Rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży

Podsumowanie

Przedstawiono metodę rozprzestrzeniania się chromosomów powierzchniowych z pączkujących drożdży. Metoda ta wywodzi się z metody opisanej wcześniej przez Loidla i Kleina. Ponadto demonstrujemy procedurę barwienia immunologicznego chromosomów rozsianych.

Streszczenie

Mały rozmiar jąder pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae ogranicza użyteczność mikroskopii świetlnej do analizy subjądrowej dystrybucji białek związanych z chromatyną. Rozprzestrzenianie się powierzchniowe jąder drożdży powoduje ekspansję chromatyny bez utraty związanych białek. Metoda rozprowadzania powierzchniowego równoważy utrwalanie białek związanych z DNA z obróbką detergentem. Przedstawiona metoda jest nieznacznie zmodyfikowana w stosunku do metody opisanej przez Josefa Loidla i Franza Kleina^1,2. Metoda ta została wykorzystana do scharakteryzowania lokalizacji wielu białek związanych z chromatyną na różnych etapach mitotycznego cyklu komórkowego, ale jest szczególnie przydatna do badania mejotycznych struktur chromosomowych, takich jak rekombinsomy mejotyczne i kompleks synaptonemalny. Opisujemy również modyfikację, która nie wymaga użycia Lipsolu, zastrzeżonego detergentu, który był wymagany w pierwotnej procedurze, ale nie jest już dostępny na rynku. Opisano również protokół barwienia immunologicznego, który jest zgodny z metodą rozprzestrzeniania chromosomów.

Wprowadzenie

Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae oferują wiele korzyści do badań nad molekularnymi mechanizmami procesów biologicznych, w tym do badania białek kontrolujących funkcję chromosomów. Chociaż istnieją dobrze znane zalety pączkujących drożdży w badaniach genetycznych, molekularnych i biochemicznych, badania cytologiczne rozmieszczenia białek w jądrze komórkowym są skomplikowane ze względu na ich niewielkie rozmiary. Typowe jądro drożdży ma średnicę mniejszą niż jeden mikron, czyli tylko około 5 razy większą od granicy rozdzielczości światła widzialnego. W związku z tym ilość informacji na temat rozmieszczenia białek jądrowych, które można uzyskać z konwencjonalnego barwienia immunologicznego lub przy użyciu fluorescencyjnych znaczników białkowych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP), jest ograniczona. Użytecznym podejściem do scharakteryzowania subjądrowej dystrybucji białek jest rozprzestrzenianie się powierzchni chromosomów. Podejście to polega na usunięciu ściany komórkowej, rozerwaniu błon komórkowych i jądrowych oraz umożliwieniu nierozpuszczalnej zawartości jądra osadzenia się na powierzchni szkiełka mikroskopowego. Te nierozpuszczalne składniki obejmują macierz jądrową i chromosomy. Oprócz umożliwienia usunięcia rozpuszczalnej zawartości jądrowej, co zwiększa zdolność wykrywania białek związanych z chromatyną, metoda rozprzestrzeniania chromosomów powoduje znaczną dekompresję chromosomów, tak że rozproszone jądra mają średnicę około 3 do 5 μm (dla diploidalnych jąder mejotycznych) i od 2 do 3 μm dla diploidalnych jąder mitotycznych. Ta dekompresja pozwala na wykrycie podstruktury jądrowej, która jest stosunkowo trudna lub niemożliwa do rozdzielenia w nienaruszonych jądrach.

Oczywistym mankamentem rozprzestrzeniania chromosomów jest możliwość, że procedura rozprzestrzeniania się może częściowo lub całkowicie zakłócić strukturę zainteresowania. Szczególne zaniepokojenie budzi fakt, że w wyniku procedury rozprzestrzeniania się może dojść do utraty określonego białka związanego z chromosomem. O tej potencjalnej komplikacji należy pamiętać podczas interpretacji danych. Jednym z przykładów białka, które jest wrażliwe na procedurę rozprowadzania, jest beta-tubulina. W pewnych warunkach wrzeciono, które składa się głównie z tubuliny, jest zachowywane podczas rozprowadzania³. Wizualizacja wrzeciona jest często przydatna do etapowania jąder będących przedmiotem zainteresowania. Jednak wizualizacja tubuliny wymaga leczenia utrwalaczem o wysokim stężeniu; Wrzeciona są tracone w standardowych warunkach opisanych poniżej. Przykład ten ilustruje, że podczas analizy rozkładu wcześniej niescharakteryzowanego białka ważne jest, aby zmieniać stężenie utrwalacza, aby określić, jak wrażliwe jest białko na taką zmienność. Pomimo obaw związanych z wpływem warunków rozprzestrzeniania się na strukturę chromosomów, użyteczność i moc metody rozprzestrzeniania się została wykazana w wielu kontekstach i ma szerokie zastosowanie w charakterystyce komórek mitotycznych, a zwłaszcza mejotycznych^4-7.

Dwie metody rozprzestrzeniania były szeroko stosowane. Pierwsza z tych metod, opracowana przez Dressera i Giroux⁸, pozwala uniknąć użycia detergentu i może dać preparaty do rozprzestrzeniania się, które wydają się mieć stosunkowo dobrze zachowaną morfologię chromosomów po wybarwieniu na obecność barwnika specyficznego dla DNA DAPI. Jednak metoda ta jest stosunkowo trudna do udoskonalenia, a jakość rozproszonych jąder różni się dramatycznie, gdy jeden obszar szkiełka jest porównywany z innymi regionami. Problem ten może komplikować podejścia ilościowe, które obejmują obrazowanie wielu niewybranych jąder z jednego szkiełka, aby uniknąć błędu systematycznego w pozyskiwaniu danych. Druga metoda rozprzestrzeniania chromosomów, opracowana przez Loidla i^Kleina1, polega na równoważeniu utrwalania przez paraformaldehyd z lizą i dekompresją chromatyny wspomaganą przez roztwór detergentu. Prawidłowo wykonana metoda daje bardzo powtarzalne wyniki z mniejszą zmiennością między regionami w porównaniu z metodą Dressera i Giroux. Niniejsza prezentacja skupia się na zmodyfikowanej wersji metody Loidla i Kleina, ze względu na jej niezawodność i prostotę.

Rozprzestrzenianie chromosomów nie jest skomplikowane ani czasochłonne; można przygotować do 100 preparatów do barwienia immunologicznego w ciągu jednego dnia. Co więcej, preparaty do rozprzestrzeniania się mogą być przechowywane w zamrażarce przez wiele lat przed barwieniem immunologicznym, a tym samym laboratoria mogą opracować repozytorium zamrożonych chromosomów, które można wykorzystać, gdy pojawią się nowe pytania biologiczne lub dostępne staną się nowe odczynniki barwiące.

Metoda rozprzestrzeniania chromosomów jest najczęściej stosowana w połączeniu z immunobarwieniem i szerokopolową mikroskopią fluorescencyjną, ale możliwe jest również przygotowanie preparatów do superrozdzielczych metod mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia STED (Stimulated emission depletion).

Protokół

UWAGA: Niektóre kroki poniższego protokołu wymagają pracy w czystym dygestorium. Ponadto metoda wymaga mikroskopu tetradowego do rozwarstwiania drożdży wyposażonego w 10-krotnie długi obiektyw odległości roboczej do monitorowania sferoplastyki. Mikroskop należy wcześniej ustawić w okapie. Zdejmij ramię mikromanipulatora i uchwyt płytki z lunety i umieść te przedmioty w bezpiecznym miejscu, z dala od obszaru roboczego.

1. Przygotowanie sferoplastów

1. Uprawiaj drożdże w pożądanych warunkach. Na każdą próbkę należy użyć około 2 x 10⁸ komórek, np. 4 ml kultury o OD600 1,4 = 5 x 10⁷ komórek/ml. Chociaż w niektórych przypadkach preferowane może być natychmiastowe przetwarzanie próbek, w większości zastosowań podwielokrotności komórek mogą być przechowywane na lodzie do 8 godzin przed przetworzeniem.
2. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w wirówce klinicznej przy ustawieniu 5 (2345 obr./min/857,5 x g) przez 3 minuty w celu osadzenia komórek.
3. Zdekantować pożywkę, uważając, aby nie stracić komórek z osadu. Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml buforze ZK, a następnie dodać 40 μl 1 M ditiotreitolu (DTT). Inkubować 2 minuty z delikatnym mieszaniem. Ogniwa osadkowe jak poprzednio (patrz krok 1.2).
4. Zawiesić granulki w 1 ml buforze ZK. Dodać 5 μl świeżo przygotowanego roztworu zymoliazy 100T, który został dokładnie wymieszany. Inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 30 °C w celu usunięcia ściany komórkowej i wytworzenia sferoplastów.
5. Oznaczyć 10 μl kropli zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym, aby określić, czy sferoplastyzacja jest kompletna. Komórki oglądane pod mikroskopem preparacyjnym bez szkiełka nakrywkowego. Komórki powinny wydawać się wzdęte i okrągłe, a nie lekko podłużne i powinny ulec lizie po dodaniu 20 μl wody. Jeśli komórki nie ulegną lizie, należy przywrócić próbkę do temperatury 30 °C i ponownie oznaczać co 10 minut, aż do momentu, gdy będzie można łatwo zaobserwować lizę wywołaną wodą. Ogniwa osadkowe jak poprzednio (patrz krok 1.2).
6. Delikatnie zawiesić i przepłukać osad komórkowy w 2,5 ml zimnego buforu MES/sorbitol. Ogniwa osadkowe jak poprzednio (patrz krok 1.2). Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 300-400 μl zimnego buforu MES/sorbitolu. Na tym etapie komórki można przechowywać na lodzie przez kilka godzin.

2. Rozprzestrzenianie się chromosomów

UWAGA: Szklane powierzchnie, na których będą rozkładane chromosomy - czy to szkiełka, czy szkiełka nakrywkowe - powinny być przygotowane z wyprzedzeniem. Każde szkiełko lub szkiełko nakrywkowe należy zanurzyć w wodzie, następnie EtOH, następnie pozostawić do wyschnięcia i wypolerować papierem do soczewek. Jeśli chromosomy będą rozsiewane na szkiełkach nakrywkowych, szkiełko nakrywkowe powinno być przymocowane do szkiełka za pomocą taśmy klejącej lub cementu kauczukowego. O ile nie zaznaczono inaczej, pozostała część protokołu będzie opisywać rozprzestrzenianie się na szkiełku podstawowym lub nakrywkowym

1. Za pomocą pipetora P20 odpipetować 20 μl zawiesiny komórek na powierzchnię czystego szkiełka.
2. Za pomocą pipetora P200 dodaj 40 μl 3% roztworu PFA/sacharozy i delikatnie wymieszaj roztwór, "obracając" szkiełko ręką, aż znikną linie Schlièrena. Umieść szkiełko pod mikroskopem i upewnij się, że komórki są ostre. Roztwór PFA powinien być świeżo przygotowany w dygestoriach w dniu użycia.
   UWAGA: Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania nie było wcześniej badane tą metodą, zaleca się przygotowanie dodatkowych szkiełek przy użyciu roztworów zawierających 2 i 4% PFA w celu określenia, czy retencja białka jest wrażliwa na warunki wiązania. 4% roztwór PFA/sacharozy stosuje się w przypadkach, gdy pożądane jest uwidocznienie powiązanych mikrotubul tubuliny. Wadą wyższego stężenia utrwalającego jest to, że chromosomy będą "niedostatecznie rozpowszechnione", 2% PFA ma również tendencję do tworzenia chromosomów "niedostatecznie rozpowszechnionych".
3. Za pomocą pipetora P200 dodać 80 μl 1% Lipsolu, zamieszać jak poprzednio, aby jak najpełniej wymieszać roztwory, uruchomić timer. Jeśli produkt Lipsol nie jest dostępny, można zastąpić go 80 μl 1% NP40 lub 80 μl dH₂O (patrz wyniki reprezentatywne, rysunek 2).
4. Uważnie obserwuj komórki i delikatnie obracaj szkiełko co 15 sekund. Gdy około 80% komórek ulegnie lizie (zniknie), zatrzymaj timer, natychmiast wyjmij szkiełko z mikroskopu, dodaj 80 μl roztworu PFA/sacharozy i zamieszaj do wymieszania. Liza powinna nastąpić od 30 do 90 sekund po uruchomieniu timera.
   UWAGA: Jeśli kilka szkiełek wykazuje lizę mniej więcej w tym samym czasie, można ostatecznie pominąć monitorowanie mikroskopowe dla pozostałej części szkiełek i po prostu dokładnie określić czas między dodaniem lipsolu a dodaniem ostatniej porcji utrwalacza. Jednak ten skrót jest niezawodny tylko w przypadku przygotowywania wielu preparatów z tej samej próbki. Najlepiej jest monitorować lizę każdej próbki pod mikroskopem, gdy z próbek pobranych w różnym czasie lub z różnych kultur przygotowywane są różne preparaty.
5. Umieść szkiełko na czystej, płaskiej powierzchni i rozprowadź płyn na całej nieoszronionej powierzchni szkiełka za pomocą boku czystej, jednorazowej pipety pastwiskowej trzymanej poniżej menisku "kałuży", ale powyżej powierzchni samego szkiełka, tj. nie "grabić" powierzchni szkiełka pipetą. Nie należy ponownie używać pipet na różnych szkiełkach, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek.
6. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w dygestorium. Nierozpuszczalne składniki jądrowe osiądą na powierzchni szkiełka i zwiążą się z nią. W przypadku dużych eksperymentów ważne jest zaplanowanie wykorzystania przestrzeni na etapie suszenia.
7. Po wysuszeniu optymalne wyniki uzyskuje się poprzez przejście do etapu barwienia immunologicznego tego samego dnia. Jednak wysuszony roztwór sacharozy osadza rozproszone chromosomy w "miodzie", który umożliwia zamrażanie próbek: szkiełka można przenieść do plastikowego pudełka na szkiełka i przechowywać w temperaturze -20 °C przez lata.

3. Barwienie immunologiczne

1. Zanurz szkiełka w 0,2% Photo-Flo na 30 sekund, aby usunąć miód. Oprzyj ślizgi na krawędzi, tak aby krawędź spoczywała na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki Photo-Flo.
2. Zanurz szkiełka w 1x TBS na 5 minut do umycia. Usuń nadmiar płynu, opierając szkiełka o krawędź, ale nie pozwól im wyschnąć.
3. Ułóż szkiełka matową stroną do góry, odpipetuj 300 μl TBS/BSA na szkiełko w poprzek nieoszronionej części szkiełka.
4. Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut (duży plastikowy pojemnik wyłożony nasączonymi wodą ręcznikami papierowymi pod perforowaną metalową płytką lub plastikowym pudełkom na suwak z nasyconymi ręcznikami papierowymi).
5. Opróżnij szkiełka, opierając krótszą krawędź szkiełka na ręczniku papierowym i opierając szkiełko o odpowiednie podparcie (takie jak stojak na probówki). Nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni.
6. Natychmiast zastosować 80 μl buforu TBS/BSA zawierającego odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego. Jeśli przeciwciało jest ograniczone, należy użyć 40 μl i szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 x 22 mm. W przypadku surowej surowicy króliczej jest to zwykle rozcieńczenie od 1/50 do 1/500.
   UWAGA: Wykonać miareczkowanie dla nowych preparatów przeciwciał. Wybiera się najbardziej rozcieńczony preparat, który daje wysoki sygnał powyżej tła. W celu kontroli poziomu zabarwienia tła, jądra powinny być przygotowane z odpowiedniego zmutowanego szczepu delecji i/lub zduplikowane preparaty powinny być wybarwione surowicą przedimmunologiczną.
7. Umieść polerowane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 50 mm na szkiełku, unikając pęcherzyków powietrza. W tym celu należy przytrzymać szkiełko nakrywkowe między kciukiem a palcem wskazującym wzdłuż długiej krawędzi w pobliżu jednej krótkiej krawędzi. Trzymając szkiełko nakrywkowe pod kątem 30° w stosunku do szkiełka, krótsza krawędź znajdująca się najdalej od palców jest opuszczana, aż spocznie na szkiełku tuż wewnątrz krawędzi "kałuży" znajdującej się najbliżej oszronionego obszaru szkiełka. Następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe płynnym ruchem, aż palce trzymające szkiełko dotkną ławki, a następnie zwolnij. Nie próbuj zmieniać położenia szkiełka nakrywkowego po jego wylądowaniu.
   UWAGA: Jeśli spready chromosomowe zostały przygotowane na przymocowanych szkiełkach nakrywkowych (a nie bezpośrednio na powierzchni szkiełek), to szkiełko nakrywkowe z próbką pozostanie przymocowane do szkiełka przez cały okres barwienia i mycia. Dodatkowe szkiełko nakrywkowe zostanie umieszczone na wierzchu szkiełka nakrywkowego z próbką w celu równomiernego rozprowadzenia roztworu przeciwciała podczas barwienia, a następnie zostanie wyrzucone.
8. Umieścić szkiełka w szczelnie zamkniętej komorze wilgotnej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
9. Trzymając matową krawędź, przenieś szkiełka do szklanego stojaka do barwienia szkiełek i zanurz w słoiku do barwienia zawierającym TBS.
10. Delikatnie zanurz szkiełko w górę i w dół, aby zdjąć szkiełko nakrywkowe. Staraj się nie używać do tego zbyt dużej siły. Umyj szkiełka 2x 10 min, zanurzając je w TBS. Wyjmij szkiełka z rusztu i odcedź nadmiar płynu, dotykając krawędzią ręcznika papierowego. Nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni.
11. Pracując w przytłumionym świetle, natychmiast dodać 80 μl TBS/BSA zawierających 1/1,000 krotne rozcieńczenie drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem (lub 40 μl z szkiełkiem nakrywkowym 22 x 22 mm). Dodać szkiełko nakrywkowe jak poprzednio i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w wilgotnej komorze w ciemności.
12. Usuń szkiełka nakrywkowe jak poprzednio, odcedź szkiełka i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu przez 1 do 2 godzin w ciemności. Oprzyj ślizgi na ręcznikach papierowych jak poprzednio.
    UWAGA: Jeśli rozprowadzanie odbywało się na zamontowanym szkiełku nakrywkowym, należy je zdjąć z szkiełka przed wyschnięciem. Szkiełka nakrywkowe są następnie suszone zgodnie z opisem dla szkiełek w poprzednim kroku.
13. Pracując przy przytłumionym świetle, dodać około 30 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (trzy krople po 10 μl), a następnie ostrożnie opuścić szkiełko nakrywkowe. Jeśli pasty do smarowania znajdują się na szkiełkach nakrywkowych, umieść kropelki podłoża montażowego na czystym szkiełku podstawowym i opuść szkiełko nakrywkowe, chromosomem do dołu, na szkiełko.
14. Nadal przy przytłumionym świetle odczekaj 2 minuty, aż szkiełko nakrywkowe opadnie i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Umieść szkiełka w płaskim pudełku na slajdy.
    UWAGA: W przypadku mikroskopii STED mocuj za pomocą ProLong Gold. Użyj 30 μl ProLong Gold bez DAPI i pozostaw do utwardzenia na noc. Uszczelnianie lakierem do paznokci nie jest konieczne.
15. Przeglądaj slajdy za pomocą szerokokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej z obiektywem 40 lub 100X przy użyciu zestawu filtrów odpowiedniego dla DAPI do ustawiania ostrości. Opcjonalnie szkiełko można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Nie zamrażać.

Wyniki

Wygląd rozprzestrzenionych jąder krytycznie zależy od równowagi między fiksacją chromosomów a ich dekompaktacją. Nawet przy prawidłowo dobranych odczynnikach, w różnych obszarach tego samego preparatu i/lub pomiędzy różnymi preparatami mogą wystąpić różnice w stopniu dekompaktacji chromosomów. W związku z tym, przed interpretacją obrazów należy ocenić jakość rozprzestrzenienia w danym obszarze preparatu.

Efekty „nadmiernego rozciągnięcia” (overspreading) i „niewystarczającego rozciągnięcia” (u...

Dyskusja

Pojawienie się rozsianych jąder zależy w decydującym stopniu od równowagi między utrwalaniem a obróbką lizą/detergentem. Jak wspomniano powyżej, zachowanie różnych struktur komórkowych wymaga stosowania różnych stężeń PFA. Dla większości białek optymalna jest zawartość 3% PFA. Jednak konserwacja wrzecion wymaga użycia 4% PFA. Nawet przy użyciu jednego zestawu odczynników, czas lizy w stosunku do utrwalenia może również wpływać na jakość rozprzestrzeniających się jąder. Aby uzyskać najbardziej spójne wyniki, czas lizy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zymoliaza	USA Biologiczna	Z1004	Przygotować roztwór o stężeniu 20 mg/ml w 50 mM Tris pH 7,5 uzupełniony o 2% glukozy. Przygotuj świeży każdy eksperyment i przechowuj w temperaturze 4° C, aż będzie gotowy do użycia.
Lipsol	L.I.P. Sp. z o.o.o.	Produkt nie jest już dostępny w sprzedaży	Przygotować 1% (v/v) roztwór w wodzie. Przechowywać na lodzie.
NP-40	USB	19628	Przygotować 1% (v/v) roztwór w wodzie. Przechowywać na lodzie.
Tleen 20	Sigma	P2287
Slajdy	Corning	2948-75x25
Standardowe szkiełko nakrywkowe	Fisher	12-544-E lub 12-540-B
Szkiełka nakrywkowe o wysokiej rozdzielczości	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 roztwór	Kodak	P-7417	Przygotuj 0,2% (v/v) roztwór w wodzie.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Przygotować 1% (w/v) roztwór w TBS. Przechowywać w 4° C przez okres do miesiąca.
Przeciwciało
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
Przeciwciało IgG (H+L)
Pożywka montażowa Vectashield z DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastikowe pudełko na suwak	Fisher	03-448-1	Szkiełka z suszonymi pastami do smarowania należy przechowywać w szczelinach w temperaturze -20& stopni C. Używaj również jako mokrej komory.
Pudełko kartonowe na slajdy	Fisher	12-587-10	Służy do wygodnego transportu poplamionych/zapieczętowanych szkiełek lub przechowywania w temperaturze 4°C.
Słoik Coplin	Fisher	08-816	Służy jako umywalka do zjeżdżalni.

pierwotne