Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52972

⸱

23 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Notre Dame, 3Department of Chemistry, Physics, and Engineering Studies, Chicago State University, 4Department of Technology, Ivy Tech Community College, South Bend, Indiana

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano powtarzalne procesy czyszczenia substratów używanych w badaniach origami DNA, w tym czyszczenie RCA na stole i derywatyzację tlenku krzemu. Zilustrowano protokoły przygotowania powierzchni, osadzania origami DNA, parametrów suszenia i prostych konfiguracji eksperymentalnych.

Streszczenie

Zaprojektowana natura i kontrolowana, jednogarnkowa synteza origami DNA dostarcza ekscytujących możliwości w wielu dziedzinach, szczególnie w nanoelektronice. Wiele z tych zastosowań wymaga interakcji i adhezji nanostruktur DNA do podłoża. Ze względu na swoją atomowo płaską i łatwą do czyszczenia naturę, mika była podłożem z wyboru do eksperymentów origami DNA. Jednak praktyczne zastosowania miki są stosunkowo ograniczone w porównaniu z substratami półprzewodnikowymi. Z tego powodu przedstawiono tutaj prosty, stabilny i powtarzalny proces adhezji DNA origami do derywatyzowanego tlenku krzemu. Aby ułatwić przyleganie nanostruktur DNA do powierzchni tlenku krzemu, samoorganizująca się monowarstwa 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) jest osadzana z roztworu wodnego, który jest kompatybilny z wieloma fotorezystami. Podłoże musi zostać oczyszczone ze wszystkich zanieczyszczeń organicznych i metalowych za pomocą procesów czyszczenia Radio Corporation of America (RCA), a natywna warstwa tlenku musi zostać wytrawiona, aby zapewnić płaską, funkcjonalną powierzchnię. Pomieszczenia czyste są wyposażone w urządzenia do czyszczenia krzemu, jednak wiele składników i roztworów origami DNA często nie jest w nich dozwolonych ze względu na obawy przed zanieczyszczeniem. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i protokół czyszczenia krzemu w laboratorium na małą skalę dla badaczy, którzy nie mają dostępu do pomieszczenia czystego lub chcieliby włączyć procesy, które mogłyby spowodować zanieczyszczenie czystego stanowiska CMOS w pomieszczeniu czystym. Dodatkowo omówiono zmienne regulujące pokrycie oraz opisano sposoby rozpoznawania i unikania typowych problemów z przygotowaniem próbek.

Wprowadzenie

Po raz pierwszy wprowadzone w 2006 roku, origami DNA wykorzystuje samoorganizującą się naturę oligonukleotydów DNA do tworzenia zaprojektowanych i wysoce uporządkowanych nanostruktur. 1 Opisano niezliczoną ilość struktur, od uśmiechniętych buźek po zatrzaskiwane trójwymiarowe pudełka. 2 Origami DNA może być funkcjonalizowane za pomocą różnych biomolekuł i nanostruktur, co daje początek zastosowaniom badawczym w nanoelektronice, medycynie i komputerach kwantowych. 3 Jednak analiza i wiele przyszłych zastosowań zależy nie tylko od projektu strukturalnego, ale także od przyczepności nanostruktur origami DNA do powierzchni. Metody opisane w tym manuskrypcie dotyczą przygotowania próbek DNA origami na dwóch rodzajach substratów: mice i funkcjonalizowanym tlenku krzemu.

Mika jest substratem z wyboru do badań origami DNA, ponieważ jest atomowo płaska, z wysokością warstwy 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 Jest również łatwy do czyszczenia, co ułatwia przygotowanie próbki i badania mikroskopią sił atomowych (AFM). Mika muskowitowa zawiera dużą gęstość potasu w każdej płaszczyźnie rozszczepienia, ale jony te dyfundują z powierzchni miki, gdy znajdują się w wodzie. Aby pośredniczyć w wiązaniu origami DNA z substratem miki, Mg2+ służy do odwrócenia ujemnego ładunku miki i elektrostatycznego wiązania szkieletu fosforanu DNA z substratem (ryc. 1A). 5 Mieszaniny wyżarzonego DNA w obecności dużych nadmiarów nici zszywek dają wysokie pokrycie i dobre obrazy na mice, ponieważ adhezja origami DNA do powierzchni zakończonej Mg2+ jest znacznie silniejsza niż adhezja jednoniciowych oligonukleotydów (nici zszywkowych). Inne dodatnio naładowane jony, w tym Ni2+ i Co2+ mogą być używane do kontrolowania adhezji DNA do miki. 6,7 Zmiana stężenia kationów jednowartościowych i dwuwartościowych w roztworze może pośredniczyć w adhezji i szybkości dyfuzji powierzchniowej origami DNA. 8 Jednak protokół przygotowania substratów mikowych oraz deponowania i płukania origami często nie jest wyraźnie opisany w opublikowanych manuskryptach. 9 Bez jasnego protokołu uzyskanie powtarzalnych wyników może być trudne.

Mika jest izolatorem, więc nie nadaje się jako podłoże do niektórych zastosowań w nanoelektronice. Krzem pasywowany cienkim natywnym tlenkiem ma pożądane właściwości elektroniczne, w tym kompatybilność z wcześniejszym komplementarnym przetwarzaniem półprzewodników metalowo-tlenkowych (CMOS) w celu tworzenia struktur wejściowych/wyjściowych i cech topograficznych. Wafle krzemowe przechowywane w powietrzu są pasywowane grubym tlenkiem termicznym lub cienką natywną warstwą tlenku, która jest stosunkowo brudna, z dużą liczbą cząstek stałych. Tlenek krzemu ma znacznie niższą gęstość ładunku powierzchniowego niż mika, a gęstość ładunku jest w dużym stopniu zależna od przygotowania i historii tlenku. Przy stężeniach jonów magnezu powyżej 150 mM można osiągnąć dobre pokrycie (do 4/μm2) prostokątnym origami DNA na podłożach krzemowych poddanych plazmie tlenowej; Jednak to stężenie i pokrycie mogą się zmieniać w zależności od wielkości i konstrukcji stosowanych nanostruktur. 10 Alternatywnym protokołem dostrajania ładunku powierzchniowego jest dołączenie do tlenku kationowej, samoorganizującej się monowarstwy 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) (rysunek 1B). Pierwszorzędowa amina na APTES może być protonowana przy wartościach pH poniżej 9, modyfikując ładunek i hydrofobowość substratu. 11 Aby pomyślnie zdeponować całą monowarstwę APTES, krzem musi zostać odpowiednio oczyszczony przy użyciu protokołów Radio Corporation of America (RCA). Protokoły te obejmują zabiegi w roztworach wodorotlenku amonu i nadtlenku wodoru (RCA1) w celu usunięcia pozostałości organicznych i zanieczyszczeń cząstkowych. Krótkie wytrawienie w wodnym roztworze kwasu fluorowodorowego usuwa natywną warstwę tlenku wraz z wszelkimi zanieczyszczeniami jonowymi, które przylegają do tlenku. Na koniec próbki są wystawiane na działanie roztworu kwasu solnego i nadtlenku wodoru (RCA2) w celu usunięcia zanieczyszczeń metalowych i jonowych oraz utworzenia cienkiej, jednolitej warstwy tlenku. 12 Większość pomieszczeń czystych ma wyznaczone okapy do protokołów czyszczenia CMOS, z surowymi zasadami dotyczącymi tego, co można używać w tych obszarach. Częstym problemem są jony, takie jak sód, które mogą zakłócać właściwości elektroniczne struktur CMOS poprzez tworzenie pułapek o średniej przerwie energetycznej. 13 Jony powszechnie stosowane w do przygotowywania i osadzania origami DNA mogą zanieczyszczać kąpiele CMOS i powodować problemy dla innych badaczy korzystających z pomieszczenia czystego. Z tego powodu nasza grupa korzysta z "brudnego" stołu do czyszczenia CMOS, przygotowanego specjalnie dla małych próbek używanych do badań DNA origami. Proces ten jest dobrą alternatywą dla tradycyjnej konfiguracji w pomieszczeniach czystych i może być odpowiedni dla laboratoriów, które nie mają dostępu do stołu CMOS w pomieszczeniach czystych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Planowanie eksperymentu i przygotowanie materiału

  1. Określ projekt, stężenie i funkcjonalność origami DNA, które zostaną użyte w eksperymentach. 14-16 Tutaj używamy prostokąta origami DNA przygotowanego w 1x roztworze TAE/Mg2+ (40 mM Tris-zasada, 20 mM kwas octowy, 2 mM EDTA i 12 mM octan magnezu, pH 8,0). 17
  2. Autoklaw wszystkie końcówki, rurki i pojemniki, które mają być używane. Wszystkie te materiały muszą być kompatybilne z autoklawem.
  3. Przygotuj zapas sterylnej wody do płukania. Napełnij sterylny słoik około 500 ml wody o wymiarach 18 MΩ x cm, umieść na płycie grzejnej, gotuj przez 5 minut ze zdjętą nakrętką, zdejmij słoik z płyty grzejnej i pozostaw do ostygnięcia z pokrywką umieszczoną na pojemniku, ale nie dokręconą. Przechowuj w lodówce i przygotowuj nowy zapas co miesiąc lub w razie potrzeby.

2. Przygotowanie podłoża z miki

  1. Przytnij podłoża do odpowiedniego rozmiaru (kwadraty 1 cm x 1 cm) za pomocą nożyczek. Mika jest cienka i krucha. Alternatywnie kup mikę w formie krążka, która nie wymaga cięcia.
  2. Rozetnij mikę za pomocą taśmy dwustronnej. Mika składa się z warstw minerałów oddzielonych jonami interkalacyjnymi, każda warstwa może zostać oderwana po przyklejeniu do taśmy dwustronnej. Rozdział 18
    1. Umieść kwadraty miki na taśmie dwustronnej jeszcze w dyspenserze taśmy, upewniając się, że są mocno przyklejone do taśmy. Ostrożnie wsuń pęsetę między mikę a taśmę, górna warstwa zostanie usunięta i pozostanie na taśmie. Natychmiast po usunięciu kwadrat miki będzie miał czystą stronę skierowaną w dół. Pamiętaj, aby odwrócić mikę przed przechowywaniem w pojemniku.
    2. Powtórz to trzy do czterech razy, aby zapewnić całkowite usunięcie wierzchniej warstwy i odpowiednie czyszczenie.
  3. Alternatywnie, przyklej mikę do pojemnika lub blatu za pomocą kawałka dwustronnej taśmy i użyj drugiego kawałka, aby przykleić i oderwać najwyższą warstwę miki. W obu przypadkach mika zostanie odpowiednio oczyszczona, chociaż alternatywna metoda utrudnia osadzanie DNA oraz płukanie i suszenie próbki ze względu na drugą przyczepność do podłoża.

3. Deponowanie DNA Origami na mice

  1. Krótko mówiąc, wymieszaj fiolkę origami DNA za pomocą mieszalnika wirowego, aby zapewnić równomierne rozproszenie nanostruktur w roztworze.
  2. Odpipetować 4 μl roztworu na mikę, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka podłoża. Pozostaw origami DNA na mice na około 10 minut, aby zapewnić odpowiednie pokrycie. Czas osadzania będzie się różnił w zależności od stężenia użytego origami DNA, a także pożądanego pokrycia (ryc. 2 i 3).
    1. Wypłucz roztwór origami DNA z podłoża miki, używając 100 μl sterylnej wody nad zlewem lub innym pojemnikiem na płyny. Podnieś mikę za pomocą pęsety. Odpipetuj wodę z podłoża, tak aby kropla płynęła w kierunku końcówki pęsety. Potrząśnij miką ostrym ruchem w dół, aby usunąć nadmiar wody. Trzymaj pęsetę pionowo, aby woda spływała w kierunku pęsety, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
  3. Suszyć podłoże stałym strumieniem azotu (N2) przez 1 minutę. Upewnij się, że nadmiar wody został usunięty. Powtórz płukanie z dodatkowymi 100 μl sterylnej wody. Suszyć podłoże za pomocą N2 przez dodatkowe 3 minuty. Całkowicie suche podłoże jest niezbędne do udanej analizy mikroskopii sił atomowych (AFM) (ryc. 4).
  4. Przeanalizować podłoże za pomocą AFM lub przechowywać w zamkniętym pojemniku.

4. Konfiguracja czyszczenia CMOS/Silicon

  1. UWAGA: Podczas korzystania z konfiguracji CMOS należy zawsze używać środków ochrony osobistej. Odczynniki obejmują mocne kwasy, mocne zasady, kwas fluorowodorowy (HF) i silne środki utleniające, które mogą reagować z rozpuszczalnikami odpadowymi, jeśli odczynniki nie zostaną odpowiednio zutylizowane. Przestrzegaj następujących środków ostrożności:
    1. Umieść ławkę CMOS w okapie chemicznym bez żadnych innych procesów ani konfiguracji.
    2. Podczas korzystania z ławki CMOS należy nosić rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, duże przemysłowe rękawice nitrylowe, fartuch przeciwpowodziowy i osłonę twarzy.
    3. Użyj plastikowych pojemników jako wtórnego zabezpieczenia, gdy przygotowywane są roztwory.
    4. Użyć miarki z obojętnego fluorowanego polimeru do manipulowania stężonym HF.
    5. Przygotuj maść z glukonianu wapnia jako pierwszą pomoc w przypadku każdego kontaktu ze skórą.
    6. Do wykonania tego procesu należy pozwolić wyłącznie odpowiednio przeszkolonemu personelowi.
    7. W nagłych wypadkach zawsze upewnij się, że inny członek laboratorium jest obecny.
    8. Przechowuj informacje o karcie charakterystyki dla wszystkich chemikaliów w pobliżu maski.
    9. Zapoznaj się z zasadami instytucji lub firmy dotyczącymi wycieków chemicznych i narażenia.
      Uwaga: HF łatwo przenika przez skórę i jest wymiataczem wapnia, wpływając na kości i uszkadzając nerwy, jeśli dojdzie do ekspozycji. Narażenie skóry na kilka mililitrów stężonego kwasu fluorowodorowego może być niebezpieczne, a nawet śmiertelne. Ustal niezbędne środki ostrożności, aby zapobiec narażeniu.
  2. Wykonaj RCA1 i RCA2 w oddzielnych szklanych zlewkach o pojemności 250 ml na oddzielnych płytach grzejnych. Każda zlewka powinna zawierać mieszadło. Monitoruj temperaturę roztworu za pomocą termometrów zaciśniętych tak, aby mieszadło nie uderzało w bańkę. Przykryj zlewki szkiełkiem zegarkowym, aby zmniejszyć skutki parowania.
  3. Przygotowanie do RCA1
    1. Umieścić 50 ml wody o wymiarach 18 MΩ x cm do wyznaczonej zlewki RCA1 za pomocą miarki.
    2. Dodać 15 ml stężonego wodorotlenku amonu (NH4OH) do zlewki. Przepłukać miarkę 25 ml wody i dolać wody do płukania do zlewki RCA1.
    3. Włącz ogień i zamieszaj na płycie grzejnej i doprowadź kąpiel RCA1 do 70 °C.
    4. Dodać 15 ml 30% nadtlenku wodoru (H2O2) do zlewki RCA1. Roztwór RCA1 należy zużyć w ciągu 1 godziny po dodaniuH2O2. Kąpiel może być używana kilka razy w ciągu trzech dni, jeśli za każdym razem do kąpieli dodaje się 15 ml nadtlenku.
    5. Miarkę dokładnie wypłukać wodą i wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady RCA1.
  4. Przygotowanie do RCA2
    1. Dodać 70 ml wody o sile 18 MΩ x cm do wyznaczonej zlewki RCA2 za pomocą dokładnie wypłukanej miarki.
    2. Dodać 15 ml stężonego kwasu solnego (HCl). Przepłukać miarkę 20 ml wody i włożyć ją do zlewki RCA2.
    3. Zwiększ temperaturę i szybkość mieszania płyty grzejnej, aż roztwór osiągnie 70 °C.
    4. Dodać 15 ml 30% H2O2 . Podobnie jak w przypadku kąpieli RCA1, należy użyć tego roztworu w ciągu 1 godziny od dodaniaH2O2; dodatkowo kąpiel może być ponownie użyta kilka razy w ciągu trzech dni, jeśli przed każdym użyciem doda się 15 mlH2O2.
  5. Przygotowanie roztworu HF
    1. Umieścić 50 ml wody w obojętnej zlewce z fluorowanego polimeru.
    2. Odmierzyć 4 ml stężonego kwasu fluorowodorowego (49%) w plastikowej miarce i dodać do zlewki z obojętnego fluorowanego polimeru.
    3. Plastikową miarkę wypłukać łącznie 50 ml wody, dodając wodę do płukania do zlewki HF. Miarkę dokładnie umyć wodą, a popłuczyny wyrzucić do przeznaczonego do tego pojemnika na odpady HF.

5. Przygotowanie i czyszczenie podłoża silikonowego

  1. Cięcie wafli krzemowych na wióry
    1. Zidentyfikuj prostopadłe i równoległe kierunki sieci na płaskiej, polerowanej powierzchni płytki krzemowej. Te wskazówki są używane, aby ułatwić rozszczepianie kwadratów. Poniższe instrukcje dotyczą rozszczepiania krzemu <110> i mogą nie być odpowiednie dla innych orientacji kryształów.
    2. Połóż wafel silikonowy wypolerowaną stroną do góry na miękkiej powierzchni, takiej jak serwetka. Za pomocą pisaka z diamentową końcówką delikatnie naciąć spód wafla wzdłuż głównej płaskiej krawędzi. Umieść mały drucik, taki jak spinacz do papieru, poniżej nacięcia i delikatnie dociśnij wafel, umieszczając palce lub pęsetę po obu stronach nacięcia i dociskając w dół. W ten sposób rozdzielisz wafel na dwie połówki wzdłuż linii sieci krystalicznej w naturalnym kierunku rozszczepienia.
    3. Na innej serwetce za pomocą ołówka i linijki odmierz żądaną szerokość kwadratów, zaznaczając kropki zarówno na górze, jak i na dole serwetki. Połącz te kropki liniami prostymi. Będzie to służyć jako wskazówka dla nawet kwadratowych kształtów.
    4. Umieść jedną z połówek wafla krawędzią do przodu między zmierzonymi liniami na serwetce równo z linią i powtórz w kroku 5.1.2 Świeżo połamane prostopadłe kawałki powinny teraz mieć szerokość rozłupanych kwadratów. Obróć wafel poziomo na serwetce. Umieść go między prostopadłymi liniami i powtórz proces opisany w kroku 5.1.2.
    5. Przechowuj świeżo rozdrobnione chipsy waflowe w czystej fiolce wypełnionej wodą DI, aby zapobiec zarysowaniu. Chipy krzemowe mogą być przechowywane w nieskończoność, ale należy je wyczyścić przed rozpoczęciem eksperymentów.
  2. Czyszczenie CMOS krzemu
    1. Gdy roztwór RCA1 osiągnie odpowiednią temperaturę, zanurz od ośmiu do dziesięciu chipów krzemowych o wymiarach 1 cm x 1 cm w roztworze za pomocą obojętnego kosza z fluorowanego polimeru o średnicy 2 cali. Na wiórach i ściankach zlewki utworzą się pęcherzyki tlenu. Jeśli nie występuje bąbelkowanie,H2O2ulega degradacji. Pozostaw frytki w roztworze na 10 do 20 minut, mieszając kosz w górę iw dół co kilka minut, aby frytki się nie sklejały.
    2. Podnieś kosz zawierający wióry silikonowe do góry i dobrze odcedź. Przełożyć kosz do zlewki na odpady i dokładnie spłukać wodą o stężeniu 18 MΩ x cm. Zanurzyć w zmywarce i podskakiwać w górę i w dół przez 20 sekund. Opróżnij kosz i dokładnie spłucz zlewkę z wodą na odpady. Opróżnij zlewkę na odpady do przeznaczonej do tego butelki na odpady RCA1 i napełnij ją wodą.
    3. Po zakończeniu czyszczenia RCA1 umieść kosz w zlewce HF 1:50 na 10 do 20 sekund. Delikatnym ruchem w górę iw dół wymieszaj frytki i HF. Podnieś wiadro do namaczania, aby HF całkowicie odpłynął.
      Uwaga: Powierzchnie wiórów powinny być hydrofobowe; Woda nie zwilży chipa, ale zamiast tego utworzy kropelki o dużych kątach zwilżania. Oznacza to, że tlenek krzemu został wytrawiony, a chip jest teraz zakończony wiązaniami Si-H.
    4. Umieścić zlewkę do płukania i płukać w pojemniku z tworzywa sztucznego, przesunąć kosz nad zlewką do płukania i spłukać wodą o stężeniu 18 MΩ x cm. Zanurzyć kosz w zlewce do mycia i mieszać przez 20 sekund.
    5. Zakończ drugi cykl opróżniania i płukania wodą o wymiarach 18 MΩ x cm. Wlej wodę z płukania do zlewki do płukania i ponownie napełnij zlewkę do płukania wodą. Wlej wszystkie odpady do wyznaczonej plastikowej butelki na odpady HF.
    6. Gdy roztwór RCA2 osiągnie odpowiednią temperaturę, zanurz chipy krzemowe w roztworach za pomocą kosza. Pozostaw w roztworze na 10 do 20 minut. Chip będzie teraz hydrofilowy ze względu na wzrost cienkiej (1-2 nm) warstwy tlenku.
    7. Usuń po odpowiednim czasie i postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami płukania, co w przypadku RCA1. Odpady należy utylizować do odpowiedniego pojemnika na odpady RCA2. Wyjmij każdy wiór z kosza plastikową pęsetą, spłucz wodą i wysusz azotem.
    8. Przechowuj chipsy w plastikowym pudełku na wafle lub w fiolce o wymiarach 18 MΩ x cm wody. Silikon pozostanie czysty, jeśli będzie przechowywany w wodzie przez około trzy dni po czyszczeniu. Upewnij się, że obszar roboczy jest odpowiednio oczyszczony, a zewnętrzna strona rękawic CMOS została umyta. Pozostaw rękawice CMOS w kapturze do wyschnięcia.

6. Osadzanie DNA Origami na krzemie funkcjonalizowanym APTES

  1. Samodzielne tworzenie monowarstw na krzemie
    1. Ogrzej APTES do RT przed otwarciem. Jeśli butelka jest zbyt zimna, może dojść do kondensacji, powodując hydrolizę APTES podczas przechowywania. Dodać 1 980 μl wody o stężeniu 18 MΩ x cm i 20 μl APTES do czystej fiolki scyntylacyjnej i zamieszać do wymieszania. Użyj tego rozwiązania natychmiast.
    2. Umieść oczyszczony chip silikonowy odblaskową stroną do góry w fiolce scyntylacyjnej, zakryj go i pozostaw na 20 minut. Usuń wiór za pomocą pęsety i spłucz 200 μl wody i susz przez 1 minutę strumieniem N2.
  2. Osadzanie origami DNA na APTES Funkcjonalizowany Krzem
    Uwaga: Etapy osadzania origami DNA na funkcjonalizowanym krzemie są analogiczne do tych deponowania na mice.
    1. Krótko wymieszać fiolkę origami DNA i odpipetować 4 μl roztworu na substrat krzemowy. Jeśli to konieczne, zwiększ objętość roztworu origami DNA używanego do pokrycia całego substratu, ponieważ funkcjonalizowany krzem jest bardziej hydrofobowy niż substrat miki. Użyj szklanego szkiełka nakrywkowego, aby docisnąć roztwór do osadzania i zapobiec parowaniu podczas długiego osadzania.
    2. Pozostawić roztwór na czas niezbędny do zastosowanego stężenia i pożądanego pokrycia (zob. rysunki 2 i 3 w celu zapoznania się z wpływem czasu i stężenia na pokrycie powierzchni). Podłoże przepłukać 100 μl sterylnej wody o wymiarach 18 MΩ x cm i wysuszyć roztworem N2 przez 1 min.
    3. Powtórzyć płukanie dodatkowymi 100 μl sterylnej wody i suszyć podłożeN2 przez 3 minuty.
    4. Przechowywać próbkę w czystym pojemniku do czasu przeprowadzenia dalszych eksperymentów lub obrazowania. Próbki zaczynają wykazywać nagromadzenie cząstek stałych po około jednym do dwóch tygodni przechowywania, w zależności od tego, jak często są przetwarzane.

7. Obrazowanie AFM i analiza obrazu próbek DNA origami

  1. Użyj AFM w trybie stukania w powietrzu do celów obrazowania. Tryb gwintowania zapewnia, że do delikatnych nanostruktur zostanie przyłożona minimalna siła w porównaniu z trybem kontaktowym.
    Uwaga: Parametry obrazowania będą zależeć od instrumentu. Wszystkie prezentowane obrazy zostały wykonane za pomocą MultiMode Nanoscope IIIa.
  2. Wybierz sondy AFM do trybu bezdotykowego/stukania w powietrzu, ze złotą powłoką odblaskową, częstotliwością rezonansową (nominalną) ~300 kHz, stałą siły 40 N/m i promieniem końcówki <10 nm.
  3. Przetwarzaj i analizuj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do analizy NanoScope. Wykonaj obliczenia pokrycia za pomocą ImageJ. Rozdział 19

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stopień pokrycia podłoża przez origami DNA zależy od dwóch zmiennych: stężenia roztworu oraz czasu ekspozycji. Charakterystyka adsorpcji origami DNA na miki oraz tlenku krzemu funkcjonalizowanym APTES została opisana we wcześniejszych publikacjach.13 Zależność między stężeniem origami DNA w roztworze do osadzania a końcowym stopniem pokrycia miki podsumowano w Tabeli 1 oraz na Rysunku 2, co wskazuje, że wzrost stężenia prowadzi do zwiększenia pokrycia powierzchni. Zależność wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kilka kroków, na które należy położyć nacisk, aby osiągnąć spójne i idealne wyniki. W przypadku próbek miki, przestrzeganie ścisłego i dokładnego reżimu płukania i suszenia, jak w krokach 3.3 i 3.4, zapewni uzyskanie wysokiej jakości obrazów poszczególnych origami DNA przy użyciu AFM bez różnych problemów opisanych w sekcji Reprezentatywne wyniki. Podstawowe znaczenie dla próbek krzemu ma czystość podłoża. Dokładne i skrupulatne postępowanie zgodnie z procedurami czyszczenia opisanymi w kroku 5.2 zapewni uzyskan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Gary'emu Bernsteinowi za użycie AFM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Eppendorf epT.I.P.S. Przeładowania, pojemność 2-200  μ lVWR International, LLC2249173310 tac załadowczych z 96 końcówkami
Probówki do mikrowirówek, polipropylenVWR International, LLC87003-2900,65 ml, naturalny
Research Plus Pippete - jednokanałowy - 20-200  μ lA. Daigger & Spółka, Inc.EF8960F-3120000054 KAŻDYPipeta o regulowanej objętości
Research Plus - Pojedynczy kanał - 2-20  μ lA. Daigger & Spółka, Inc.EF8960D-3120000038 KAŻDYTaśma o regulowanej objętości
Scotch 237 Stała taśma dwustronnaOffice Depot, Inc.6027103/4" x 300", zestaw 2 szt
Mikser VortexThermo ScientificM37610-33Q
Pojemnik na wafle pojedyncze, 2" (50 mm), 60 mm x 11  mmMikroskopia elektronowa Nauki64917-26 w opakowaniu
6 "Wafel, typ P, < Orientacja 100>, z głównym płaskim NovaElectronic Materials, Ltd.
Bezpudrowe nitrylowe rękawice diagnostyczneVWR International, LLC82062-428Numer katalogowy dotyczy dużych
sond bezkontaktowych o wysokiej dokładności z powłoką odblaskową AuK-Tek Nanotechnology, Inc.HA_NC/15
Autoklaw PanA. Daigger & Spółka, Inc.NAL692-5000 EF25341C
Rękawice agresywne Sol-Vex II, rozmiar: 9-9,5; 15 mil, 13 cali - 1 dzSpectrum Chemical Mfg. Corp.106-15055Przed użyciem spłukać wodą i wyszorować, aż na rękawicach nie utworzą się pęcherzyki.
Pęseta PTFE 200 mm kwadratowaDynalon Corp.316504-0002
Arkusze miki moskiewskiej V-5 JakośćMikroskopia elektronowa Nauki71850-0110 w opakowaniu
Krążek miki, 10 mmTed Pella, Inc50krążków z miki jest opcjonalnych
Pisak Diamon Pen do wyrobów szklanychVWR International, LLC52865-005
Fiolki scyntylacyjne, szkło borokrzemianowe, z zakrętką - 20 mlVWR International, LLC66022-060Skrzynka 500, z dołączoną nasadką z polipropylenu i wkładką z folii celulozowej
4 x 5 cali górna płyta grzejna PC-200, 120 V/60 HzDot Scientific, Inc.6759-200
Słoiki szklane o prostych ściankach, szerokie ustaVWR International, LLC89043-554Opakowanie 254, nakrętki z dołączoną wkładką z masy celulozowej/winylu
Zlewka ze szkła standardowego, 250 ml PojemnośćVWR International, LLC173506
Zlewki, PTFEVWR International, LLC89026-022Do użytku ze
szkiełkiem zegarkowym HF o płytkiej formie, 3"VWR International, LLC66112-107Skrzynka 12
plastikowych pojemników do przechowywaniaVWR International, LLC470195-354Do pojemnika wtórnego
Termometry szklane ogólnego przeznaczenia do cieczyVWR International, LLC89095-564
Precyzyjna i bardzo cienka pęsetaMikroskopia elektronowa Sciences78310-0
Osłona twarzy z poliwęglanuFisher ScientificInc.18-999-4542
Fartuch neoprenowyFisher Scientific, Inc.19-810-609
Glukonian wapnia, CalgonateWW Grainger, Inc.13W861Probówka, 25 g
Nadtlenek wodoru 30% CR ACS 500 mlFisher Scientific, Inc.H325 500SZKODLIWY, TOKSYCZNY
3-aminopropylotrietoksysilanGelest Inc.SIA0610.0-25GMPrzed użyciem ogrzej się do temperatury pokojowej.
Wodorotlenek amonu, 2,5 lFisher Scientific, Inc.A669-212SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Kwas solnyFisher Scientific, Inc.A144-212SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Kwas fluorowodorowyFisher Scientific, Inc.A147-1LBSZKODLIWY, TOKSYCZNY
MultiMode Nanoscope IIIaVeeco Instruments, Inc.Do analizy nadaje się każdy AFM z trybem gwintowania
Kosz do zanurzaniaWykonane w laboratorium Wyprodukowanow laboratoriumKosz do zanurzania został wykonany przy użyciu dna butelki z PTFE z wywierconymi otworami, uchwytem z PTFE i wszystkimi z PTFE.
. GC49266

Bibliografia

  1. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  2. Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
  3. Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
  4. Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
  5. Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
  6. Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  7. Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
  8. Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889(2014).
  9. Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
  10. Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, , (2010).
  11. Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1(2010).
  12. Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
  13. Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
  14. Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
  15. Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
  16. Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268(2013).
  17. Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
  18. Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
  19. Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
  20. Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
  21. Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
  22. Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M(2010).
  23. Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602(2014).
  24. Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844(2012).
  25. Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
  26. Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie pod o a z mikifunkcjonalizacja tlenku krzemuproces czyszczenia RCAsamoorganizuj ca si warstwa APTESadhezja origami DNAtrawienie kwasem fluorowodorowymlitografia wi zk elektron wtechnika molekularnego liftoffuprotok czyszczenia pod o ametoda funkcjonalizacji powierzchni
Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.