Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53035

⸱

1 września 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni

.

Streszczenie

Inicjacja i ekspansja torbieli podczas wielotorbielowatości nerek to złożony proces charakteryzujący się nieprawidłowościami w proliferacji komórek kanalików, gromadzeniu płynu świetlnego i tworzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej. Aktywność kanałów jonowych i wewnątrzkomórkowa sygnalizacja wapniowa są kluczowymi parametrami fizjologicznymi, które determinują funkcje nabłonka kanalików. Opracowaliśmy metodę odpowiednią do obserwacji aktywności kanałów jonowych w czasie rzeczywistym za pomocą techniki patch-clamp i rejestracji wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ w monowarstwach nabłonka świeżo wyizolowanych z torbieli nerek. Szczury PCK, model genetyczny autosomalnej recesywnej wielotorbielowatości nerek (ARPKD), wykorzystano do analizy ex vivo kanałów jonowych i przepływu wapnia. Opisano tutaj szczegółową procedurę krok po kroku mającą na celu wyizolowanie torbielowatych monowarstw i nierozszerzonych kanalików od szczurów PCK lub normalnych Sprague Dawley (SD) oraz monitorowanie aktywności pojedynczego kanału i wewnątrzkomórkowej dynamiki Ca2 +. Metoda ta nie wymaga przetwarzania enzymatycznego i umożliwia analizę w natywnym otoczeniu świeżo wyizolowanej monowarstwy nabłonka. Co więcej, technika ta jest bardzo wrażliwa na wewnątrzkomórkowe zmiany wapnia i generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości do precyzyjnych pomiarów. Wreszcie, wyizolowany nabłonek torbielowaty może być dalej wykorzystywany do barwienia przeciwciałami lub barwnikami, przygotowania kultur pierwotnych i oczyszczania do różnych testów biochemicznych.

Wprowadzenie

Kanały jonowe odgrywają znaczącą rolę w wielu funkcjach fizjologicznych, w tym we wzroście i różnicowaniu komórek. Autosomalna dominująca i recesywna wielotorbielowatość nerek (odpowiednio ADPKD i ARPKD) to zaburzenia genetyczne charakteryzujące się rozwojem torbieli wypełnionych płynem nerkowym pochodzących z komórek nabłonka kanalików. ADPKD jest spowodowany mutacjami genów PKD1 lub PKD2 kodujących polisystyny 1 i 2, białka błonowe biorące udział w regulacji proliferacji i różnicowania komórek. PKD2 sam w sobie lub jako kompleks z PKD1 funkcjonuje również jako przepuszczalny dla Ca2+ kanał kationowy1. Mutacje genu PKHD1 kodującego fibrocystynę (białko podobne do receptora związanego z rzęskami, biorące udział w tuburogenezie i/lub utrzymaniu polarności nabłonka) są genetycznym impulsem ARPKD2. Wzrost torbieli jest złożonym zjawiskiem, któremu towarzyszy zaburzona proliferacja3,4, angiogeneza5, odróżnicowanie i utrata polarności komórek kanalików6-8.

Wadliwe wchłanianie zwrotne i zwiększone wydzielanie w nabłonku torbielowatym przyczyniają się do gromadzenia płynu w świetle i rozszerzania torbieli9,10. Upośledzona sygnalizacja zależna od przepływu [Ca2 +] i została również powiązana z cystogenezą podczas PKD11-15.

Tutaj opisujemy metodę odpowiednią do pomiarów jednokanałowych i wewnątrzkomórkowych poziomów Ca2+ w torbielowatych nabłonkach izolowanych od szczurów PCK. Metoda ta została przez nas z powodzeniem zastosowana do scharakteryzowania aktywności nabłonkowego kanału Na+ (ENaC)10 i procesów zależnych od [Ca2+]i, indukowanych przez przepuszczalny dla Ca2+ TRPV4 i purynergiczną kaskadę sygnalizacyjną13.

W tych badaniach użyliśmy szczurów PCK, modelu ARPKD spowodowanego spontaniczną mutacją w genie PKHD1. Szczep PCK został pierwotnie pozyskany od szczurów Sprague-Dawley (SD)16, dlatego szczury SD są używane jako odpowiednia kontrola do porównania ze szczepem PCK. W rezultacie, zarówno segmenty nefronu szczura SD, jak i nieposzerzone kanały zbiorcze wyizolowane od tych samych szczurów PCK mogą służyć jako dwie różne grupy porównawcze do eksperymentów na nabłonku torbielowatym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Medical College of Wisconsin oraz University of Texas Health Science Center w Houston i były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Rysunek 1 przedstawia główne etapy procedury izolacji i przetwarzania tkanek. Krótko mówiąc, nerki szczurów PCK lub SD są używane do ręcznej izolacji monowarstw nabłonkowych przewodów zbiorczych ze zdrowych, niewybieranych kanalików lub torbieli. Tutaj badaliśmy nerki szczurów PCK w wieku 4-16 tygodni10,13.

1. Izolacja torbieli nerek i kanalików łączących (CNT)/Odcinków przewodów zbiorczych (CD)

  1. Znieczulić zwierzę doświadczalne izofluranem (5% indukcji, 1,5 do 2,5% konserwacji)/medycznym stopniem O2 lub inną zatwierdzoną metodą. Zwierzęta muszą być stale monitorowane w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu znieczulenia. Stabilna częstość oddechów i reakcja na uszczypnięcie palca u nogi służą do potwierdzenia prawidłowego znieczulenia.
  2. Wykonaj laparotomię i przepłucz nerki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przez aortę brzuszną17.
    1. Przygotuj cewnik z rurką polietylenową (PE50) i podłącz go do pompy strzykawkowej wypełnionej PBS. Przetnij skórę i ścianę brzucha wzdłuż kresy białej, a następnie wykonaj poprzeczne nacięcie brzucha w poprzek brzucha z boku na bok i przesuń narządy jamy brzusznej za pomocą wacików, aby uzyskać dostęp do aorty zstępującej z rozgałęzionymi tętnicami krezkowymi i trzewnymi. Podczas dalszych zabiegów należy zwilżyć narządy wewnętrzne ciepłą solą fizjologiczną, aby zapobiec ich wysuszeniu.
    2. Umieść jedną ligaturę (#1) wokół tętnic krezkowych i trzewnych, a drugą ligaturę (#2) wokół aorty pod przeponą (nie wiąż). Delikatnie oddziel a. brzuszek poprzez wypreparowanie otaczających go tkanek łącznych cienkimi kleszczami i umieść dwie ligatury ~ 3 mm poniżej lewej tętnicy nerkowej (#3) i powyżej rozwidlenia tętnic biodrowych (#4).
    3. Zawiąż ligaturę #4 i przymocuj zacisk naczynia wokół aorty między lewą tętnicą nerkową a ligaturą #3. Wykonaj nacięcie między zaciskiem a ligaturą #4, aby cewnikować aortę, użyj ligatury #3, aby mocno zamocować cewnik
      4. .
    4. Zwolnij zacisk i upewnij się, że puls krwi jest widoczny w cewniku, aby zapewnić prawidłową instalację. Rozpocznij perfuzję z szybkością 6 ml/min, zawiąż ligatury #1 i #2 i przetnij lewą żyłę nerkową. Kontynuuj płukanie przez 1-2 minuty, aż narządy zostaną całkowicie zblanszowane.
    5. Przeciąć nerkowe naczynia krwionośne, cewkę moczową i otaczającą tkankę łączną i tłuszczową nożyczkami, aby pobrać nerki. Następnie wykonaj krótkie rozdarcie w torebce nerkowej i obierz nerki, aby je zdecapsulować. Umieść nerki w lodowatym PBS. Eutanazję potwierdza się za pomocą torakotomii.
  3. Przygotuj 5 x 5 mm nakrywkowe wióry szklane pokryte poli-L-lizyną. Wytnij szklankę nakrywkową ołówkiem diamentowym i umieść około 20 μl 0,01% sterylnego, przefiltrowanego roztworu poli-L-lizyny na każdym chipsie szklanym. Przygotuj sól fizjologiczną i dwie pary kleszczy zegarmistrzowskich do sekcji.
  4. Pokrój nerki żyletką wzdłuż płaszczyzny czołowej na plastry o grubości ~1-2 mm. Umieść jeden z plastrów pod mikroskopem stereoskopowym. Izolację tkanek należy wykonać w lodowatej soli fizjologicznej.
  5. Zlokalizuj torbiele pod mikroskopem stereoskopowym jako okrągłe jamy (ryc. 2A); ich ściany często zawierają wyraźną sieć rozpiętych naczyń krwionośnych. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką wypreparuj wewnętrzną warstwę nabłonkową torbieli tak cienką, jak to możliwe, aby uzyskać obszar jednowarstwowy. Przymocuj go do szklanego wióra pokrytego poli-L-lizyną. Lepka powierzchnia poli-L-lizyny pozwala badaczowi na mocne ułożenie wewnętrznej warstwy torbieli na szkle. Odsłoń torbiel wierzchołkową stroną do góry, aby zapewnić dostęp do pipet (Rysunek 2B).
  6. Do izolacji nierozszerzonych segmentów CNT/CCD18-21.
    należy użyć centralnych wycinków nerki szczura PCK lub SD zawierających brodawkę UWAGA: Tkanki brodawkowate są trwalsze niż kora, a przytrzymując brodawkowate pasma rurkowe kleszczami i rozrywając wzdłuż osi promieniowej, plasterek można rozciąć na cienkie sektory. Poszczególne kanaliki są widoczne i można je wyciągnąć w celu umieszczenia na kawałkach szkła nakrywkowego.
  7. Zidentyfikuj segmenty CNT/CCD za pomocą rozwidleń, wyższej przezroczystości niż kanaliki proksymalne i dużych, wyraźnie widocznych komórek (Figura 2C). Umieść szklany chip nakrywkowy z dołączonymi kanalikami pod mikroskopem wyposażonym w mikromanipulatory odpowiednie do napędzania mikropipet. Za pomocą ostrych mikropipet rozciąć kanaliki i przymocować ich krawędzie do szkła, aby umożliwić dostęp do powierzchni wierzchołkowej (rysunek 2D).

2. Elektrofizjologia jednokanałowego zacisku krosowego

  1. Napełnij komorę zaciskową roztworem do kąpieli i przenieś szklany wiór nakrywkowy z izolowanymi tkankami do komory. Upewnij się, że mikropipety z zaciskiem krosowym mają rezystancję 7-10 MΩ, aby zapewnić wiarygodne pomiary na ogniwie (podłączone do ogniwa).
  2. W przypadku pomiarów podłączonych do ogniw ustaw współczynnik wzmocnienia wzmacniacza na 20x i dolnoprzepustowy prądy o częstotliwości 300 Hz za pomocą ośmiobiegunowego filtra Bessela. Do monitorowania kanałów ENaC należy użyć roztworu do kąpieli w mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 MgCl2 i 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Przeprowadź konwencjonalny eksperyment z zaciskiem krosowym w trybie podłączonym do ogniwa10. Wybierz komórkę w monowarstwie nabłonka i zbliż pipetę do błony wierzchołkowej. Uformuj uszczelnienie o wysokiej wytrzymałości między pipetą a błoną komórkową, stosując delikatne odsysanie. Po uformowaniu uszczelki gigaOhm o wysokiej rezystancji, należy uruchomić protokół bez przerw przy potencjale zatrzymania w celu monitorowania aktywności kanału będącego przedmiotem zainteresowania.
  4. Przechowuj jednokanałowe dane prądowe z uszczelek gigaOhm bez przerw do późniejszej analizy. Analizuj zdarzenia kanału za pomocą pakietu oprogramowania zwykle dostarczanego z konfiguracjami patch-clamp18. Oblicz aktywność kanału jako NPo, gdzie N odnosi się do liczby aktywnych kanałów w łacie, a Po jest średnim prawdopodobieństwem otwarcia kanałów.
    UWAGA: Używaj izolowanych torbieli lub kanalików w eksperymentach z zaciskiem przez nie więcej niż 30 minut.

3. Ratiometryczne pomiary epifluorescencji wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w komórkach nabłonka

  1. Użyj 5 mM Fura-2AM rozpuszczonego w DMSO. Podwielokrotny roztwór podstawowy rozlać na pojedyncze stożkowe probówki o pojemności 500 μl (około 10 μl). Chronić przed światłem i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do sześciu miesięcy.
  2. Inkubować izolowane cysty i rozszczepione kanaliki przez 30-40 minut w PSS (w mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 i 10 HEPES przy pH 7,35) zawierających 5 μM barwnika Fura-2 AM i 0,05% kwasu pluronowego, aby pomóc w dyspersji estrów acetoksymetylowych. W tym celu umieść chusteczki w 3,5 cm naczyniu zawierającym koktajl ładujący, chroń przed światłem i inkubuj na wolnym wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  3. Zmień pożywkę zawierającą Fura-2 AM, aby oczyścić PSS po inkubacji i umieść tkankę pod mikroskopem w celu dalszego wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego.
  4. Włącz kamerę CCD i stabilne źródło światła (system monochromatorowy) wyposażone w koło filtrów (każda pozycja filtra może być powiązana z własnym poziomem tłumienia, wybieranym za każdym razem, gdy filtr jest wywoływany).
  5. Znajdź tkankę w jasnym polu. Przełącz się na wykrywanie sygnału fluorescencji i dostosuj intensywność źródła światła za pomocą filtrów o neutralnej gęstości i mocy lampy, aby uniknąć nasycenia sygnału.
  6. Monitorować fluorescencję Fura-2 AM w próbce tkanki z wzbudzeniem ratiometrycznym przy 340/380 nm z częstotliwością 0,125 Hz lub wyższą. Użyj obiektywu 40×/NA 1.3 lub podobnego, aby uzyskać obraz w odpowiedniej rozdzielczości.
  7. W celu przetwarzania obrazu i obliczeń zaimportuj sekwencję obrazów. Upewnij się, że kanały zostały podzielone i użyj trybu skali szarości hyperstack. Wybierz kilka obszarów zainteresowania (pojedyncze komórki torbieli lub wybrane obszary tkanki torbielowatej) i oblicz wartości intensywności dla każdego kanału (340 i 380 nm) w preferowanym oprogramowaniu do analizy danych; Odejmij wartości intensywności tła od każdego punktu danych.
  8. Dla każdego punktu czasowego oblicz stosunek intensywności kanałów Fura-2 AM 340 do 380. Wykreślić zmiany punktu punktowego/liniowego w czasie stanu nieustalonego Ca2+ dla każdego regionu i obliczyć wartości średniej/SE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Potencjalny udział ENaC w cystogenezie został wykazany w kilku badaniach, w których zaobserwowano zaburzenia sygnalizacji czynnika wzrostu naskórka (EGF) w progresji PKD22-25 oraz nieprawidłowy reabsorpcję sodu w modelach mysich i hodowlach tkankowych ARPKD26-28. Na przykład Veizis et al. wykazali, że w komórkach CD z nieortologicznego modelu mysiego BPK w ARPKD zmniejszona jest zależna od amiloridu absorpcja Na+29. Niedawno udowodniliśmy, że upośledzona reabsorpcja so...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy tutaj zastosowania konwencjonalnej techniki patch-clamp i epifluorescencyjnego obrazowania wapnia do monowarstw nabłonka torbielowatego pochodzących z mysiego modelu genetycznego ARPKD. Protokół składa się z trzech etapów, z których największą uwagę należy zwrócić na izolację torbieli (krok 1.5 sekcji protokołów) oraz na badania elektrofizjologiczne. Te kluczowe procedury wymagają intensywnego szkolenia i cierpliwości, a czytelnik nie powinien być od razu sfrustrowany.

Przede wszyst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Glenowi Slocumowi (Medical College of Wisconsin) i Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) za doskonałą pomoc techniczną przy eksperymentach mikroskopowych. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health granty R01 HL108880 (dla AS), R01 DK095029 (dla OPo) i K99 HL116603 (dla TSP), National Kidney Foundation IG1724 (dla TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (dla OPo) oraz stypendium badawcze Ben J. Lipps z American Society of Nephrology (dla DVI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP4707
Kwas pluronowySigma-AldrichF-68 rozwiązanie
ShakerBoekel Scientific260350
Źródło światłaSutter Instrument CoLambda XLze zintegrowanym sterownikiem migawki/koła filtrów
Filtry o neutralnej gęstościNikonND4, ND8
ObiektywNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22    olej
Aparatfotograficzny Andor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  mikroskop (odwrócony)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Szkło osłonoweThermo Scientific6661B52
Ołówek diamentowyFisher Scientific22268912
Oprogramowanie do akwizycji obrazuNikonNikon NIS-Elements 
Oprogramowanie do analizy obrazuWtyczka ImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility umożliwia importowanie obrazów w natywnym formacie Nikon Instruments .nd2
Komora nagrywająca/perfuzyjnaWarner InstrumentsRC-26
Wzmacniacz Patch ClampUrządzenia molekularneSystem
Urządzenia molekularneDigidata 1440AAxon Digidata® Systemowy
filtr dolnoprzepustowyWarner InstrumentsLPF-88-biegunowe
kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B150F-4
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument CoP-97Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego / brązowego
MicroforgeNarishigeMF-830Japonia
Mikromanipulatorz napędemSutter Instrument CoMP-225
Mikroskop odwróconyNikonEclipse Ti
Stół do izolacji mikrowibracjiTMCwyposażony w klatkę Faradaya
Wielokanałowy system perfuzji zaworówAutoMake ScientificValve Bank II
Komora nagrywająca/perfuzyjnaWarner InstrumentsRC-26
Urządzenia molekularnepClamp 10 . 2
Stół chirurgiczny z kontrolowaną temperaturą Rdzeńdla gryzoni
Lornetkowy stereomikroskopNikonSMZ745
System perfuzyjny oparty na pompie strzykawkowejAparat
rurki polietylenoweSigma-AldrichPE50
Znieczulenie izofluoranowehttp://www.vetequip.com/911103
Inne odczynniki podstawoweSigma-Aldrich
akwizycji danych MultiClamp 700B Bessel Software MCW Harvarda

Bibliografia

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywno kana w jonowychwewn trzkom rkowy wapizolacja monowarstwy torbielowatejrejestracja elektrofizjologicznaobrazowanie wapniamikroskopia konfokalnaadowanie barwnikiem fluorescencyjnym
Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.