Metoda zadawania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową u Drosophila

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę zadawania zamkniętego urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u Drosophila. Metoda ta stanowi bramę do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw patologii TBI, przy użyciu szerokiej gamy narzędzi i technik eksperymentalnych dostępnych dla much.

Streszczenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) dotyka miliony ludzi każdego roku, powodując upośledzenie funkcji fizycznych, poznawczych i behawioralnych oraz śmierć. Badania z wykorzystaniem Drosophila przyczyniły się do ważnych przełomów w zrozumieniu procesów neurologicznych. W związku z tym, mając na celu zrozumienie komórkowych i molekularnych podstaw patologii TBI u ludzi, opracowaliśmy urządzenie High Impact Trauma (HIT) do wywoływania TBI z zamkniętą głową u muszek. Muchy poddane działaniu urządzenia HIT wykazują fenotypy zgodne z ludzkim TBI, takie jak tymczasowe ubezwłasnowolnienie i postępująca neurodegeneracja. Urządzenie HIT wykorzystuje mechanizm sprężynowy do popychania much na ściankę fiolki, powodując mechaniczne uszkodzenie mózgu muchy. Urządzenie jest niedrogie i łatwe w budowie, jego obsługa jest prosta i szybka, a do tego daje powtarzalne wyniki. W związku z tym urządzenie HIT można połączyć z istniejącymi narzędziami i technikami eksperymentalnymi dla much, aby odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące TBI, które mogą doprowadzić do opracowania diagnostyki i leczenia TBI. W szczególności urządzenie HIT może być wykorzystywane do wykonywania badań genetycznych na dużą skalę w celu zrozumienia genetycznych podstaw patologii TBI.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) definiuje się jako uszkodzenie mózgu spowodowane zewnętrzną siłą mechaniczną. Najczęściej TBI wynika z zamkniętych sił głowy, takich jak siły oraz bezwładnościowe siły przyspieszania i zwalniania, które powodują, że mózg uderza w wnętrze czaszki. Szacuje się, że w Stanach Zjednoczonych 50 000 osób umiera każdego roku z powodu TBI, a 2,5-6,5 miliona osób żyje z konsekwencjami TBI, w tym wyniszczającymi^problemami fizycznymi, poznawczymi i behawioralnymi. Konsekwencje TBI wynikają nie tylko z pierwotnych mechanicznych urazów mózgu, ale także z wtórnych urazów komórkowych i molekularnych mózgu, a także innych tkanek, które pojawiają się z czasem^3-5. Opracowanie metod diagnozowania i leczenia TBI okazało się trudne, ponieważ TBI jest złożonym procesem chorobowym. Zmienny charakter urazów pierwotnych, fizjologia człowieka i czynniki środowiskowe skutkują niejednorodnymi wtórnymi urazami i patologiami. Podstawowe czynniki zmienne obejmują ciężkość urazu pierwotnego, czas między powtarzającymi się urazami pierwotnymi oraz wiek i genotyp osoby. Zrozumienie, w jaki sposób każdy zmienny czynnik przyczynia się do konsekwencji TBI, może pomóc w opracowaniu podejść do diagnozowania i leczenia TBI^6,7.

Tutaj opisujemy metodę wywoływania TBI z zamkniętą głową u muszek owocowych Drosophila melanogaster, która może być wykorzystana do określenia udziału zmiennych czynników w konsekwencjach TBI. Metoda opiera się na wstępnej obserwacji, że intensywne uderzanie w bok fiolki z kulturą much o dłoń powodowało tymczasowe obezwładnienie much dzikich typów, co jest prawdopodobną konsekwencją TBI. W związku z tym skonstruowaliśmy urządzenie High-Impact Trauma (HIT), aby podsumować siły przyspieszania i zwalniania wynikające z uderzenia ręką. Szybki film pokazuje, że pojedyncze uderzenie urządzeniem HIT powoduje, że muchy kilkakrotnie stykają się ze ścianką fiolki głową i ciałem⁸. Do pewnego stopnia wszystkie kontakty mogą spowodować, że mózg muchy odbije się rykoszetem i odkształci się na torebce głowy, podobnie jak dzieje się to z ludźmi podczas^{upadków i} wypadków samochodowych. W związku z tym muchy leczone urządzeniem HIT wykazują fenotypy zgodne z uszkodzeniem mózgu, w tym tymczasowe ubezwłasnowolnienie, po którym następuje ataksja, stopniowe odzyskiwanie mobilności, zmiany ekspresji genów w głowie i postępująca neurodegeneracja^{w mózgu}. W ten sposób urządzenie HIT umożliwia badanie TBI przy użyciu ogromnego arsenału narzędzi i technik eksperymentalnych opracowanych dla much.

Protokół

1. Budowa urządzenia HIT

1. Przymocuj sprężynę do deski za pomocą dwóch zacisków i czterech (Rysunek 1A). Wyśrodkuj zaciski względem szerokości deski i dociśnij je do siebie zewnętrznym zaciskiem równo z krawędzią deski. Przed założeniem zacisków zegnij je za pomocą szczypiec, aby ściśle przylegały do sprężyny.
   UWAGA: Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z opisami materiałów wymaganych do budowy urządzenia HIT. Zaciśnięty koniec sprężyny powinien znajdować się 1/8 cala (3,2 mm) od krawędzi płytki, a wolny koniec powinien wystawać ponad płytę na 3/4 cala (19 mm). Wyreguluj sprężynę tak, aby leżała równolegle do długości deski.
2. Owiń wolny koniec sprężyny raz dookoła paskiem samoprzylepnym pętli na rzepy. Zewnętrzna krawędź rzepu powinna być zlicowana z końcem sprężyny. Rzep jest ważny, ponieważ służy do mocowania fiolki do sprężyny poprzez stworzenie szczelnego złącza zaciskowego. Rzep umożliwia również łatwe podłączanie i wyjmowanie fiolek, co pozwala na przetworzenie wielu fiolek w krótkim czasie.
3. Umieść pokrywę wiaderka na lód do góry nogami, wyśrodkowaną, mocno przylegającą do drewnianej deski. Ustaw podniesiony obszar pokrywy pojemnika na lód tak, aby długa krawędź była równoległa do szerokości deski. Zwróć uwagę, że podniesiony obszar wiaderka na lód jest o 1/2 cala (13 mm) wyższy niż drewniana deska, więc gdy fiolka jest przymocowana do sprężyny, sprężyna nie będzie leżeć płasko na desce.
4. Dosuń całe urządzenie do stałego przedmiotu, takiego jak ściana, tak aby pokrywa pojemnika na lód była zaklinowana między deską a przedmiotem i nie przesuwała się.
5. Przyklej kątomierz papieru do spodu tekturowej tacki na fiolki muchowe i ustaw go na krawędzi przy długości deski, tak aby znak 90° był wyrównany ze sprężyną, gdy zostanie pociągnięty z powrotem do idealnie pionowej pozycji.

2. Działanie urządzenia HIT

1. Umieścić od 1 do 60 much znieczulonych CO₂ w pustej fiolce i zakorkować fiolkę za pomocą ciasno przylegającego wacika.
2. Ogranicz muchy do dna 1 cala (2.5 cm) fiolki, wciskając wacik do fiolki, aż znajdzie się 1 cal (2.5 cm) od dna. Pomocne jest narysowanie linii na fiolce w miejscu oznaczenia 1 cala (2,5 cm). Należy pamiętać, że ograniczanie much do większych lub mniejszych obszarów fiolki może wpływać na nasilenie fenotypów.
3. Odczekaj 5 minut, aż muchy odzyskają mobilność z CO₂ . Należy zauważyć, że nie wiadomo, czy 5 minut jest wystarczające do całkowitego usunięcia skutków CO_{2 .}
4. Włożyć koniec sprężyny do fiolki tak długo, aż wewnętrzna krawędź rzepu zrówna się z górną częścią fiolki (Rysunek 1B). Gdy sprężyna leży płasko, 1 cal (2.5 cm) fiolki powinien zachodzić na podniesiony obszar pokrywy pojemnika na lód. Fiolki mogą być wielokrotnie używane.
5. Siedząc, trzymaj fiolkę w okolicy rzepów za pomocą kciuka i palca wskazującego lewej ręki. Przytrzymaj deskę mocno przy blacie prawej ręki. Alternatywnie użyj zacisków C, aby mocno przytrzymać deskę do blatu.
6. Pociągnij sprężynę idealnie prosto z powrotem pod żądanym kątem. Zwolnij sprężynę. Pozwól, aby wiosna całkowicie się zatrzymała.
7. Wyjąć fiolkę ze sprężyny i pozwolić muszkom zregenerować się przez ≥5 min. Poddać muchy kolejnemu uderzeniu lub przenieść muchy do fiolki z pokarmem dla much.
   UWAGA: Do oceny fenotypowych efektów uderzeń z urządzenia HIT można zastosować różne testy. Na przykład wpływ na długowieczność można określić, analizując procent much, które przeżywają czasami po urazie, wpływ na morfologię mózgu można określić za pomocą analizy histologicznej głowy, a wpływ na ekspresję genów można określić za pomocą analizy ilościowej poziomów mRNA¹⁰.
8. Określ efekty zabiegu, które nie są spowodowane braniami, identycznie traktując muchy kontrolne, które nie są poddawane ukłuciom. Nosić ochronniki słuchu, ponieważ uderzenie fiolki o pokrywę pojemnika na lód powoduje głośny dźwięk.

Wyniki

Dążymy do zrozumienia, dlaczego muchy giną w krótkim czasie po pierwotnym urazie. Aby ilościowo określić śmiertelność, wyznaczyliśmy wskaźnik śmiertelności po 24 h (MI₂₄), który stanowi procent much, które padły w ciągu 24 h od pierwotnego urazu. Muchy poddane uderzeniom za pomocą urządzenia HIT inkubowano w temperaturze 25 °C w probówce z pożywką dla much, a liczbę martwych osobników policzono po 24 h. Zastosowaliśmy to podejście, aby zidentyfikować czynniki wpływające na MI₂₄, i stwierdziliśmy, że...

Dyskusja

Metoda urządzenia HIT różni się od innych metod zadawania urazów u much tym, że powoduje ona zamknięcie głowy, a nie penetrację TBI¹¹. Co więcej, metoda urządzenia HIT wymaga mniej czasu, wysiłku i umiejętności, aby wywołać TBI u wielu much, więc metoda ta jest bardziej podatna niż inne metody na badania genetyczne na dużą skalę. Wreszcie fakt, że pierwotne urazy zadane przez urządzenie HIT nie ograniczają się do mózgu, jest zarówno ograniczeniem, jak i zaletą. Jest to ograniczenie, ponieważ wymagane są dodatk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ocynkowana sprężyna naciskowa	The Hillman  Grupa	540189	9 7/8 cala (długość, 2,2 cm), 15/16 cala (średnica zewnętrzna, 2,4 cm), 0,12 cala (rozmiar drutu, 0,3 cm)
Drewniana deska			9 cali (długość, 22,9 cm), 6,5 cala (szerokość, 16,5 cm), 0,75 cala (wysokość, 1,9 cm)
Zaciski	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3,10 cala (długość, 7,9 cm), 0,68 cala (szerokość, 1,7 cm), 1,11 cala (wysokość, 2,8 cm), paski z dwoma otworami EMT, kliknij typ dla 1 cala (2,5 cm) stalowego przewodu EMT
Pętla połowa samoprzylepnego rzepu			3 cale (długość, 7,6 cm), (3/4 cala szerokość, 1,9 cm)
Poliuretanowa osłona wiadra na lód	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 cala (długość, 23,2 cm), 9 1/8 cala (szerokość, 23,2 cm), 1 1/4 cala (wysokość, 3,2 cm)
Plastikowe fiolki na muchy	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 cala (wysokość, 9,4 cm), 1 1/16 cala (średnica wewnętrzna, 2,7 cm), 1 1/8 cala (średnica zewnętrzna, 2,9 cm)
Duże waciki	Fisher Scientific	22-456-883
Kątomierz			10 cali (średnica, 25,4 cm)

papierowy