Artykuł metodologiczny

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

DOI:

10.3791/52935

⸱

21 października 2015

 ,  ,  , 
1Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój struktur twarzoczaszki kręgowców wymaga precyzyjnej koordynacji migracji komórek, proliferacji, adhezji i różnicowania. Modelowanie chrząstki Meckla, pierwszej pochodnej łuku gardłowego, obejmuje migrację komórek grzebienia nerwowego czaszki (CNC) oraz postępujące dzielenie, proliferację i organizację zróżnicowanych chondrocytów. Kilka badań opisało migrację CNC podczas morfogenezy żuchwy, ale szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób chondrocyty osiągają organizację we wzroście i wydłużaniu chrząstki Meckla, pozostają niejasne. Ograniczona sox10 i chemicznie indukowana rekombinacja za pośrednictwem rekombinazy Cre generuje permutacje różnych białek fluorescencyjnych (RFP, YFP i CFP), tworząc w ten sposób wielospektralne znakowanie komórek progenitorowych i ich potomstwa, odzwierciedlając odrębne populacje klonów. Korzystając z konfokalnej fotografii poklatkowej, można zaobserwować zachowanie chondrocytów podczas rozwoju chrząstki Meckla danio pręgowanego.

Wielospektralne znakowanie komórek umożliwia naukowcom zademonstrowanie rozszerzenia chondrocytów Meckla. Podczas fazy wydłużania chrząstki Meckla, która poprzedza żuchwę, chondrocyty interkalują, aby uzyskać rozszerzenie, gdy układają się w zorganizowany rząd warstw jednokomórkowych. Niepowodzenie tego zorganizowanego procesu interkalacji w pośredniczeniu w wydłużaniu komórki dostarcza mechanistycznego wyjaśnienia hipoplastycznej żuchwy, które obserwujemy w wadach rozwojowych żuchwy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój twarzoczaszki wymaga złożonych interakcji molekularnych, komórkowych i tkankowych, które napędzają proliferację, migrację i różnicowanie komórek1,2,3. Ten ściśle regulowany i złożony proces podlega perturbacjom genetycznym i środowiskowym, tak że deformacje twarzoczaszki należą do najczęstszych wad wrodzonych1-9. Podczas gdy interwencje chirurgiczne pozostają podstawą leczenia anomalii twarzoczaszki, zrozumienie podstaw rozwoju jest niezbędne do wprowadzania innowacji w przyszłych terapiach. W związku z tym badanie morfogenezy i mechanizmów konwergencji i wydłużania oraz integracji komórek dostarcza nowych informacji na temat powstawania szkieletu twarzoczaszki1.

Grzebień nerwowy czaszki migruje i wypełnia pierwszy łuk gardłowy, a następnie tworzy parzyste wyrostki żuchwowe, które rozciągają się, tworząc chrząstkę Meckla, która zapowiada żuchwę. Morfogeneza chrząstki Meckla wymaga organizacji chondrocytów poprzez kierunkową proliferację, polaryzację i różnicowanie komórek1,10. Jednak zawiłość organizacji chondrocytów we wzroście i wydłużaniu chrząstki Meckla pozostaje niejasna. Zrozumienie dynamicznego zachowania komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wrodzonych wad rozwojowych wpływających na rozmiar żuchwy, takich jak hipoplastyczne fenotypy żuchwy11.

Zarodki danio pręgowanego oferują wiele korzyści rozwojowych i genetycznych do szczegółowego badania morfogenezy chrząstki Meckela. Ich podatność genetyczna, przezroczystość, ex vivo i szybki rozwój są potężnymi zaletami, które dobrze nadają się do obserwacji ruchu i organizacji komórek za pomocą obrazowania na żywo6. Korzystając z narzędzi do śledzenia linii, takich jak linia transgeniczna sox10:kaede, my i inni określiliśmy pochodzenie grzebienia nerwowego embrionalnego szkieletu twarzoczaszki1,5. Korzystając z sox10:ERT2-Cre z linią transgeniczną ubi:Zebrabow-M, możliwe jest teraz badanie szczegółów ruchów komórkowych podczas rozwoju twarzoczaszki. Zebrabow-M to transgeniczna linia zaprojektowana z promotorem ubikwityny napędzającym ekspresję różnych fluoroforów, z których każdy jest otoczony miejscami Lox8. Domyślny fluorofor Zebrabow-M to czerwony, wyrażający RFP. Po indukcji ekspresji Cre konstrukt Zebrabow-M ulega rekombinacji, a komórki wyrażają kombinację różnych fluoroforów (RFP, CFP i YFP), tworząc wielospektralną ekspresję w zarodku. Wszystkie komórki potomne, które dzielą się z oznakowanych komórek po zdarzeniu rekombinacji, są następnie znakowane klonalnie, tak że populacje komórek, które pochodzą z różnych zestawionych komórek progenitorowych, są znakowane klonalnie. Poprzez to znakowanie komórek klonowania można śledzić proliferację i migrację komórek z rozdzielczością klonalną (ryc. 1 i 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zatwierdził wszystkie procedury zgodnie z protokołem numer #2010N000106. Jest to zgodne z wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC).

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

  1. Przygotować 1 l pożywki dla zarodków 50X E3 (patrz Tabela 1) i przygotować 1 l pożywki dla zarodków 1X E3 (patrz Tabela 2).
  2. Przygotować pożywkę zarodkową E3 z N-fenylotiomocznikiem (PTU), dodając 30 mg PTU do 1 l 1X E3. Wymieszaj O/N, aby upewnić się, że PTU całkowicie się rozpuścił. Sklep w RT.
  3. Aby przygotować roztwór pronazy, rozcieńczyć 150 μl pronazy (0,5 mg/ml) w 15 ml 1X E3. Ta ilość wystarcza na 1 szalkę Petriego. Zużyć natychmiast.
  4. Przygotować roztwór metylocelulozy.
    1. Przygotować roztwór E3-tricaine, mieszając 75 ml 0,2% tricainy z 25 ml 1X E3. Zagotować 3 g metylocelulozy w 75 ml roztworu E3-trikainy.
    2. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml roztworem E3-trikainy. Końcowy roztwór metylocelulozy jest lepki i nieprzezroczysty z żółtawym odcieniem. Przechowywanie: RT chronione przed światłem.
  5. Roztwór podstawowy i indukcyjny tamoksyfenu
    1. Przygotować 5 mM roztwór podstawowy tamoksyfenu, rozpuszczając 4-hydroksytamoksyfen w 100% etanolu. Przechowywać zapasy w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotować świeże rozcieńczenie tamoksyfenu o pożądanym stężeniu w 1X E3 w celu otrzymania roztworu indukcyjnego. OSTROŻNOŚĆ! Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki.
  6. Przygotować 1 l 0,2% tricainy zgodnie z tabelą 3.
  7. Uzyskaj szkiełka konfokalne. Sklej ze sobą cztery szkła nakrywkowe (18 x 18), aby utworzyć blok, a następnie umieść 2 bloki na szkle nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 w odległości 2 cm od siebie, aby umożliwić zamontowanie zarodka na środku.

2. Przygotowanie zarodków

  1. Linie transgeniczne.
    UWAGA: Zebrabow-M był hojnym prezentem od laboratorium Alexa Scheera.
  2. sox10: ERT2-Cre
    UWAGA: Wygeneruj wektor celowniczy pDestTol2-sox10:ERT2-Cre przy użyciu standardowych metod klonowania molekularnego i komercyjnie uzyskanej technologii klonowania rekombinacyjnego.
    1. Połącz klon wejściowy 5' (pENTR5'-sox10p) zawierający 7,2 Kb promotora sox10, środkowy klon bramki (pME-ERT2-Cre) i klon wejściowy 3' (pENTR3'-polyA) w reakcji LR z wektorem docelowym soczewki pDestTol2-α-krystalina:YFP.
    2. Oczyść konstrukcję pDestTol2-sox10:ERT2-Cre. Jednocześnie wstrzyknąć oczyszczony konstrukt (100 ng / μl) z mRNA transpozazy Tol2 (50 ng / μl) do zarodków WT (F0) na etapie jednej komórki.
    3. Badanie przesiewowe dorosłych założycieli F0 pod kątem transmisji w linii zarodkowej na podstawie silnej żółtej fluorescencji w zarodkach F1.
  3. sox10: ERT2-Cre; Zebrałuk-M
    1. Przeciąć linię Zebrabow-M (2.1.1) z linią transgeniczną sox10:ERT2-Cre.
    2. Wybierz zarodki wykazujące silną wszechobecną ekspresję RFP i marker soczewki YFP i hoduj je aż do osiągnięcia dorosłości.

3. Pobieranie zarodków

  1. Ustaw kilka par sox10:ERT2-Cre; Transgeniczny danio pręgowany Zebrabow-M między 17:00 a 18:00 w dniu 1.
  2. Następnego dnia pociągnij za przegrody rano i zbierz jajka około południa.
  3. Przenieś je na szalki Petriego i dodaj 15 ml roztworu pronazy w celu dechorionacji zarodków.
  4. Inkubuj zarodki przez 1 do 5 minut, aż około 60% zarodków zostanie zdechorionowanych. Zatrzymaj reakcję poprzez dekantację roztworu pronazy i umyj zarodki 3-4 razy świeżą pożywką E3.
  5. Inkubuj zdekorionowane zarodki w E3 w temperaturze RT O/N i pozwól im się rozwinąć, aby osiągnąć stadium 10 somitów. Wysiaduj 50-60 zarodków na lęg, aby uniknąć różnego wzrostu rozwojowego.

4. Leczenie

  1. Sprawdź stadium rozwoju zarodków pod mikroskopem w polu świetlnym, aby upewnić się, że są na etapie 10 somitów.
  2. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem białka czerwonej fluorescencji (RFP) wyizoluj jaskrawoczerwone zarodki.
  3. Przystąpić do indukcji rekombinacji Cre, dodając 10 μM roztworu hydroksytamoksyfenu do szalki Petriego i inkubując wyizolowane zarodki w temperaturze 28,5 °C przez 3 godziny.
  4. Zdekantować roztwór tamoksyfenu i kilkakrotnie przemyć zarodki E3,
    OSTROŻNOŚĆ! Wyrzucić roztwór tamoksyfenu do specjalnego pojemnika na odpady biologiczne.
  5. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C O/N.
  6. Gdy zarodki osiągną około stadium 28-29 somitów (około 24 godziny po zapłodnieniu), inkubuj zarodki w temperaturze 28,5 °C w roztworze E3-PTU.
    UWAGA: PTU jest tutaj stosowany w celu zahamowania powstawania melanoforów w rozwijających się zarodkach. Zabieg ten jest konieczny, aby uniknąć zniekształcenia sygnału fluorescencji przez autofluorescencyjne melanofory.
  7. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C

5. Selekcja zarodków

  1. Aby uwidocznić w pełni rozwinięte struktury twarzoczaszki, wybierz zarodki po 4 dniach od zapłodnienia pod kątem intensywności pozytywnego sygnału czerwonego i markera ekspresji Cre (żółty w siatkówce).
  2. Znieczulić zarodki roztworem E3/0,015% tricainy. Znieczulenie potwierdza się, gdy podczas delikatnego szturchania zarodka nie obserwuje się żadnych aktywnych ruchów ani aktywności płetwy.

6. Montaż zarodka w metylocelulozie

  1. Przenieś wybrany zarodek do obrazowania na szalkę Petriego zawierającą kroplę metylocelulozy i delikatnie zabalsamuj zarodek metylocelulozą.
  2. Na czystym szkiełku konfokalnym umieść kroplę świeżej metylocelulozy i zamontuj zarodek w kropli za pomocą końcówki do mikroładowania. Ułóż zarodek grzbietowo, uważając, aby nie dotykać zarodka bezpośrednio.
  3. Przykryj zamontowany zarodek szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 25 x 25 i w razie potrzeby dostosuj położenie zarodka, manipulując szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.

7. Analiza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Użyj obiektywu z suchą soczewką 20x (apertura numeryczna 0,75; rozmiar otworu 2,0 μm) do ustawiania ostrości zarodka.
  2. Naciśnij przycisk L100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu.
  3. Wybierz przycisk konfiguracji konfokalnej i kliknij "auto" i wybierz następujące kanały przed zamknięciem okna: Ch1: CFP, Ch2: GFP, Ch3: RFP lub mCherry
  4. Włącz Ch2 i Ch3 przed kliknięciem przycisku "usuń blokadę". Kliknij "odtwórz", aby rozpocząć skanowanie.
  5. Skoncentruj się na interesującej nas strukturze, co najlepiej zrobić, zaczynając od 1/2 klatki/s i wysokiego napięcia (HV) 150, a następnie odpowiednio dostosowując ustawienia, aż do uzyskania pożądanej jakości obrazu. Zapytanie ofertowe byłoby jaśniejsze niż inne kolory, dlatego dostosuj HV. Zmień położenie Z, aby znaleźć zarówno dodatnie komórki YFP, jak i RFP.
  6. Po ustawieniu ustawień uchwyć obraz swojego zarodka. Zapisz swoje zdjęcie w formacie oprogramowania do obrazowania konfokalnego i formacie TIFF w celu przetwarzania obrazu w każdym podzielonym kanale.
  7. Następnie, w przypadku obrazowania CFP, wyłącz Ch2 i Ch3 i włącz Ch1. Dostosuj ponownie ustawienia, jak w kroku 5, bez zmiany obszaru ostrości.
    UWAGA: CFP może być naprawdę trudny do wykrycia ze względu na sygnał tła w niebieskim kanale, który można obejść, dostosowując rozmiar otworka. Większy rozmiar otworka pozwala na lepsze wykrywanie fluorescencji poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu tła. Jednak większy otwór zmniejszy efekt konfokalny, pogarszając jakość obrazu. Dlatego konieczne jest staranne dostosowanie ustawień, aby osiągnąć pożądaną jakość i intensywność obrazu.
  8. Przechwyć obraz i zapisz go w obu formatach (oprogramowanie konfokalne i TIFF) w celu przetworzenia obrazu. Obrazy mogą być następnie przetwarzane za pomocą popularnego oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu scalenia warstw i poprawy ustawień kolorów, zgodnie z opisem Pan i współpracowników 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjna wizualizacja chrząstki za pomocą całych niebieskich plam Alcian była nieoceniona w obserwacji rozwijającej się chrząstki Meckla i powszechnie używana do wizualizacji końcowej organizacji komórkowej12 (Rysunek 1A). Aby dalej analizować rozwijające się chondrocyty w miarę upływu czasu, śledzenie linii za pomocą linii transgenicznych sox10: Kaede umożliwiło nam zbadanie migracji, konwergencji i wydłużenia komórek w żywych zarodkach2,12 (Figura 1B). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alcian blue i fotokonwertowalne linie transgeniczne, jak opisano powyżej, uzupełniają się nawzajem, aby zdefiniować skomplikowany proces rozwoju chrząstki i kości. Jednak żywa migracja i organizacja komórek podczas organogenezy od dawna była hipotezą i pośrednio wykazywaną, ale nigdy nie wizualizowano. Linia transgeniczna Zebrabow-M w połączeniu z specyficznym dla chrząstki Cre pozwala na jednoczesną obserwację na żywo wszystkich tych odrębnych zdarzeń związanych z tworzeniem kości i chrząstek. Technika ta pozwala na bad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Alexowi Schierowi za uprzejme udostępnienie linii transgenicznej Zebrabow-M, Geoffreyowi Burnsowi za wektor pDEST i Renee Ethier-Daigle za doskonałą opiekę nad obiektem i liniami rybnymi.

Finansowania:

Jesteśmy wdzięczni za hojne wsparcie finansowe ze strony NIDCR RO3DE024490 i Shriners Hospitals for Children (E.C.L.) oraz stypendia podoktorskie ze Szpitali Dziecięcych Shriners (L.R. i Y.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PronaseRoche Life Sciences10165921001Prepare 500 μ l podwielokrotności zapasów przy 50 mg/ml
MetylocelulozaSigma-AldrichM0262
PTU (N-fenylotiomocznik)Sigma-AldrichP7619
TrikainaSigma-AldrichE10521
4-HydoxyTamoxifenSigma-AldrichT176
24 x 60 szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-540A
25 x 25 szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA Technologieklonowania Life K591-20
Zestaw do klonowania pENTR/D-TOPO Life TechnologiesK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTPrezent od Geoffrey Burns
labs Mikroskop jasnego pola 
Mikroskop fluorescencyjny 
Mikroskop
Oprogramowanie do
konfokalny przetwarzania obrazu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
  3. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  4. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
  5. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525(2013).
  6. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
  7. Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
  8. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  9. Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
  10. Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726(2014).
  11. Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
  12. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
  13. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zebrabow Clonal AnalysisChondrocyte IntercalationMeckel s CartilageConfocal Time LapseSOX10 ERT2 CreTamoxifen InductionCranial Neural CrestMultispectral LabelingClonal Cell AnalysisZebrafish Embryos

Powiązane artykuły