Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52912

⸱

3 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Narażenie na niskie dawki promieniowania może powodować różne efekty biologiczne, które różnią się ilością i jakością od efektów wywoływanych przez wysokie dawki promieniowania. Rozwiązywanie problemów związanych z bezpieczeństwem środowiska, pracy i zdrowia publicznego w sposób właściwy i naukowo uzasadniony w dużym stopniu opiera się na zdolności do dokładnego pomiaru skutków biologicznych zanieczyszczeń w niskich dawkach, takich jak promieniowanie jonizujące i substancje chemiczne. Uszkodzenie i naprawa DNA są najważniejszymi wczesnymi wskaźnikami zagrożeń dla zdrowia ze względu na ich potencjalne długoterminowe konsekwencje, takie jak rak. W tym miejscu opisujemy protokół badania wpływu przewlekłej ekspozycji in vivo na niskie dawki promieniowania γ i β na uszkodzenie i naprawę DNA w komórkach śledziony myszy. Korzystając z powszechnie akceptowanego markera pęknięć dwuniciowych DNA, fosforylowanego histonu H2AX zwanego γH2AX, pokazujemy, w jaki sposób można go wykorzystać do oceny nie tylko poziomów uszkodzeń DNA, ale także zmian w zdolności naprawczej DNA potencjalnie wytwarzanej przez ekspozycję na niskie dawki in vivo. Cytometria przepływowa umożliwia szybki, dokładny i niezawodny pomiar znakowanego immunofluorescencyjnie γH2AX w dużej liczbie próbek. Naprawę pęknięć dwuniciowych DNA można ocenić, wystawiając wyekstrahowane splenocyty na działanie trudnej dawki 2 Gy w celu wytworzenia wystarczającej liczby pęknięć DNA do wywołania naprawy oraz mierząc indukowane (1 godzina po napromienianiu) i resztkowe uszkodzenia DNA (24 godziny po napromieniowaniu). Szczątkowe uszkodzenia DNA wskazywałyby na niepełną naprawę i ryzyko długotrwałej niestabilności genomu i raka. W połączeniu z innymi testami i punktami końcowymi, które można łatwo zmierzyć w takich badaniach in vivo (np. aberracje chromosomowe, częstość występowania mikrojąder w retikulocytach szpiku kostnego, ekspresja genów itp.), podejście to umożliwia dokładną i kontekstową ocenę biologicznych skutków stresorów niskiego poziomu.

Wprowadzenie

Znaczące kontrowersje dotyczące potencjalnych szkodliwych skutków niskich lub bardzo niskich dawek promieniowania jonizującego oraz strach społeczeństwa przed promieniowaniem, napędzany obrazami bombardowań atomowych Hiroszimy i Nagasaki oraz rzadkich wypadków w elektrowniach jądrowych (zaostrzonych przez środki masowego przekazu), doprowadziły do bardzo surowych przepisów i standardów ochrony przed promieniowaniem, które potencjalnie nie są naukowo uzasadnione. W ciągu ostatnich trzech dekad liczne doniesienia udokumentowały zarówno brak szkodliwych, jak i obecność potencjalnie korzystnych skutków biologicznych wywołanych niskimi dawkami promieniowania1-4. Głównym czynnikiem ryzyka dla zdrowia związanym z promieniowaniem jest prawdopodobieństwo zachorowania na raka, oszacowane na podstawie badań epidemiologicznych osób, które przeżyły wybuch bomby atomowej, otrzymując wysokie lub średnie dawki promieniowania. Liniowa ekstrapolacja tych danych (tzw. liniowy model bezprogowy lub model LNT) służy do oszacowania ryzyka zachorowania na raka przy niskich dawkach. Podejście to nie spotkało się jednak z ogólnoświatową akceptacją naukową i jest przedmiotem ożywionej debaty5 .

Oczywiste jest, że potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić tę kwestię i ewentualnie poprawić standardy ochrony przed promieniowaniem. Badania takie powinny obejmować przewlekłe leczenie (najlepsze przybliżenie narażenia środowiskowego i zawodowego), modele zwierzęce in vivo (najlepsze do ekstrapolacji skutków na człowieka) oraz takie punkty końcowe, jak wskaźniki uszkodzeń DNA, naprawa DNA i mutageneza. Wiadomo, że DNA jest głównym celem szkodliwych skutków promieniowania, a niekompletna lub błędna naprawa może prowadzić do mutagenezy i rozwoju raka6.

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są jednym z najbardziej szkodliwych typów uszkodzeń DNA i mogą prowadzić do śmierci komórki i nowotworzenia7. Dlatego ważne jest, aby móc wiarygodnie i dokładnie zmierzyć poziom DSB po ekspozycji na niskie dawki promieniowania i/lub inne czynniki stresogenne, takie jak zanieczyszczenia chemiczne. Jednym z najbardziej czułych i specyficznych markerów DNA DSB jest fosforylowany histon H2AX, zwany γH2AX8, ale sugerowano inne markery i metody9,10. Szacuje się, że tysiące cząsteczek H2AX, znajdujących się w pobliżu indukowanego DSB, bierze udział w tworzeniu γH2AX, umożliwiając wykrycie pojedynczego DSB poprzez znakowanie immunofluorescencyjne przeciwciałem anty-γH2AX i mikroskopię fluorescencyjną11. Reakcja jest bardzo szybka, osiągając maksimum między 30 a 60 minutami. Istnieją dowody na to, że γH2AX ułatwia naprawę DNA DSB poprzez przyciąganie innych czynników naprawczych do miejsc pęknięć i modyfikację struktury chromatyny w celu zakotwiczenia uszkodzonych końców DNA i zapewnienia dostępu dla innych białek naprawczych (przegląd w 12). Po zakończeniu naprawy DNA DSB, γH2AX ulega defosforylacji i/lub degradacji, a nowo zsyntetyzowane cząsteczki H2AX zastępują γH2AX w dotkniętych obszarach chromatyny10. Monitorowanie powstawania i utraty γH2AX może zatem zapewnić dokładne oszacowanie kinetyki naprawy DNA DSB. Podejście to zostało wykorzystane do zbadania naprawy DSB w różnych ludzkich liniach komórek nowotworowych napromieniowanych wysokimi dawkami promieniowania, a jego szybkość i resztkowe poziomy DSB wykazały, że korelują z wrażliwością na promieniowanie13-15.

Zmodyfikowaliśmy to eksperymentalne podejście i zastosowaliśmy je do badania in vivo na myszach, aby zbadać wpływ niskich dawek przewlekłego napromieniania γ i β na poziom i naprawę DNA DSB (Rysunek 1). Po pierwsze, demonstrujemy metodę długotrwałego przewlekłego narażenia myszy na promieniowanie β emitowane przez tryt (wodór-3) w postaci trytu (HTO) lub w postaci organicznie związanego trytu (OBT) rozpuszczonego w wodzie pitnej. Oczekuje się, że te dwie formy będą się inaczej kumulować i/lub rozprowadzać w organizmie, a zatem wywołują różne efekty biologiczne. Obie formy stanowią potencjalne zagrożenie w przemyśle jądrowym. Leczenie to odbywa się równolegle z przewlekłym narażeniem na promieniowanie γ o równoważnej dawce, aby umożliwić prawidłowe porównanie dwóch rodzajów promieniowania, co ma kluczowe znaczenie dla oceny ich względnej skuteczności biologicznej. Promieniowanie beta składa się z elektronów, co bardzo różni je od promieniowania γ, fotonów o wysokiej energii. Ze względu na tę różnicę, promieniowanie Β stanowi głównie wewnętrzne zagrożenie dla zdrowia i może wywoływać inne skutki biologiczne w porównaniu z promieniowaniem γ. Powikłanie to spowodowało poważne kontrowersje dotyczące regulacji narażenia na promieniowanie β emitowane przez HTO. W związku z tym poziomy regulacyjne HTO w wodzie pitnej dla ludności wahają się od 100 Bq/L w Europie do 75 000 Bq/L w Australii. Dlatego ważne jest, aby porównać biologiczne skutki HTO z równoważnymi dawkami promieniowania γ. Po drugie, szybkość DNA DSB mierzy się w izolowanych splenocytach po zakończeniu przewlekłej ekspozycji przy użyciu immunofluorescencyjnie znakowanego γH2AX wykrytego za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala to na ocenę stopnia uszkodzeń DNA spowodowanych ekspozycją in vivo. Rozsądne jest jednak oczekiwanie, że tak niskie poziomy ekspozycji mogą nie powodować żadnych wykrywalnych wskaźników DNA DSB; zamiast tego można spodziewać się pewnych ukrytych zmian/odpowiedzi, które wpłynęłyby na zdolność komórek do naprawy uszkodzeń DNA. Zmiany te, jeśli zostaną znalezione, mogą być stymulujące (wywołujące korzystny efekt) lub hamujące (wywołujące szkodliwy efekt). Proponowany protokół pozwala na ujawnienie takich zmian poprzez poddanie ekstrahowanych splenocytów wysokiej dawce promieniowania, która powoduje znaczne uszkodzenia (np. 2 Gy wytwarzający około 50 DSB DNA na komórkę lub 3 - 5-krotny wzrost całkowitego poziomu γH2AX). Następnie powstawanie i utrata γH2AX, odzwierciedlające rozpoczęcie i zakończenie naprawy DSB, jest monitorowane za pomocą cytometrii przepływowej. W ten sposób można zmierzyć nie tylko podstawowe i indukowane leczeniem poziomy DNA DSB, ale także jego potencjalny wpływ na zdolność komórek do reagowania i naprawy uszkodzeń DNA wywołanych znacznie wyższymi poziomami stresorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury obchodzenia się z myszami i leczenia myszy powinny być zgodne z zasadami określonymi przez ustawodawcę i/lub programami opieki nad zwierzętami i zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami. Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami za zgodą lokalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami.

UWAGA: Wszystkie prace związane z radioaktywnością (w tym między innymi obchodzenie się z trytem, zewnętrznym napromieniowaniem γ, obchodzenie się z radioaktywnymi tkankami zwierzęcymi, odpadami ściółkowymi) powinny być zgodne z zasadami określonymi przez ustawodawcę i/lub organy ochrony przed promieniowaniem i powinny być wykonywane przez upoważniony personel w certyfikowanym laboratorium i/lub obiekcie.

1. Praca ze zwierzętami

  1. Grupowanie zwierząt
    1. Jeśli myszy przybywają z organizacji zewnętrznej, aklimatyzuj zwierzęta przez co najmniej 10 dni w obiekcie dla zwierząt. Jeśli badanie obejmuje wiele grup leczenia, należy upewnić się, że dostawca zwierząt może wysłać wszystkie zwierzęta jako jedną partię.
    2. Losowo przydziel myszy do grup leczonych po 10 myszy w grupie. W przypadku korzystania z samców myszy szczepu C57BL/6, poproś dostawcę zwierząt o wstępne zorganizowanie randomizacji bardzo młodych samców C57BL/6 w swoim obiekcie, aby złagodzić problemy z agresją.
  2. Przewlekłe narażenie myszy na wewnętrzne promieniowanie β
    1. Przygotować robocze stężenia trytu (10 kBq/L i 1 MBq/L) w wodzie pitnej dla myszy, rozcieńczając pierwotny zapas roztworów HTO i OBT (mieszanina tritytowanych aminokwasów proliny, alaniny i glicyny).
    2. Zatwierdzić końcowe stężenia trytu w wodzie pitnej, mierząc radioaktywność za pomocą płynnego licznika scyntylacyjnego. W razie potrzeby dostosować stężenia.
    3. Leczyć zwierzęta przez jeden miesiąc, zapewniając dostęp ad libitum do wody trytowej. Jeśli woda uzdatniająca spadnie w ciągu dwóch tygodni, dodaj więcej wody. W przeciwnym razie zmień butelki po dwóch tygodniach.
    4. Myszy kontrolne napromieniowane pozorowanym należy traktować identycznie. Przechowuj je w oddzielnym "czystym" pomieszczeniu lub na oddzielnym "czystym" stojaku pod dodatnim ciśnieniem powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego trytu z powietrza.
  3. Przewlekłe narażenie myszy na zewnętrzne promieniowanie γ
    Uwaga: Obiekt/sprzęt do napromieniania γ będzie się różnić w zależności od lokalizacji.
  4. Korzystając z dostępnych metod dozymetrii, należy określić odległości od źródła promieniowania γ, w którym pola promieniowania wytwarzają pożądane dawki dawki. Zapewnić jednorodność pól promieniowania w obszarach pokrywających klatki dla zwierząt.
    Uwaga: 1,7 μGy/h jest równoważne wielkości dawki wytwarzanej przez 1 MBq/L trytu w organizmie.
  5. Wystaw myszy, umieszczając klatki na myszy w odległościach określonych w kroku 1.3.1 na jeden miesiąc. Zminimalizuj codzienną przerwę w napromienianiu γ do 30 minut. Użyj dozymetrów termoluminescencyjnych do pomiaru całkowitych wchłoniętych dawek.

2. Ofiary i pobieranie próbek

  1. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne, szalki Petriego o średnicy 60 mm z włożonymi sitkami do komórek o średnicy 70 mikronów, probówki o pojemności 15 ml i 1,5 ml, pożywkę RPMI uzupełnioną 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i umieść wszystko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zapewnienie sterylności pracy jest kluczowe.
  2. Dozować 5 ml pożywki RPMI do każdej szalki Petriego o średnicy 60 mm.
  3. Składaj w ofierze myszy przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalny komitet opieki nad zwierzętami. Zwichnięcie szyjki macicy jest dobrym wyborem do pracy splenocytów opisanej w tym protokole. Jeśli jednak wymagane są próbki krwi do innych testów (np. dla mFISH, mikrojądra bloku cytochalazyny lub innych powszechnych testów genotoksyczności), należy zastosować nakłucie dosercowe po znieczuleniu izofluranem.
  4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej, z głową skierowaną od siebie. Spryskaj mysz 70% etanolem. Za pomocą kleszczy chwyć skórę z przodu do ujścia cewki moczowej i wykonaj małe nacięcie nożyczkami w okolicy krocza.
    1. Od tego nacięcia przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej do jamy klatki piersiowej, uważając, aby przeciąć tylko skórę, a nie ścianę mięśniową pod spodem. Odetnij skórę od linii środkowej.
    2. Chwyć ścianę brzucha kleszczami i przetnij wzdłuż środkowej osi ściany mięśniowej, aby otworzyć jamę brzuszną.
  5. Wytnij śledzionę, lekko chwytając ją sterylnymi kleszczami i delikatnie ciągnąc, jednocześnie odcinając tkankę łączną nożyczkami.
  6. Wytnij mały kawałek śledziony (około 1/10 śledziony) i umieść w probówce o pojemności 1,5 ml. Szybkie zamrażanie w ciekłym azocie w celu późniejszego przechowywania w temperaturze -80 °C do badań uzupełniających.
  7. Umieść pozostałą część śledziony w sitku do komórek wewnątrz szalki Petriego o średnicy 60 mm z 5 ml wstępnie dozowanej pożywki RPMI.
  8. Przejdź do następnego mouse.
    Uwaga: Wyekstrahowane śledziony można przechowywać w 60-milimetrowych szalkach z pożywką (do 2 godzin), podczas gdy reszta myszy jest składana w ofierze. W zależności od liczby osób biorących udział w badaniu, w ciągu jednego dnia można przetworzyć od 5 do 15 myszy.

3. Przygotowanie kultur splenocytów

  1. Homogenizuj śledzionę, mieląc w sitku komórkowym za pomocą sterylnych kleszczy z zakrzywionym końcem.
  2. Wyjąć sitko do komórek i zebrać przefiltrowaną zawiesinę komórek z naczynia o średnicy 60 mm do probówki o pojemności 15 ml.
  3. Przepłukać sitko komórkowe 5 ml pożywki, aby zebrać pozostałe komórki.
  4. Probówki wirować o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml RPMI.
  6. Probówki wirować o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml RPMI.
  8. Przenieść 4 ml zawiesiny komórkowej do kolby do hodowli tkankowej o pojemności 25 ml i przenieść do inkubatora z użyciem CO2 (37 °C, 5% CO2 , wilgotność 80 %)

4. Trudne napromieniowanie i naprawa

  1. Przenieść pozostały 1 ml zawiesiny komórkowej z etapu 3.8 do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Uszkodzenie DNA mierzone w tej próbce będzie reprezentować zarówno uszkodzenie wywołane leczeniem, jak i punkt danych t = 0 dla budowy krzywej naprawy DNA.
  2. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie zawiesić osad w 1 ml buforu TBS (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
  3. Probówki wirujące o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać supernatant za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie zawiesić granulat w 300 μl TBS.
  4. Mieszając na wirze z małą prędkością, dodać 700 μl 100% etanolu o temperaturze -20 °C. Zamknij pokrywkę i odwróć kilka razy, aby wymieszać.
  5. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Splenocyty utrwalone w etanolu można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 12 miesięcy bez zauważalnej utraty sygnału γH2AX.
  6. Napromienić kultury splenocytów z kroku 3.8 trudną dawką promieniowania γ 2 Gy przy dawce ≥ 200 mGy/min przy użyciu dostępnego urządzenia do napromieniania.
    Uwaga: Celem tego napromieniowania jest skłonienie DNA DSB do rzucenia wyzwania maszynerii naprawczej. W tym celu można również wykorzystać promieniowanie rentgenowskie.
  7. Natychmiast zwróć kultury do inkubatora CO2 .
  8. Po upływie 1 godziny od wymagającego napromieniania 2 Gy należy przenieść kultury z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. W celu pobrania reprezentatywnej porcji próbki, należy delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipetora i przenieść 1 ml zawiesiny komórek do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie. Umieścić hodowle komórkowe w inkubatorze CO2 .
  9. Probówki wirujące o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać supernatant za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie zawiesić osad w 1 ml TBS.
  10. Powtórz kroki 4.3 - 4.5.
  11. 24 godziny po wymagającym napromieniowaniu γ 2 Gy należy zebrać i utrwalić próbkę t = 24 godziny, jak opisano w krokach 4.8 – 4.10.

5. Znakowanie immunofluorescencyjne przeciwciałem anty-γH2AX

Uwaga: Zazwyczaj, 15 - 30 próbek dziennie może być immunofluorescencyjnie znakowanych i testowanych metodą cytometrii przepływowej w jednym przebiegu. Aby zapewnić dokładne porównanie między grupami leczonymi, należy uwzględnić próbkę (próbki) z każdej grupy. Więcej informacji można znaleźć w odnośniku 16.

  1. Przygotować oznakowany zestaw probówek na liczbę próbek, które mają być przetworzone, i umieścić na lodzie. Użyj szklanych rurek bez nakrętki 12 x 75 mm. Sterylność nie jest wymagana do tej pracy. Dołączyć jedną dodatkową historyczną próbkę kontrolną do znakowania tylko przeciwciałami drugorzędowymi ("tylko 2nd Ab"). Użyj tej historycznej próbki kontrolnej w każdym przebiegu cytometrii przepływowej w ramach badania.
  2. Dodaj 0,5 ml lodowatego TBS do każdej probówki.
  3. Usunąć utrwalone splenocyty z temperatury -20 °C, wirować przez 5 sekund i przenieść 0,5 ml porcji do przygotowanych probówek z TBS. Pozostałe próbki umieścić z powrotem w temperaturze -20 °C i przechowywać jako próbkę zapasową.
  4. Odwirować splenocyty przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1 ml lodowatego TBS zawierającego 1% FBS
  5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1 ml buforu TST (0,05% Triton X-100, 2% FBS w TBS). Inkubować przez 20 minut na lodzie.
  6. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 200 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty-γH2AX rozcieńczonego w stosunku 1:150 w buforze TST. Użyj 200 μl TST dla próbki kontrolnej "tylko 2nd Ab".
  7. Ustawić rurki na obracającej się wytrząsarce pod kątem 45 - 60° i wytrząsać przez 1,5 godziny przy 300 x g przy temperaturze pokojowej.
  8. Podczas inkubacji probówek przygotuj wystarczającą objętość (200 μl / próbkę) koziego przeciwciała wtórnego przeciwko mysi sprzężonego z Alexa-488 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze TST.
    Uwaga: Wszystkie prace z udziałem sprzężonego przeciwciała Alexa-488 (kroki od 5.10 do 5.16 poniżej) powinny być wykonywane w warunkach słabego oświetlenia, a oznakowane próbki należy chronić przed światłem poprzez owinięcie probówek folią aluminiową.
  9. Po zakończeniu 1,5-godzinnej inkubacji dodać 1 ml lodowatego TBS zawierającego 2% FBS do każdej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1 ml TBS zawierającym 2% FBS.
  10. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 200 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego z kroku 5.8.
  11. Inkubować próbki na platformie wstrząsającej przez 1 godzinę, jak w kroku 5.7.
  12. Dodaj 1 ml lodowatego TBS zawierającego 1% FBS.
  13. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1 ml lodowatego TBS.
  14. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad w 0,5 ml TBS zawierającym 50 μg/ml jodku propidyny.
  15. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  16. Analizuj próbki na cytometrze przepływowym przy użyciu protokołów specyficznych dla przyrządu16. Odczytaj co najmniej 10 000 komórek na próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia przykłady wykresów z cytometrii przepływowej oczekiwanych dla splenocytów przygotowanych zgodnie z opisaną tutaj metodą. Komórki są najpierw bramkowane na podstawie wykresu rozproszenia (Rysunek 2A i 2D; objętość elektroniczna jest równoważna rozproszeniu przedniemu). Histogramy FL3/jodek propidyny (Rysunek 2B i 2E) potwierdzają prawidłowy rozkład cyklu komórkowego. Średni sygn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół przedstawiony w tej pracy jest przydatny do prowadzenia na dużą skalę badań in vivo na myszach, analizujących genotoksyczne skutki niskich poziomów różnych czynników chemicznych i fizycznych, w tym promieniowania jonizującego. Nasz unikalny, specyficzny obiekt dla zwierząt wolny od patogenów, wyposażony w promiennik GammaBeam 150 i halę napromieniania o długości 30 metrów, pozwala na prowadzenie badań przez całe życie obejmujących napromieniowanie o niskiej lub bardzo niskiej dawce na setkach, a nawet t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są znane żadne konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować naszym kolegom Sandrine Roch-Lefevre i Ericowi Gregoire'owi z Instytutu Radioochrony i Bezpieczeństwa Nuklearnego (Paryż, Francja). Prace te były wspierane przez program Rządu Kanady ds. Nauki i Technologii w Kanadyjskich Laboratoriach Jądrowych (Chalk River, Ontario, Kanada), CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Kanada), Kanadyjską Komisję Bezpieczeństwa Jądrowego oraz przez Instytut Ochrony Radiologicznej i Bezpieczeństwa Jądrowego (Paryż, Francja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HTO: woda trytykowana, [3H]lokalnie pozyskiwana z reaktora jądrowego aktywność zapasów 3,7 GBq/mL;  można zastąpić HTO z Perkin Elmer
OBT: Alanina, L-[3-3H]: organicznie związany tryt (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Glicyna, [2-3H]: organicznie związany trytPerkin ElmerNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Prolina, L-[2,3-3H]: organicznie związany tryt (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
wody trytytowanej, [3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCsubstytut HTO pochodzenia lokalnego   
Promiennik GammaBeam 150firmy Atomic Energy of Canada Limitedprodukowany lokalnie, może być zastąpiony innym źródłem promieniowania g o wystarczająco niskiej aktywności 
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMIFisher ScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 z L-glutaminą i HEPES 500 ml
płodowej surowicy bydlęcejSigma AldrichF1051-100ML
anty-gH2AX, klon JBW301Millipore05-636
Alexa fluor-488 kozie przeciwciało przeciw mysimLife Technologies (dawniej Invitrogen)A21121
jod propidynowySigma AldrichP4864-10ML1 mg / ml
etanoluAlkohole handloweP006-EAANButelki 500 ml Etanol absolutny
1,5 ml probówkiFisher Scientific2682550 mikrowirówki
15 mlFisher Scientific05-539-5sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe
ciekły azotLindeP110403
12 x 75 mm niezaślepione szklane rurkiFisher ScientificK60B1496126jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowego z gładkim końcem
Kolby T25VWRCA15708-120nunc tisue culture 25ml (nr dostawcy 156340)
nożyczkiFine Science Tools14068-12Nożyczki Wagner 12 cm ostre/ostre
, prosteFine Science Tools11008-13Kleszcze Semken 13 cm, kleszcze proste
, zakrzywioneFine Science Tools11003-12Kleszcze wąskowzórkowe 12 cm, zakrzywione
60 mm szalki PetriegoVWRCA25382-100BD Falcon 60 x 15 mm
sitka do komórek, 70 mmFisher Scientific08-771-2Sitka do komórek Falcon 50 sztuk w opakowaniu
Przepis PBS: 1 tabletkę rozpuszczoną w 200 ml wody dejonizowanej, w razie potrzeby dostosować pH do 7,4.Sigma AldrichP4417-100TABTabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami
TBS przepis: do przygotowania 10x bulion
30 g TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGChlorowodorek Trizma
88 g NaClFisher ScientificS271-500Chlorek sodu
2 g KClFisher ScientificP217-500Chlorek potasu
Rozpuść w 1 l wody dejonizowanej, dostosuj pH do 7,4
, przeciwciało

Bibliografia

  1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
  2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
  3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
  4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
  5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
  6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
  7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
  10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
  12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
  13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
  14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
  15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
  16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
  17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
  18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
  19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
  20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
  21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
  22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Naprawa uszkodzeń DNAcytometria przepływowagamma H2AXniskie dawki promieniowaniapęknięcia dwunicioweekspozycja na promieniowanieznakowanie immunofluorescencyjneizolacja komórek
Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.