Artykuł metodologiczny

Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

DOI:

10.3791/52949

⸱

27 sierpnia 2015

 ,  , 
1Department of Cell & Developmental Biology, SUNY Upstate Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele komórek ssaków preferencyjnie migruje w kierunku bardziej sztywnej matrycy lub substratu poprzez durotaksję. Celem tego protokołu jest dostarczenie prostego systemu in vitro, który może być używany do badania i manipulowania zachowaniami durotaksji komórek poprzez włączenie substratów polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej sztywności, łączących się ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skład i właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej są bardzo zróżnicowane w zależności od typu tkanki. Ta różnorodność zrębu tkanki łącznej ma ogromny wpływ na zachowanie komórek w celu regulacji normalnych i patologicznych procesów, w tym proliferacji komórek, różnicowania, sygnalizacji adhezji i migracji kierunkowej. W związku z tym wrodzona zdolność niektórych typów komórek do migracji w kierunku sztywniejszego lub mniej podatnego substratu macierzy jest określana jako durotaksja. Zjawisko to odgrywa ważną rolę podczas rozwoju embrionalnego, gojenia się ran i inwazji komórek rakowych. W tym miejscu opisujemy prosty test do badania durotaksji, in vitro, przy użyciu substratów polidimetylosiloksanu (PDMS). Przygotowanie opisanych komór durotaxji tworzy sztywną powierzchnię styku między stosunkowo miękkim żelem PDMS a szkiełkiem nakrywkowym ze szkiełka nakrywkowego. W podanym przykładzie użyliśmy tych komór dęciaka dwubiegunowego, aby zademonstrować rolę białka aktywującego GTPazę cdc42 / Rac1, cdGAP, w mechanowykrywaniu i regulacji dęcia dwuosiowego w ludzkich komórkach kostniakomięsaka U2OS. Test ten można łatwo dostosować do innych typów komórek i/lub knockdown innych białek będących przedmiotem zainteresowania w celu zbadania ich ról w mechanosygnalizacji i durotaksji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) składa się ze złożonego zestawu białek strukturalnych i sieciujących, w tym kolagenu, fibronektyny i lamininy. Chociaż powszechnie wiadomo, że ECM zapewnia ważne wsparcie strukturalne dla tkanek komórkowych, istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że komórki aktywnie reagują na zmiany fizyczne w środowisku ECM, regulując różne procesy komórkowe, w tym przeżycie komórek, różnicowanie i migrację komórek. Na przykład różnice w sztywności ECM mogą kierować mezenchymalne komórki macierzyste w kierunku różnych linii, przy czym miękkie podłoża (~1 kPa) promują linie neurogenne, podczas gdy sztywne (~25 kPa) substraty sprzyjają różnicowaniu osteogennemu1. Podobnie wykazano, że wzrost sztywności macierzy zrębu sprzyja nowotworzeniu komórek nabłonka sutka i inwazji do otaczającej tkanki2,3.

Szczególnie interesujący aspekt tej mechanosygnalizacji skutkuje procesem znanym jako durotaksja, w którym komórki migrują preferencyjnie w kierunku bardziej sztywnego substratu4,5. Komórki stale wyczuwają fizyczne cechy swojego środowiska zewnątrzkomórkowego poprzez wiązanie receptora integryny z ECM. To z kolei sprzyja akumulacji licznych białek strukturalnych i sygnałowych do ich domen cytoplazmatycznych w celu napędzania tworzenia struktur adhezyjnych znanych jako zrosty ogniskowe lub kontakty ogniskowe6,7. Ponieważ integryny nie mają wrodzonej aktywności enzymatycznej, sygnały są przekazywane z ECM przez te białka pomocnicze, aby koordynować odpowiedź komórki na zmieniające się środowisko8. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka kluczowych białek zaangażowanych w regulację mechanosygnalizacji i durotaksji jest ważnym obszarem badań.

Do badania durotaxji in vitro opracowano różne systemy modelowe, ale większość z nich wykorzystywała podłoża poliakrylamidowe pokryte kolagenem4. Jednak przygotowanie substratów poliakrylamidowych może być trudne technicznie, a kolagen stosowany w tych testach musi być chemicznie usieciowany z substratem9. Wykazano, że substraty polidimetylosiloksanu (PDMS) wykazują porównywalne właściwości mechaniczne do substratów poliakryloamidowych10. Jednak substraty PDMS są przygotowywane po prostu przez zmieszanie stosunku zasady do środka sieciującego, a substraty te mogą być pokryte białkami ECM bez potrzeby chemicznego sieciowania, dzięki czemu PDMS jest łatwiejszym narzędziem do badania wpływu sztywności na zachowanie komórki. W tym artykule opisujemy, jak przygotować prostą komorę durotaxis, w której miękkie podłoże PDMS jest zintegrowane ze szkiełkiem nakrywkowym ze szkiełka nakrywkowego.

Opisany poniżej test zapewnia szybką i prostą metodę badania durotaksji. W tym badaniu wykorzystaliśmy ludzkie komórki kostniakomięsaka U2OS w połączeniu z nokautacją cdGAP za pośrednictwem siRNA, aby zbadać rolę tego ogniskowego białka adhezyjnego w durotaxsji11. Co ważne, protokół ten może być łatwo dostosowany do indywidualnych wymagań. Inne typy komórek mogą być podstawione w miejsce komórek U2OS, a każde białko może zostać powalone lub nadmiernie eksprymowane w celu określenia wpływu na zachowanie komórek podczas durotaksji. Co więcej, protokół ten może zostać dostosowany do włączenia białek znakowanych fluorescencyjnie w celu analizy ich dynamiki i zachowania przy użyciu podejść FRAP lub FRET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komór Durotaxis

  1. Aby przygotować jedną 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, wytaruj wagę za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odważyć około 10 g roztworu podstawowego PDMS w probówce o pojemności 50 ml (roztwór jest dość lepki).
  2. W przypadku podłoża 90:1 (zgodność ~1 kPa) należy podzielić zmierzoną masę roztworu zasadowego PDMS w probówce przez 90, aby określić odpowiednią ilość potrzebnego roztworu sieciującego. Dodaj obliczoną ilość roztworu sieciującego PDMS do tej samej probówki.
    Przykład: 10 g / 90 = 0,11 g. Dodaj 0,11 g roztworu sieciującego PDMS do roztworu podstawowego PDMS.
    UWAGA: Rozwiązania bazowe i sieciujące są dostępne w zestawie PDMS.
  3. Energicznie mieszaj mieszaninę zasady PDMS i środka sieciującego przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą małej szpatułki. Na tym etapie mieszanina będzie zawierać dużą liczbę pęcherzyków powietrza.
  4. Odwirować substrat PDMS w wirówce stołowej przez 5 minut przy 50 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków. Jeśli po upływie 5 minut nadal pozostają bąbelki, ponownie odwirować.
  5. Odpipetować 1 ml substratu PDMS w proporcji 90:1 do każdego dołka na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza obecne w PDMS można wyeliminować na tym etapie, przebijając je za pomocą igły 21 G. Pozwól PDMS rozprzestrzeniać się przez 30 minut w studzience.
  6. Gotuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w wodzie destylowanej przez 5 minut. Powtórz dwa razy i przechowuj szkiełka nakrywkowe w wodzie destylowanej.
  7. Umieść po jednym, wysuszonym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku płytki do hodowli tkankowej, delikatnie dotykając jednej strony szkiełka nakrywkowego do roztworu PDMS, a następnie upuść szkiełko nakrywkowe na PDMS. Gdy szkiełko nakrywkowe osiada, PDMS zacznie wchodzić w krawędzie szkiełka nakrywkowego, ale nie pokryje go całkowicie. Spowoduje to wygenerowanie interfejsu między PDMS a szkłem po utwardzeniu (patrz rysunek 1A,B).
  8. Inkubować płytkę w temperaturze 70 °C w piecu przez 16 godzin w celu utwardzenia (utwardzenia) PDMS. Umieść płytkę w kapturze do hodowli komórkowej i sterylizuj UV przez 10 min.
    UWAGA: Najlepiej jest wykonać płytki w ciągu kilku dni od użycia. Płyty mogą być jednak zawijane w Parafilm bez żadnego bufora i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni bez zauważalnego spadku jakości.

2. Poszycie komórek

UWAGA: Jeśli badasz efekt knockdownu za pośrednictwem siRNA, wykonaj knockdown, korzystając z instrukcji producenta lub zoptymalizowanego protokołu dla wybranego typu komórki.

  1. Każdą komorę dwunastnicy należy pokryć 1 ml fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w PBS bez wapnia i magnezu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Alternatywnie, fibronektynę można zastosować dzień przed analizą, inkubując PDMS z 10 μg/ml fibronektyny w PBS przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że cała powierzchnia jest zanurzona w roztworze fibronektyny w PBS.
  2. Przygotować denaturowany 1% BSA. Odważyć 0,5 g masy ciała i rozpuścić ją w 50 ml PBS. Przefiltrować, wysterylizować roztwór przez filtr 0,22 μm i podgrzewać w temperaturze 80 °C przez 12 minut.
    Uwaga: Roztwór należy przygotować dzień przed posiewem komórek i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Odessać roztwór fibronektyny i przemyć 3 razy PBS. Dodać 1 ml denaturowanego termicznie BSA w PBS do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze suchej masy.
  4. Trypsynizuj i policz wybrane komórki, podczas gdy komory durotaxis blokują się za pomocą denaturowanego ciepła BSA.
  5. Płytkę 1 x 105 komórek w objętości 2 ml do każdego dołka komory durotaxis, używając pożywki wymaganej dla danego typu komórek. Pozostawić komórki do przylegania i rozprowadzić na podłożu przez 4 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Komórki U2OS są rutynowo utrzymywane w DMEM z 10% FBS, uzupełnionymi 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianem sodu i 10 I.U./ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny.
    UWAGA: Numer komórki użyty w tym przykładzie jest zoptymalizowany pod kątem komórek U2OS. Może być wymagana optymalizacja pod kątem innych typów komórek. Ta gęstość daje komórkom wystarczająco dużo miejsca do migracji bez znaczących interakcji z innymi komórkami.

3. Obrazowanie żywych komórek

  1. Wykonaj obrazowanie żywych komórek pod mikroskopem odwróconym, używając kontrastu fazowego z obiektywem 10X. Mikroskop powinien być wyposażony w zamkniętą, wilgotną komorę środowiskową, umożliwiającą kontrolę temperatury na poziomie 37 °C i 5% CO2 podczas długotrwałego obrazowania.
  2. Po rozproszeniu komórek przez około 3,5 godziny zmontuj płytkę w komorze mikroskopu. Pozostawić próbkę (próbki) do zrównoważenia w komorze przez 30 minut.
  3. Skonfiguruj zautomatyzowane, wielopunktowe wizyty na mikroskopie, jeśli są dostępne. Skoncentruj się na interfejsie między PDMS 90:1 a szklanym szkiełkiem nakrywkowym i wybierz punkty do obrazowania wokół interfejsu, ze średnią 40 punktami na komorę durotaxji. Obrazuj komórki co 10 minut przez maksymalnie 16 godzin.
    UWAGA: Obszar zainteresowania pojawi się jako dwie linie, przy czym linia zewnętrzna odpowiada krawędzi szkiełka nakrywkowego, a linia wewnętrzna odpowiada rzeczywistemu interfejsowi między PDMS a szkiełkiem nakrywkowym. Zobacz rysunek 1B.

4. Analiza danych

  1. Wygeneruj arkusz kalkulacyjny jak w tabeli 1.
  2. Policz liczbę zdarzeń przejścia od PDMS do powierzchni szkła i odwrotnie od każdego wygenerowanego filmu. Zapisz liczbę zdarzeń skrzyżowania w odpowiedniej kolumnie w arkuszu kalkulacyjnym Excel.
    UWAGA: Zdarzenie skrzyżowania definiuje się jako jądro komórkowe przechodzące przez granicę między PDMS a szkłem w dowolnym kierunku.
  3. Aby określić ilościowo wiele przecięć, policz, ile razy komórka przekroczyła interfejs. Liczba ta powinna być zapisana w kolumnie excela odpowiadającej podłożu, na którym znajdowała się komórka na końcu filmu. Powtórz analizę dla każdej komórki, która przecina interfejs w filmie. Wyklucz komórki, które migrują poza pole widzenia podczas obrazowania.
    UWAGA: Ważne jest również, aby sprawdzić, poprzez liczenie komórek na początku eksperymentu, czy komórki są w stanie równomiernie przylegać do pokrytych fibronektyną PDMS i szklanych powierzchni szkiełka nakrywkowego.
  4. Oblicz procent komórek, które migrowały z PDMS na powierzchnię szkła (tj. Przeszły durotaksję). Zsumuj liczbę zdarzeń skrzyżowania z miękkiego na twardy oraz wiele zdarzeń skrzyżowania, które zakończyły się na twardym i podziel przez łączną liczbę zdarzeń skrzyżowania.
  5. Oblicz procent wielu przejazdów, dzieląc liczbę wielokrotnych przejazdów przez całkowitą liczbę przejazdów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat komory durotaxis jest pokazany na rysunku 1A. Miękki substrat PDMS (mieszanina 90:1 bazy PDMS z roztworami sieciującymi) rozprowadza się w naczyniu z 6 dołkami, a na wierzchu PDMS umieszcza się szklane szkiełko nakrywkowe, które następnie częściowo zakrywa górną powierzchnię szkiełka nakrywkowego, tworząc w ten sposób interfejs między dwoma podłożami o różnej podatności. Sztywność miękkiego podłoża PDMS wynosi ~1 kPa, co jest porównywalne z typową podatnością tkanki mózgowej, podczas gdy sztywnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy prosty test do badania durotaksji w migrujących komórkach. Główną zaletą tego testu jest łatwość przygotowania komór durotaxji za pomocą PDMS. Sztywnością substratów można łatwo manipulować, zmieniając stosunek roztworu bazowego PDMS do środka sieciującego, aby umożliwić badanie różnych sztywności w teście. Jednak jednym z potencjalnych ograniczeń systemu jest to, że komórki są narażone tylko na pojedynczą zmianę sztywności substratu, w przeciwieństwie do gradientu sztywności, który jest zapewnian...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez NIH R01 GM47607, CA163296 i NSF 1334493 do CET. Dziękujemy członkom laboratorium Turnera za krytyczną lekturę manuskryptu. Wszystkie dane przedstawione w tym raporcie zostały powtórzone za zgodą Wormer et al. 201411.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow Corning3097358-1004Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych
#1 Szkło nakrywkowe 12 mmFisher Scientific12-545-82
Płytka 6-dołkowaCelltreat229106
DMEMCellgro15-017-CM
L-GlutaminaCellgro25-005-CI
Sód PirogronianFisher ScientificBP356-100
Penicylina/StreptomycynaCellgro30-002-CI
FibronektynaBD Biosciences610077
PBSInvitrogen21600-044
Probówki FalconCelltreat229456
Surowica bydlęcapłodu Atlanta BiologicalsS11150
Surowica bydlęca AlbuminaSigmaA7906
U2OS komórkiATCCHTB-96

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  3. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
  4. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  5. Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
  6. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  7. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  8. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  10. Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
  11. Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).
  12. Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
  13. Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
  14. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
  15. Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Durotaxis AssayPDMS SubstratesCell MechanosensingRigidity InterfaceLive Cell ImagingFibronectin CoatingU2OS CellsCDGAP KnockdownCrossing EventsSoft Hard Substrate

Powiązane artykuły