Artykuł metodologiczny

Wykonany na zamówienie projekt sondy do mikrodializy

DOI:

10.3791/53048

⸱

21 lipca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodializa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. Dlatego sondy komercyjne są bardzo poszukiwane. W tej pracy szczegółowo wyjaśniono montaż sondy, aby zbudować niezawodną, koncentryczną, wykonaną na zamówienie sondę do mikrodializy za mniej niż 10 USD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodializa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. Dlatego komercyjne sondy są bardzo poszukiwane do monitorowania zmian fizjologicznych, farmakologicznych i patologicznych w płynie mózgowo-rdzeniowym. Niestety, komercyjne sondy są drogie dla grup badawczych w instytucjach publicznych. W tej pracy szczegółowo wyjaśniono montaż sondy, aby zbudować niezawodną, koncentryczną, wykonaną na zamówienie sondę do mikrodializy za mniej niż 10 USD. Sonda do mikrodializy składa się z membrany polisulfonowej o molekularnym odcięciu 30 kDa. Porównano odzysk in vitro substancji o różnej masie cząsteczkowej (w zakresie 100-1 600 Da) i różnych właściwościach fizykochemicznych. Sonda zapewnia odzysk in vitro na poziomie około 20% dla małych związków: glukozy, mleczanu, acetylocholiny i ATP. Odzysk in vitro dla neuropeptydów o masie cząsteczkowej między 1 000-1 600 Da wynosi 2-6%. Tak więc, podczas gdy wyższa masa cząsteczkowa neuropeptydów obniżała wartości odzysku in vitro, dializa związków w niższym zakresie (do 500 Da) mas cząsteczkowych nie ma dużego wpływu na tempo odzysku in vitro. Obecna metoda pozwala na wykorzystanie membrany do dializy z inną wartością odcięcia i materiałem membrany. Dlatego ten wykonany na zamówienie zespół sondy ma tę zaletę, że zapewnia wystarczającą elastyczność do dializy substancji w szerokim zakresie masy cząsteczkowej. Tutaj wprowadzamy sondę do mikrodializy o długości wymiany 2 mm, która ma zastosowanie do mikrodializy w obszarach mózgu myszy i szczurów. Jednak wymiary sondy można łatwo dostosować do większych długości wymiany do stosowania u większych zwierząt.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodializa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. W ciągu ostatnich 50 lat technika małoinwazyjnej mikrodializy była stale ulepszana, aby stać się dobrze znaną metodą monitorowania lokalnych stężeń związków o małej masie cząsteczkowej w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Prawie każdy śródmiąższowy płyn tkankowy można zbadać u swobodnie poruszających się zwierząt.

Gaddum wprowadził technikę push-pull w latach 60. Zmodyfikował podejście Feldberga i wsp., w którym tubokuraryna była perfuzjowana przez kaniulę kończącą się w komorze bocznej i zbierająca ścieki również przez kaniulę1. Gaddum opracował technikę push-pull, w której kaniula składająca się z dwóch koncentrycznych stalowych igieł została wszczepiona w różne obszary mózgu i ukrwiona roztworem, jednocześnie usuwając neuroprzekaźniki uwolnione z neuronów otaczających końcówkę2. Niestety, uszkodzenia tkanek spowodowane przez kaniulę wokół końcówki ograniczyły zastosowanie tej metody. Jako dalszy postęp tej metody, Bito i współpracownicy wprowadzili metodę worka do dializy, w której pobrany roztwór został oddzielony od otaczającej tkanki za pomocą membrany dializowej. Wszczepili worek dializacyjny do tkanki podskórnej szyi psa. Zawartość worka do dializy nie zawiera białka i może być analizowana wiele tygodni później pod kątem jonów i aminokwasów3. Kolejnym wynalazkiem była dialytroda, prymitywna sonda do mikrodializy, która została pierwotnie opisana przez Delgado w 1972 roku. Wreszcie, Ungerstedt i współpracownicy udoskonalili konstrukcję sondy do mikrodializy, tak aby była mniejsza i przemieszczała mniej tkanki5.

Koncentryczna sonda do mikrodializy zachowuje się podobnie do naczynia włosowatego. System jest stale perfuzjowany przez roztwór o składzie jonowym otaczającego płynu tkankowego, przy jednoczesnym braku interesującego go analitu. Błona dializacyjna wystawiona na działanie zewnętrznego roztworu lub tkanki jest półprzepuszczalna. Umożliwia bierną dyfuzję substancji do sondy wzdłuż ich gradientu stężeń6. Przepuszczalność zależy od wielu zmiennych, takich jak masa cząsteczkowa, kształt, ładunek i pH związku. Jest również ograniczony ze względu na właściwości materiału membrany, wielkość porów membrany i natężenie przepływu7.

Rysunki 1 i 2 pokazują koncentryczną sondę do mikrodializy. Płyn perfuzyjny dostaje się przez rurkę wlotową do metalowej tulei, która otacza stopioną krzemionkę. Wewnątrz metalowej tulei spływa w dół wzdłuż stopionej krzemionki i pozostawia ją na swoim końcu. W przestrzeni między membraną dializacyjną a rurką z politetrafluoroetylenu (PTFE) (taką jak teflon) płyn perfuzyjny przepływa następnie w górę. Tutaj zachodzi dyfuzja substancji z tkanki, które otaczają błonę. Dializat opuszcza sondę przez rurkę PTFE, która jest podłączona do rurki wylotowej i może być zbierana.

Technika mikrodializy ma kilka zalet w porównaniu z innymi technikami in vivo. Sonda stanowi fizyczną barierę, w wyniku czego dialilat nie zawiera enzymów ani komórek. W związku z tym nie ma potrzeby oczyszczania eluatu przed analizą i nie zachodzi enzymatyczna degradacja analitów. Degradacja oksydacyjna może wystąpić podczas przechodzenia analitów w rurce, ale często można temu zapobiec, dodając przeciwutleniacz (np. kwas askorbinowy) do perfuzatu. Alternatywnie, uszkodzenia oksydacyjne neuropeptydów, na przykład, zostały skutecznie stłumione poprzez zastąpienie rurki wylotowej końcówką do zbierania dializatu8. Dializat może być badany bezpośrednio za pomocą prawie każdej metody analitycznej, a wiele analitów może być pobieranych jednocześnie. System ten może być stosowany u obudzonych zwierząt i można zbadać prawie wszystkie obszary mózgu. Ponadto możliwy jest wlew leków przez sondę (retrodializa). Istnieją jednak również ograniczenia techniki mikrodializy. Nieco niska rozdzielczość czasowa nie dostarcza informacji w czasie rzeczywistym dotyczących zmian neuroprzekaźników. Ponieważ jest to technika inwazyjna, implantacja sondy powoduje uraz chirurgiczny i znieczulenie, które może wpływać na stężenie neuroprzekaźników, jest wymagane na tym etapie7,9,10.

Stężenie związku w dializacie stanowi tylko niewielką ilość rzeczywistego stężenia związku w płynie pozakomórkowym. W celu obliczenia nieznanego stężenia związku w płynie zewnątrzkomórkowym należy obliczyć względne odzysk in vitro. Przed rozpoczęciem doświadczenia in vivo konieczne jest określenie indywidualnych względnych poziomów odzysku in vitro dla każdej sondy i każdego związku. W tym celu sondę zanurza się w roztworze zawierającym interesujący nas analit, podczas gdy płyn perfuzyjny jest tym samym roztworem, w którym brakuje interesującego go analitu. Po określeniu stężeń związków w dialiacie, dane te należy odnieść do ich stężenia w otaczającym płynie. Oznaczenia odzysku in vitro kilku substancji mogą być realizowane jednocześnie9.

Wiele grup badawczych zajmujących się neuronauką wykorzystuje technikę mikrodializy do badania neuroprzekaźników i metabolitów w przestrzeni zewnątrzkomórkowej różnych obszarów mózgu. W związku z tym sondy komercyjne są bardzo poszukiwane w środowisku badawczym neurobiologii. Dużą zaletą dostępnych na rynku sond jest wysoka niezawodność działania. Konfiguracja eksperymentalna dla sond komercyjnych jest dobrze ugruntowana i zwalidowana dla wielu dobrze znanych neuroprzekaźników i metabolitów. Jednakże, podczas gdy dostępny na rynku sprzęt do mikrodializy jest drogi i ma mniejszą elastyczność w zastosowaniu11, w tej pracy szczegółowo przedstawiono zespół sondy do mikrodializy, który można dostosować do dowolnego zastosowania i można go wyprodukować za mniej niż 10 USD. Ta wykonana na zamówienie sonda jest koncentryczną sondą do mikrodializy testowaną pod kątem badań w różnych obszarach mózgu8.

Porównano odzysk z sondy in vitro substancji o różnej masie cząsteczkowej (zakres 100-1,600 Da) i o różnych właściwościach fizykochemicznych. Przeprowadza się odzyskiwanie in vitro oznaczania glukozy, mleczanu i acetylocholiny o masie cząsteczkowej mniejszej niż 200 Da, ATP o masie cząsteczkowej około 500 Da oraz neuropeptydów angiotensyny II, substancji P i somatostatyny o masie cząsteczkowej powyżej 1 000 Da.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie rurki PTFE

  1. Skróć rurkę PTFE do 2.5 cm kawałka. Użyj papieru skalowego, aby oszacować wymiary fizyczne. (Patrz Rysunek 3a)
  2. Przyciąć jeden koniec pod kątem, aby ułatwić podłączenie rurki wylotowej. (Patrz Rysunek 3a)
  3. Rurki PTFE należy zszorstkować papierem ściernym, aby umożliwić przyleganie kleju epoksydowego.

2. Przygotowanie stopionej krzemionki

  1. Stopioną krzemionkę skrócić na kawałek o długości 2,25 cm. (Patrz Rysunek 3a)

3. Wkładanie stopionej krzemionki do rurki PTFE

  1. Włóż kaniulę 30 G do pustego włókna PTFE, aby przebić je w odległości 1 cm od płaskiego końca. Zegnij rurki PTFE, aby uprościć proces. (patrz rysunek 3b)
  2. Włóż stopioną krzemionkę do rurki PTFE, używając kaniuli jako prowadnicy. (patrz rysunek 3c)
  3. Delikatnie wyjmij kaniulę i zabezpiecz stopioną krzemionkę. (patrz rysunek 3d)
  4. Stopiona krzemionka powinna wystawać 5 mm na płaskim końcu. (patrz rysunek 3e)
  5. Przyklej stopioną krzemionkę w miejscu nakłucia za pomocą kleju cyjanoakrylowego i pozwól jej stwardnieć przez noc. (patrz rysunek 3e)

4. Przygotowanie kleju epoksydowego (kleju dwuskładnikowego)

  1. Dodaj 30 części żółtego utwardzacza do 70 części czarnego kleju epoksydowego za pomocą cienkiej igły i delikatnie wymieszaj. Jest bezpośrednio gotowy do użycia.

5. Nakładanie membrany (wszystkie dalsze kroki muszą być wykonywane pod mikroskopem, a do oszacowania wymiarów fizycznych używa się papieru skalowego)

  1. Ostrożnie przeciągnij membranę polisulfonową po stopionej krzemionce, a następnie wciągnij membranę do rurki PTFE i wyreguluj membranę do 5,5 mm za pomocą ostrego skalpela. (patrz rysunek 3f)
  2. Ustaw punkt znakowania na membranie za pomocą cienkiego pisaka, aby określić długość wymiany wynoszącą 2 mm od końca membrany.
  3. Nałóż niewielką ilość kleju epoksydowego, aby pokryć końcówkę membrany za pomocą cienkiej igły. (patrz rysunek 3g)
  4. Zamknąć połączenie między membraną dializacyjną a włóknem PTFE za pomocą tej samej cienkiej igły, która została użyta w kroku 5.3) za pomocą kleju epoksydowego. (patrz rysunek 3g)
  5. Nałóż wystarczającą ilość kleju epoksydowego na membranę do punktu znakowania, aby zapewnić długość wymiany 2 mm. Pozostaw do stwardnienia na noc. (patrz rysunek 3g) Przed określeniem długości wymiany membrana wynosi 5,5 mm. Po nałożeniu kleju epoksydowego na membranę, tylko 2 mm membrany jest dostępne do dyfuzji.

6. Nakładanie metalowej tulei

  1. Pokrój igłę 25 G na 1 cm metalowe kawałki tulei za pomocą szczypiec do gięcia.
  2. Pociągnij metalową tuleję o długości 1 cm (25 G) na pozostałą część stopionej krzemionki. Metalowa tuleja umożliwia później połączenie rurki dopływowej z sondą do mikrodializy. (patrz rysunek 3h)
  3. Uszczelnij połączenie między metalową tuleją a rurką PTFE pozostałym klejem epoksydowym. Pozostaw do stwardnienia na co najmniej 24 godziny (patrz Rysunek 3i)
  4. Nakładanie gorącego kleju wokół rozwidlenia sondy w celu dodatkowego zamocowania i stabilizacji.
    UWAGA: Wewnętrzna objętość wlotu sondy wynosi 0,045 μl, a wewnętrzna objętość wylotu wynosi 2,5 μl. W związku z tym, przy natężeniu przepływu 1 μl/min, rozpoczęcie pobierania dializatu zajmuje około 2,5 minuty po podłączeniu rurki wlotowej. Dzięki obecnemu protokołowi, procedura montażu sondy pozwala uzyskać sondy do mikrodializy, które są w 95% niezawodne.

7. Przeprowadzanie eksperymentów z odzyskiwaniem in vitro

  1. Zanurzyć sondę z odcięciem 30 kDa i długością wymiany 2 mm w roztworze podstawowym złożonym z aCSF zawierającego 1 mM glukozy i 1 mM mleczanu, a w oddzielnym doświadczeniu, w płynie mózgowo-rdzeniowym zawierającym 100 nM ATP i 100 nM acetylocholiny.
  2. Wykonaj fuzję sond za pomocą aCSF. Ustawić natężenie przepływu na 1 μl/min i przeprowadzać eksperymenty w temperaturze pokojowej (22 °C). Pozostawić sondy do zrównoważenia przez 1 godzinę w roztworze podstawowym, a następnie zbierać próbki co 30 minut i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pomiaru.
  3. W celu obliczenia odzysku in vitro należy porównać stężenia analitów w dializatach ze znanymi stężeniami analitów w roztworze podstawowym. Wyraż wyniki w procentach stężenia substancji w dializacie w porównaniu z roztworem podstawowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koncentryczna, wykonana na zamówienie sonda do mikrodializy składa się z membrany polisulfonowej z molekularnym odcięciem 30 kDa. Zespół sondy pokazano na rysunku 3.

Wykazał odzysk in vitro dla małych metabolitów energetycznych glukozy (180,16 Da) i mleczanu (112,06 Da) odpowiednio 19,10 ± 1,2% i 21,2 ± 1,6%. Dla dodatnio naładowanej acetylocholiny o masie cząsteczkowej 181,66 Da wykazała ona wartość odzysku in vitro wynoszącą 22,6 ± 1,4%. ATP o masie cząstec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 przedstawia przykładowy montaż sondy. W przypadku przewodów należy ściśle przestrzegać prawidłowych wymiarów średnicy wewnętrznej i zewnętrznej (średnica zewnętrzna 1,6 mm; ID 350 μm), stopiona krzemionka (OD 105 μm; ID 40 μm) i membrana do dializy (OD 245 μm; ID 210 μm). Ważne jest również, aby zachować przestrzeń między membraną a stopioną krzemionką (105 μm) oraz między membraną a rurką (105 μm). Jeśli wartości się różnią, ciśnienie w sondzie może wzrosnąć i doprowadzić do nieszczelności mem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni G. Barce (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Niemcy) za wsparcie i dostarczenie kleju epoksydowego. Ponadto autorzy dziękują firmie Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Niemcy) za dostarczenie kapilarnego filtra hemodialogicznego FXCorDiax. Dofinansowanie uzyskano z Uniwersytetu Goethego we Frankfurcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klej epoksydowySunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Niemcy     
Krzemionka topiona ID 40 i mikro; m OD 105 &mikro; mZiemer-Chromatographie, Mannheim, NiemcyArt. Nr artykułu: 6.040105
Membrana polisulfonowa (filtr hemodializy FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, NiemcyREF: F00001593
Klej cyjanoakrylowy (Pattex® superglue plastic)Henkel AG&Co. KGaA, Dü sseldorf, Niemcy
Rurka teflonowa 1,6 x 0,35 mmSunChrom® GmbH, Friedberg, NiemcyArt. Nr: 969-195.219
Skalpel (Feather® Ostrze chirurgiczne nr 10)pfm medical ag, Kolonia, NiemcyArt. Nr artykułu: 07310
MikroskopMEIJI Techno EMZ-8TR
Kaniula 30 G x 11" (0,3 x 25 mm)  Sterican® ZB.Braun Melsungen AG, Melsungen, NiemcyREF: 9324500
Kaniula 25 G x 11/2" (0,5 x 40 mm) 100 Sterican®B.Braun Melsungen AG, Melsungen, NiemcyREF: 9186166
Cienkie pióro (Stabilo point 88 fine 0,4)Schwan-STABILO Schwanhä uß er GmbH & Co. KGArt. Nr artykułu: 88/36
Gorący klej  (Klej w sztyfcie ULTRA Power x 11 mm)Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, NiemcyArt. Nr: 4007841046910
Papier ścierny P60 230 x 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, NiemcyNumer katalogowy: 2608605397

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Custom Microdialysis ProbePolysulfone MembranePTFE TubingFused SilicaEpoxy GlueMetal SleeveIn Vitro RecoveryMolecular Weight CutoffExchange LengthNeuropeptide Detection

Powiązane artykuły