Ponadto, używając myszy C3H/HeN, odkryliśmy, że przewlekłe zapalenie pęcherza moczowego w wywiadzie jest istotnym czynnikiem ryzyka kolejnych ciężkich, nawracających infekcji. Nawracające ZUM jest najbardziej znaczącym objawem klinicznym ZUM, a mysz C3H/HeN jest obecnie jedynym badanym modelem, który podsumowuje zwiększoną predyspozycję po wcześniejszej ekspozycji. Drugi wynik ZUM jest rekapitulowany u myszy C57Bl / 6, u których ostra infekcja UPEC ustępuje samoistnie, z ustąpieniem zapalenia pęcherza moczowego i bakteriurii w ciągu około tygodnia. Co ciekawe, w tym modelu UPEC łatwo tworzy spoczynkowe rezerwuary wewnątrzkomórkowe w tkance pęcherza moczowego, z których UPEC jest w stanie wyjść ze stanu uśpienia, aby ponownie zainicjować aktywne ZUM, potencjalnie wyjaśniając jeden mechanizm dla tego samego nawracającego szczepu ZUM u ludzi 33,34.

Oprócz genetycznych wpływów na podatność na ZUM, wprowadzenie cewnika do pęcherza znacznie zwiększa prawdopodobieństwo infekcji, jak również zwiększa zakres bakterii zdolnych do wywołania infekcji. Wykazano, że cewnikowanie moczu u człowieka powoduje zmiany histologiczne i immunologiczne w pęcherzu moczowym spowodowane obciążeniem mechanicznym, które powoduje silną reakcję zapalną, złuszczanie, obrzęk blaszki właściwej i podśluzówki, ścieńczenie dróg moczowych i uszkodzenie błony śluzowej nabłonka dróg moczowych i nerek 35,36. Dodatkowo cewnik zapewnia powierzchnię do przyczepiania się bakterii, tworząc w ten sposób środowisko wykorzystywane przez kilka gatunków do wywoływania CAUTI. Podczas gdy UPEC jest nadal głównym współtwórcą, Enterococcus faecalis odpowiada za 15% tych CAUTI 37. E. faecalis staje się coraz bardziej oporny na antybiotyki i pojawia się oporność na wankomycynę, co stanowi poważny problem zdrowotny 38. E. faecalis posiada liczne czynniki wirulencji, w tym toksyny i adhezyny niezbędne do przyczepienia się zarówno do cewnika, jak i nabłonka 38. Podczas cewnikowania moczu gospodarz jest podatny na adhezję, namnażanie i rozsiewanie drobnoustrojów w drogach moczowych 39,40. E. faecalis tworzy biofilm na cewniku jako część mechanizmu utrzymywania się w pęcherzu moczowym i rozprzestrzeniania się do nerek, który jest odtwarzany w mysim modelu CAUTI41. Ostatnio wykazano, że podczas cewnikowania moczu fibrynogen (Fg) jest uwalniany do pęcherza moczowego w ramach odpowiedzi zapalnej. Fg gromadzi się w pęcherzu moczowym, powleka cewnik i jest niezbędny do tworzenia biofilmu E. faecalis, działając jako rusztowanie przyczepowe. W mysim modelu CAUTI C57BL/6 odkryliśmy, że tworzenie biofilmu E. faecalis na cewniku, a tym samym utrzymywanie się w pęcherzu, było zależne od pilusa Ebp, a konkretnie od jego adhezyny końcówki EbpA. Odkryliśmy, że N-końcowa domena EbpA specyficznie wiąże się z Fg pokrywającym cewnik. Ponadto stwierdzono, że E. faecalis wykorzystuje Fg jako źródło metabolitu podczas infekcji, zwiększając w ten sposób tworzenie biofilmu 42.

Modele mysie okazały się kluczowe dla zrozumienia i przewidywania klinicznych objawów ZUM i CAUTI 41. W tym artykule pokazujemy, jak przygotować inokulum izolatu UPEC UTI89 do zapalenia pęcherza moczowego i inokulację przezcewkową myszy C3H/HeN. Dodatkowo demonstrujemy protokół wprowadzania cewnika u myszy C57BL/6 i inokulacji szczepu E. faecalis OG1RF. Obie te techniki prowadzą do spójnego i niezawodnego UTI lub CAUTI u myszy. Prezentujemy również techniki stosowane do obserwacji powstawania IBC podczas ostrego zapalenia pęcherza moczowego oraz zbierania moczu do analizy przewlekłego lub nawracającego zapalenia pęcherza moczowego. Myszy C3H/HeN wykorzystano do badania aspektów patogenezy UPEC, w tym początkowej inwazji bakterii, tworzenia IBC, filamentacji i rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego 23,33,43. Te parametry wirulencji badano również na wielu innych środowiskach myszy 22,33. W przypadku CAUTI model C57BL/6 pozwala na zagnieżdżenie się ciała obcego do pęcherza moczowego, a następnie kolonizację bakteryjną, która może utrzymywać się przez 7 dni po zakażeniu 41. Modele te okazały się przydatne do oceny mechanizmów wirulencji bakterii, odpowiedzi gospodarza na ZUM oraz mechanizmów obalania odpowiedzi gospodarza, z których wiele zostało następnie podsumowanych lub zaobserwowanych w klinicznych populacjach ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Waszyngtońskiego zatwierdził wszystkie infekcje i procedury myszy w ramach protokołu numer 20150226, który wygasa 12/10/2018. Ogólna opieka nad zwierzętami była zgodna z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opracowanym przez National Research Council oraz Przewodnikiem USDA Animal Care Resource Guide. Procedury eutanazji są zgodne z "Wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt wydanie 2013".

1. Protokół UPEC UTI, przygotowanie igły do inokulacji (Rysunek S1)

  1. Zdjąć osłonkę z igły 30 G. Nawlecz około 1 cala rurki PE10 na trzon igły. Promieniowanie UV sterylizuje zespoły igieł przez noc. Cewnikowane igły mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w sterylnych płytkach Petriego.

2. Preparat inokulum bakteryjnego UPEC

  1. Przygotowanie inokulum UTI89 (rozpocząć 72 godziny przed dniem szczepienia)
    1. Nałóż UTI89 na płytkę agarową LB (Luria-Bertani) z zamrożonego bulionu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Wybrać kolonię i zaszczepić ją w 10 ml LB w kolbie o pojemności 125 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, statycznie.
    2. Inokulować 10 μl nocnej kultury w 10 ml LB w nowej kolbie o pojemności 125 ml przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C, statycznie.
    3. Przenieś 3 ml (będzie się różnić w zależności od szczepu i pożądanej wielkości inokulum) do sterylnych probówek 1,5 ml i odwiruj przy 7 000 x g przez 3 minuty i ponownie zawieś osad w 1x PBS i odwiruj po raz drugi. Zawiesić osad bakteryjny w 1 ml 1x PBS.
  2. Zmierz gęstość optyczną bakterii i dostosuj stężenie do pożądanej gęstości inokulum. Standardowe stężenie użytego inokulum to 107 bakterii; Może się to jednak różnić ze względu na konstrukcję badania.

3. Inokulacja bakteryjna

  1. Wyczyść stację roboczą 70% etanolem i przykryj obszar chłonnym papierem (lub użyj sterylnego okapu przepływowego).
  2. Pobrać do 0,9 ml przygotowanego inokulum bakteryjnego do strzykawki o pojemności 1 ml (TB) (usunąć pęcherzyki powietrza). Przymocuj przygotowaną sterylną igłę do inokulacji z rurką PE10 do strzykawki zawierającej inokulum, a następnie sterylnie przyciąć rurkę polietylenową.
    UWAGA: Pozostaw 1 mm rurki nad końcówką igły, aby uniknąć przebicia pęcherza.
  3. Wytnij kwadratowy kawałek parafilmu o średnicy 1 cala i nałóż na wierzch odrobinę lubrykantu chirurgicznego (mniej więcej wielkości dziesięciocentówki).
  4. Znieczulenie samic myszy C3H/HeN poprzez umieszczenie ich w komorze parownika (zgodnie z protokołem producenta) do utraty przytomności, ale nadal normalnie oddychających (1 oddech/s).
    UWAGA: Niektóre komitety IACUC nie zgadzają się na używanie waporyzatora. Postępuj zgodnie ze wskazówkami komitetu IACUC swojej instytucji.
    UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym wziewnym. Stosować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i zminimalizować wdychanie.
  5. Wyjmij mysz z waporyzatora i połóż ją na plecach na ręczniku papierowym i rozłóż nóżki.
  6. Zakryj nos myszy stożkiem nosowym (rurka podłączona do waporyzatora, która zapewnia kontrolowaną dawkę izoflurancji, która jest wyposażona w niektóre waporyzatory), aby utrzymać znieczulenie.
  7. Delikatnie kołataj pęcherz, aby wywołać oddawanie moczu i upewnić się, że pęcherz jest opróżniony. Przetrzyj obszar okołocewkowy chusteczką 100% etanolu. Wklepać igłę/strzykawkę do zaszczepiania, skierowaną do przodu, w lubrykant chirurgiczny.
  8. Zaszczepić każdą mysz 50 μl roztworu bakterii, wprowadzając igłę do inokulacji przezcewkowo, około 12 mm i delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby delikatnie dozować inokulum do pęcherza moczowego (10 μl/s). Wyjąć igłę do zaszczepiania z myszy.
    UWAGA: Natychmiastowy powrót inokulum do ujścia cewki moczowej po rozpoczęciu inokulacji wskazuje na niewłaściwe lub niepełne wprowadzenie igły.
  9. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w klatce. Powtórz kroki 3.3-3.8 dla każdej myszy. Kiedy/jeśli zmieniasz warunki/szczepy inokulum, wyrzuć strzykawkę i igłę do zaszczepiania do zatwierdzonego pojemnika na ostre przedmioty i rozpocznij ponownie krok 3.2.
    UWAGA: Szczepienie organizmami urochotwórczymi na ogół nie powoduje silnych objawów bólowych. Jednak w rzadkich przypadkach podawanie dużych dawek patogenów może powodować gorączkę, zmniejszenie spożycia pokarmu i wody oraz nieprawidłowe zachowanie. Zdrowie zwierząt powinno być monitorowane przez cały czas trwania doświadczenia. W przypadku zauważenia jawnych objawów bólowych można zastosować lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg podawana podskórnie). Procedury powinny być zgodne z IACUC każdej instytucji.

4. Określanie obciążeń bakteryjnych

  1. Przygotować oddzielne probówki o pojemności 5 ml dla każdej pary pęcherza moczowego i nerki, która ma zostać pobrana. Dodaj 1ml 1x PBS / tubę / pęcherz myszy do pobrania. Dodać 0,8 ml 1x PBS/probówka/para nerek myszy do pobrania. Oznacz każdą rurkę tak, aby odpowiadała danej myszy. Przygotować 96-dołkową płytkę zawierającą 180 μl 1x PBS w każdym dołku do seryjnych rozcieńczeń w stosunku 1:10.
  2. Oczyść miejsce pracy 70% etanolem i przykryj je chłonnym pokrowcem lub ręcznikiem papierowym.
  3. Znieczulij mysz izofluranem (patrz krok 3.4), aż mysz przestanie oddychać na około 1 minutę, a następnie umieść ją na chłonnym pokrowcu lub ręczniku papierowym. Inne metody eutanazji są również akceptowane przez komitety IACUC, takie jak dwutlenek węgla, i mogą być zastąpione w przypadku przedawkowania izofluranu.
  4. Poświęć mysz przez szybkie zwichnięcie szyjki macicy, które polega na przytrzymaniu szyi u podstawy głowy i odciągnięciu ogona poziomo od ciała, aż do wystąpienia zwichnięcia.
    UWAGA: Większość komitetów IACUC wymaga dodatkowego środka eutanazji, a zwichnięcie szyjki macicy jest powszechną metodą. Można jednak zastosować inne metody, jeśli zostaną zatwierdzone przez komitet IACUC.
  5. Połóż martwą mysz na plecach i spryskaj brzuch 70% etanolem. Wypreparuj mysz, zbierz pęcherz moczowy i nerki, w tej kolejności, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie krwi po rozwarstwieniu nerki. Umieścić narządy niezależnie w przygotowanych probówkach o pojemności 5 ml zawierających 1 PBS (patrz krok 4.1).
    UWAGA: Używaj różnych nożyczek do sekcji zewnętrznej i do pobierania narządów, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
  6. Dotknij rurki, aby upewnić się, że narządy znajdują się w 1x PBS. Powtórz kroki 4.3-4.5 dla każdej myszy. Wyczyść nożyczki i kleszcze w 70% etanolu po każdej myszy.

5. Odbudowa bakteryjna

  1. Homogenizować pobrany pęcherz moczowy i nerki w probówkach o pojemności 5 ml za pomocą homogenizatora tkankowego, 15 sekund na nerkę i 30 sekund na pęcherz. Przepłukać homogenizator sekwencyjnie w 1x PBS, 70% etanolu i 1x PBS między próbkami.
  2. Wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:10 do 10-8 i umieść każde rozcieńczenie dla CFU (jednostek tworzących kolonie) na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie następnego dnia.

6. Wyliczenie IBC

  1. Aseptycznie wyjmij pęcherz i umieść go w 1x PBS na 6-dołkowej płytce z silikonowym dnem. Płytki można przygotować za pomocą zestawu elastomerów silikonowych i wlać około 1 cm silikonu do każdej studzienki, patrz instrukcja producenta. Przetnij pęcherz na pół za pomocą nożyczek.
  2. Za pomocą małych metalowych szpilek delikatnie rozchyl pęcherz tak, aby światło pęcherza było skierowane do góry. Pamiętaj, aby umieścić szpilki na najbardziej zewnętrznych krawędziach odcinków pęcherza, aby upewnić się, że maksymalna ilość nabłonka dróg moczowych jest odsłonięta.
  3. Po rozłożeniu delikatnie umyj pęcherz raz za pomocą 1x PBS. Usunąć 1x PBS za pomocą pipety. Napraw pęcherz, dodając tyle 3% paraformaldehydu, aby pokryć cały rozłożony pęcherz. UWAGA: Paraformaldehyd jest rakotwórczy. Przez cały czas należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym rękawice. Utylizacja powinna być zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć roztwór paraformaldehydu. Umyj raz 1x PBS.
  5. Umyć roztworem myjącym LacZ (2 mM MgCl2, 0,01% deoksycholanu sodu i 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) trzy razy przez 5 minut na pranie.
  6. Usunąć roztwór płuczący i dodać wystarczającą ilość barwnika LacZ (9,5 ml roztworu do płukania LacZ, 0,4 ml 25 mg/ml X-gal i 0,1 ml 100 mM K-żelazocyjanku/K-żelazocyjanku), aby pokryć pęcherze. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, chroniąc przed światłem.
  7. Wyjmij rozłożone pęcherze z inkubatora i obserwuj IBC, które wyglądają jak niebieskie puncta, jak pokazano za pomocą lunety sekcyjnej, powiększenie 40-60x.
    UWAGA: Czasami mysz może oddać mocz przed umieszczeniem rurki pod cewką moczową. W takim przypadku odczekaj 15-20 minut przed ponowną próbą zebrania moczu.

7. Zbieranie moczu w celu wyliczenia bakteriurii CFU (nie dotyczy CAUTI)

  1. Aby zebrać mocz przed lub po infekcji, delikatnie przytrzymuj mysz, trzymając ogon i umieszczając go na płaskiej, podwyższonej powierzchni (górnej części klatki dla myszy).
  2. Trzymaj sterylną probówkę o pojemności 1,5 ml pod cewką moczową myszy. Delikatnie naciśnij grzbiet myszy w pobliżu ogona, aby wywrzeć nacisk na pęcherz. Złap mocz do probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Wykonać seryjne rozcieńczenia w stosunku 1:10 do 10-7 i rozlać każde rozcieńczenie na odpowiednie LB. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie następnego dnia.

8. Protokół modelu CAUTI, przygotowanie igły cewnika do modelu CAUTI (rysunek S2)

  1. Zdjąć osłonkę z igły 30 G. Wytnij 7-milimetrowy kawałek rurki PE10 i 5-milimetrowy kawałek rurki silikonowej, takiej jak RenaSIL. Nawlecz igłę z rurką PE10, aż rurka dotknie podstawy igły.
  2. Następnie nałóż 5 mm kawałek na igłę zawierającą PE10. Sterylizuj UV zespoły igieł przez noc.
    UWAGA: Podczas ładowania rurki silikonowej pozostaw około 1 mm rurki wystającej poza końcówkę igły.

9. Preparat inokulum bakteryjnego E. faecalis OG1RF

  1. Przygotować inokulum OG1RF zaczynając 48 godzin przed dniem inokulacji. Nałóż OG1RF na płytkę BHI (napar z serca) z zamrożonego bulionu.
  2. Wybierz kolonię i zaszczep ją w 10 ml BHI i hoduj statycznie przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Odwirować kulturę i umyć osad (3 razy) w objętościach 1 ml sterylnego 1x PBS.
  3. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1x PBS. Zmierz gęstość optyczną bakterii i dostosuj stężenie do pożądanej wielkości inokulum. Standardowe stężenie użytego inokulum wynosi 107; Może się to jednak różnić ze względu na konstrukcję badania

10. Implantacja cewnika

  1. Wyczyść stanowisko pracy 70% etanolem i przykryj obszar chłonnym pokrowcem (lub użyj sterylnego kaptura przepływowego).
  2. Podłączyć igłę cewnika do pustej strzykawki o pojemności 1 ml (TB). Wytnij kwadratowy kawałek parafilmu o średnicy 1 cala i nałóż na wierzch odrobinę lubrykantu chirurgicznego (mniej więcej wielkości dziesięciocentówki).
    UWAGA: Dwie różne igły są używane do osadzania cewnika i do inokulum, aby zminimalizować przypadkowe inokulację z powodu manipulacji mechanicznej niezbędnej do implantacji cewnika. Pozwala to również na wygodę przygotowania mniejszej liczby igieł do zaszczepiania.
  3. Znieczulenie myszy C57BL / 6, umieszczając je w szklanym słoiku o pojemności 32 uncji zawierającym kulkę do zaparzania herbaty z wacikami nasączonymi 3 ml izofluranu lub komorą parownika (zgodnie z protokołem producenta), aż stracą przytomność, ale nadal będą normalnie oddychać (1 oddech / s).
  4. Następnie połóż mysz na plecach na ręczniku papierowym i rozłóż nogi. Przykryj nos myszy stożkiem nosowym lub stożkową rurką o pojemności 50 ml wacikami zawierającymi niewielką ilość (około 1-2 ml) izofluranu.
    UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym wziewnym. Używaj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i zminimalizuj wdychanie przez badacza.
  5. Delikatnie kołataj pęcherz, aby wywołać oddawanie moczu i upewnić się, że pęcherz jest opróżniony. Przetrzyj obszar okołocewkowy chusteczką 100% etanolu.
  6. Zdezynfekuj obszar okołocewkowy 10% roztworem jodu powidonu za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Wklepać igłę/strzykawkę do zaszczepiania, wskazując do przodu, w lubrykant chirurgiczny.
    UWAGA: Do implantacji cewnika stosuje się jod powidyny, który jest silniejszym roztworem aseptycznym niż alkohol. Implantacja cewnika wymaga większej manipulacji mechanicznej w celu wprowadzenia cewnika, a tym samym większego ryzyka zanieczyszczenia.
  7. Wprowadzić cewnik do otworu cewki moczowej. Po wejściu do środka użyj pęsety, aby popchnąć długi kawałek (7 mm PE10) w kierunku pęcherza, w konsekwencji popychając mały cewnik (silikon o średnicy 5 mm) i umieszczając go w pęcherzu. Natychmiast wyjmij igłę, trzymając rurkę 7 mm na swoim miejscu.

11. Inokulacja bakteryjna

  1. Postępuj zgodnie z protokołem inokulacji bakteryjnej w sekcji 3, używając przygotowanego inokulum z sekcji 9. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w klatce

12. W każdym momencie poświęcenia

  1. Przygotować probówki o pojemności 5 ml do pęcherza moczowego i nerek (w przypadku narządów należy postępować zgodnie z krokiem 4.1) oraz probówkę Eppendorfa o pojemności 1,5 ml do cewników. Dodać 1 ml 1x PBS do 1,5 ml probówki Eppendorf do próbek cewnika
  2. Wykonaj kroki od 4.3 do 4.5. Wypreparować mysz, pobierając pęcherz moczowy, nerki i cewnik, umieszczając tkanki niezależnie w probówkach o pojemności 5 ml zawierających 1x PBS, a cewnik w 1,5 ml Eppendorfa (patrz krok 12.1).
    UWAGA: Używaj różnych nożyczek do zewnętrznego rozwarstwiania oraz do pobierania narządów i pobierania cewnika, aby zminimalizować zanieczyszczenie
  3. Następnie wykonaj krok 4.6.

13. Odzyskiwanie bakterii

  1. W przypadku narządów wykonaj kroki 5.1 i 5.2. W celu odzyskania bakterii z cewników, wiruj z maksymalną prędkością przez 30 sekund, sonikuj próbki cewnika przez 5 minut za pomocą sonikatora do kąpieli, a następnie wiruj z maksymalną prędkością przez dodatkowe 30 sekund.
  2. Wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:10 do 10-8 i umieść każde rozcieńczenie do oznaczenia CFU na płytkach BHI. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie następnego dnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wewnątrz pęcherzykowe modele niepowikłanych oraz związanych z cewnikowaniem ZUM dostarczają elastycznych platform do wyjaśniania molekularnych mechanizmów patogenezy bakteryjnej, wpływu tych chorób na tkankę gospodarza oraz opracowywania i testowania nowych podejść do leczenia tych powszechnych i kosztownych infekcji. W zależności od szczepu myszy i patogenu, inokulacja wewnątrz pęcherzykowa może być wykorzystana do badania interakcji gospodarz-patogen w celu wyjaśnienia czynników niezbędnych do inicjacji lub modulowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nieskomplikowane zakażenie układu moczowego nabyte przez społeczność jest powszechną i kosztowną infekcją, która każdego roku powoduje kilka milionów wizyt w podstawowej opiece zdrowotnej 46. Ponadto CAUTI są powszechną infekcją nabytą w opiece zdrowotnej, która stała się niezwykle kosztowna dla świadczeniodawców, ponieważ Centra Usług Medicare i Medicaid nie zwracają już świadczeniodawcom dodatkowych kosztów leczenia wynikających z nabytego w szpitalu CAUTI 45. Mysie modele ZUM, zarówno niepowikłan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, oraz F32 DK 104516-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał do przygotowania cewnika i igły:
igły 30 GBD Precision Glide30510630 G x ½ (0,3 mm x 13 mm)
Rurka polietylenowa PE10BD427400Średnica wewnętrzna -0,011 cala (0,28 mm); średnica zewnętrzna – 0,024 cala (0,61 mm)
Rurki silikonowe utwardzane platyną RenaSIL 025Braintree Scientific, IncSIL 025średnica wewnętrzna-0,012 x średnica zewnętrzna 0,025, cewka
Materiał na infekcje:
Izoflouran – IsothesiaButler Schein29405250 ml
Przezroczysty szklany prosty słoikKimble Chase5413289V 21
Zaparzacz do herbaty ze stali nierdzewnejSchefs-AmazonPremium Luźny zaparzacz do herbaty liściastej firmy Schefs - Stal nierdzewna - Duża pojemność -
Niesterylne wacikiFisherbrand22-456-880
50 ml Probówki FalconVWR89039-660
Isotec 3 -waporyzatorOhmeda1224478
Dziurkacz do uszuFisher Scientific13-812-201(w razie potrzeby)
Roztwór betadynyRoztwór10% Povidie-jodowy roztwór do stosowania miejscowego
Q-tipsFisher Scientific22-037-9246 cali
Pieluchy na ławkęFisherbrand14206 63Podkłady chłonne (20" Wyświetlacz X36" maty)
Smar chirurgicznySurgilube0281-0205-36
Nożyczki preparacyjneNarzędzia do nauk ścisłych, INC14084-08
Kleszcze Micro-AdsonNarzędzia do nauk ścisłych, INC11018-12
Strzykawka 1 mlBD309659Końcówka tuberkulinowa
ParafilmBemisPM9964 cale x 125 FT
Stojak EppendorfFisherbrand05-541-1
Probówki EppendorfMIDSCIAVX-T-17-C
Pobieranie cewników, pęcherzy i nerek:
HomogenizatorPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
5 ml polipropylenowa rurka okrągłodennaBD352063do homogenizacji narządów
Ręcznik papierowyGeorgia-Pacific
EtanolPharmco-AAPER11100020S200 proof
Costar™ Przezroczyste płytki 96-dołkowe z polistyrenuCorning3788
1x sól sodowa fosforanowaSigma-AldrichP3813
Myjka ultradźwiękowa BRANSONIC 1210Branson Ultrasonics Corporation1210
Materiały IBC:
6-dołkowa płytka do badania kultur tkankowychProdukty z tworzyw sztucznych92006
SzpilkiNarzędzia do nauki26002-20
Sylgard 184Dow Corning3097358-1004Zestaw elastomerów silikonowych
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galaktozyd)Invitrogen15520-034Ultraczysty
N, N-dimetyloformamidSigma AldrichD4551
MgCl2 (chlorek magnezu)Sigma AldrichM8266
Deoksycholan soduSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Oktylofenolpoli(eter glikolu etylenowego)n
Trójwodny heksacyjanożelazian(II) potasu (K-żelazocyjanek)Sigma AldrichP3289
Heksacyjanożelazian(III) potasu (K-żelazocyjanek)Sigma Aldrich60299
25 ft Betadine

Bibliografia

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100(2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329(2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637(2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127(2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+(2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013(2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

Tagi

Zakażenie układu moczowegozakażenie układu moczowego związane z cewnikowanieminokulum bakteryjneinokulacja wewnątrz pęcherzawyliczanie CFUtworzenie się IBCpobieranie pęcherzaimplantacja cewnikauropatogenne E. coli
Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.