Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

DOI:

10.3791/53225

⸱

11 listopada 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio iPSC przyciągnęły uwagę jako nowe źródło komórek do terapii regeneracyjnych. Chociaż pierwotna metoda generowania iPSC opierała się na fibroblastach skóry uzyskanych w wyniku inwazyjnej biopsji i retrowirusowej insercji genomowej transgenów, podjęto wiele wysiłków, aby uniknąć tych wad. Ludzkie obwodowe limfocyty T są unikalnym źródłem komórek do wytwarzania iPSC. iPSC pochodzące z limfocytów T zawierają rearanżacje genów receptora limfocytów T (TCR) i są źródłem limfocytów T specyficznych dla antygenu. Dodatkowo, rearanżacja receptora limfocytów T w genomie ma potencjał do oznaczania poszczególnych linii komórkowych i rozróżniania komórek przeszczepionych i dawców. Dla bezpiecznego klinicznego zastosowania iPSC ważne jest zminimalizowanie ryzyka narażenia nowo wytworzonych iPSC na działanie czynników szkodliwych. Chociaż płodowa surowica bydlęca i komórki żywicielskie są niezbędne do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, lepiej jest usunąć je z systemu hodowli, aby zmniejszyć ryzyko nieprzewidywalnej patogenności. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół generowania iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai, aby zmniejszyć ryzyko narażenia iPSC na niezdefiniowane patogeny. Chociaż radzenie sobie z wirusem Sendai wymaga sprzętu o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, wirus Sendai infekuje aktywowane limfocyty T bez insercji genomu, ale z wysoką skutecznością. W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmienia przy użyciu kombinacji aktywowanej hodowli limfocytów T i wirusa Sendai.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC przyciągnęły znaczną uwagę jako przełomowe źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej1-3. Do tej pory opisano różne metody generowania iPSC4,5. Wśród nich iPSC generowane z ludzkich limfocytów T cieszą się szczególnym zainteresowaniem ze względu na mniej inwazyjną metodę pobierania próbek komórek6-8. Ponadto iPSC pochodzące z limfocytów T zawierają rearanżacje genu receptora limfocytów T (TCR), a zatem są źródłem limfocytów T specyficznych dla antygenu9,10. Dlatego bezpieczne wytwarzanie iPSC pochodzących z limfocytów T jest przydatne w rozwoju medycyny regeneracyjnej.

Ta metoda opiera się na koncepcji zmniejszania ryzyka nieprzewidywalnej chorobotwórczości. Dla bezpiecznego klinicznego stosowania iPSC ważne jest zmniejszenie ryzyka narażenia na patogeny11. Wcześniej w wielu systemach hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych jako niezbędne odczynniki stosowano płodową surowicę bydlęcą i komórki żywicielskie12. Jednak usunięcie obu tych odczynników z systemu hodowli jest preferowane do wytwarzania iPSC, aby zmniejszyć ryzyko nieprzewidywalnej chorobotwórczości.

Dodatkowo, ta metoda ma tę zaletę, że pozwala uniknąć inwazyjnego pobierania próbek komórek od pacjentów i pracochłonnego przygotowywania komórek zasilających. Ponieważ iPSC pochodzące z limfocytów T są już z powodzeniem stosowane w badaniach nad chorobami13,14, metoda ta ma również zastosowanie i jest przydatna do generowania specyficznych dla choroby iPSC od pacjentów.

Wśród metod przeprogramowania limfocytów T, użycie wektora wirusa Sendai (SeV) jako nośnika genów jest metodą, która może generować iPSC z wysoką wydajnością7,16. Dodatkowo, ponieważ SeV jest jednoniciowym wirusem RNA i nie potrzebuje fazy DNA do replikacji, jego zastosowanie w generowaniu iPSC pozwala uniknąć uszkodzenia genomu gospodarza17-19. Dlatego opracowaliśmy protokoły generowania iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach bez surowicy i bez karmienia przy użyciu kombinacji matrigelu, pożywki mTeSR i wektorów SeV.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie aktywowanych ludzkich limfocytów T

  1. Pobrać 10 ml heparynizowanej krwi pełnej od dawcy przez nakłucie żyły.
    1. Uzyskanie świadomej zgody dawców przed pobraniem żyły. Nakłucie żyły musi być wykonane przez wykwalifikowany i przeszkolony personel.
    2. Z uzyskanymi próbkami krwi należy obchodzić się za pomocą sterylnego sprzętu i zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Rozcieńczyć 10 ml heparynizowanej krwi pełnej w 10 ml D-PBS(–).
  3. Umieścić 15 ml roztworu Ficoll (Ficoll-Paque PREMIUM) w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Nałożyć warstwę 20 ml roztworu krwi przygotowanego w kroku 1.2 na roztwór Ficollu w kroku 1.3. Za pomocą pipety elektrycznej pozwól, aby roztwór krwi przygotowany w kroku 1.2 powoli spływał wzdłuż wewnętrznej ścianki probówki. Należy uważać, aby nie mieszać roztworu krwi z roztworem Ficollu.
  5. Wirować przy 400 × g przez 30 min przy suchym natężeniu ruchu. Ustawić prędkość zwalniania odśrodkowego na "niską".
    Uwaga: Po odwirowaniu między górną mleczną warstwą plazmy a dolną przezroczystą warstwą Ficollu wyłania się biała cienka warstwa. Ta biała cienka warstwa zawiera komórki jednojądrzaste.
  6. Przenieść warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Należy uważać, aby nie dołączyć roztworu Ficoll.
  7. Dodać D-PBS(–) do komórek jednojądrzastych do całkowitej objętości 10 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odrzucić supernatant. Dodać 10 ml D-PBS(–) do komórek jednojądrzastych i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml pożywki KBM502 do pobranych komórek jednojądrzastych i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Ponad 5 × 106 komórek jednojądrzastych można uzyskać z 10 ml heparynizowanej krwi pełnej z odpowiednią separacją za pomocą Ficollu.
  10. Przygotować roztwór przeciwciała anty-ludzkiego CD3 o stężeniu 10 μg/ml w D-PBS(–). Dodać roztwór przeciwciała anty-ludzkiego CD3 do płytki 6-dołkowej, namoczyć powierzchnię każdej studzienki i inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez co najmniej 30 minut.
  11. Usunąć roztwór przeciwciała anty-ludzkiego CD3 z każdej studzienki i przemyć raz D-PBS(–) tuż przed wysiewem komórek.
  12. Jednojądrzaste komórki nasienne, które przygotowano w kroku 1.9 o gęstości 2,5 × 105 komórek/cm2 na 6-dołkowych płytkach pokrytych przeciwciałem anty-ludzkim CD3 w pożywce KBM502. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 3–7 dni bez zmiany pożywki, aż limfocyty T osiągną zbieżność. Limfocyty T w tym okresie są zarówno zawieszonymi, jak i przylegającymi komórkami.

2. Infekuj ludzkie limfocyty T wektorami SeV

  1. Po 3–7 dniach hodowli zebrać aktywowane limfocyty T z istniejącą pożywką przez pipetowanie. Przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć supernatant i dodać 1 ml świeżej pożywki KBM502. Policz komórki i płytkę 1,5 × 106 komórek (w 2 ml świeżej pożywki KBM502) do każdego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej przeciwciałem anty-CD3.
  3. Rozmrozić roztwory SeV OCT3/4-SeV/TSΔF, SOX2-SeV/TSΔF, KLF4-SeV/TSΔF i c-MYC (HNL)-SeV/TS15ΔF na lodzie.
  4. Dodaj roztwory SeV zawierające OCT3/4-SeV/TSΔF, SOX2-SeV/TSΔF, KLF4-SeV/TSΔF i c-MYC (HNL)-SeV/TS15ΔF indywidualnie do studzienek, każdy przy wielokrotności infekcji (MOI) 10. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez kolejne 24 godziny.

3. Usuń wektory SeV z ludzkich komórek T

  1. 24 godziny po zakażeniu zbierz zainfekowane komórki za pomocą pipety. Jeśli istnieją przylegające komórki, można je łatwo odłączyć, wielokrotnie pipetując w górę iw dół. Przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć supernatant zawierający wektory SeV i dodać 2 ml świeżej pożywki KBM502. Ponownie płytkować komórki w każdym z dołków. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% zawartościCO2 przez dodatkowe 24 godziny.

4. Ponowne zasianie komórek na warstwie matrycy

  1. Przygotować roztwór matrycy błony podstawnej, rozmrażając żel do matrycy (patrz Lista materiałów dla konkretnej marki użytej w tym badaniu) w temperaturze 4 °C i rozpuszczając 0,2 ml w 10 ml podłoża DMEM/F12.
    Uwaga: Żel matrycowy (patrz Lista materiałów dla konkretnej marki użytej w tym badaniu) musi rozmrozić O/N w temperaturze 4 °C, aby został całkowicie rozmrożony. Trzymaj go na lodzie do momentu tuż przed użyciem.
  2. Umieść 5 ml roztworu matrycy błony podstawnej na naczynie do szalek o średnicy 100 mm i pozostaw w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed wysiewem komórek. Do jednego eksperymentu potrzebne są co najmniej dwie talerze o średnicy 100 mm.
  3. Zebrać komórki zakażone SeV przez pipetowanie, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć supernatant i dodać 1 ml świeżej pożywki KBM502. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru, usuń roztwór matrycy błony podstawnej ze 100-milimetrowych szalek przygotowanych w kroku 4.2 i podaj 1 × 105 i 1 × 106 komórek (w 10 ml świeżej pożywki mTeSR) na 100-milimetrowych naczyniach pokrytych matrycą z membraną podstawną. Na koniec użyj talerza, na którym łatwo zbiera się kolonie.
  5. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 O/N.
  6. Zmieniaj pożywkę na 10 ml pożywki mTeSR w miąższu co drugi dzień.
    Uwaga: Około 20-30 dni po zakażeniu pojawią się kolonie, które bardzo przypominają embrionalne komórki macierzyste (ESC).

5. Rozwiń iPSC pochodzące z limfocytów T

  1. Przygotować roztwór matrycy błony podstawnej, rozmrażając żel matrycowy (patrz Lista materiałów dla konkretnej marki użytej w tym badaniu) w temperaturze 4 °C i rozpuszczając 0,2 ml w 10 ml pożywki DMEM/F12.
  2. Umieścić 1 ml roztworu matrycy błony podstawnej na studzience na płytce 6-dołkowej i pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed pobraniem kolonii.
  3. Napełnij 96-dołkową płytkę 20 μl pożywki mTeSR na dołek.
  4. Za pomocą pipety 20 μl wybierz kolonie przypominające ESC pod mikroskopem stereoskopowym.
    Uwaga: Kolonie ESC i iPSC są okrągłe i płaskie, jak pokazano na rysunku 1B.
  5. Przenieś wybrane kolonie do 96-dołkowej płytki wypełnionej pożywką mTeSR w kroku 5.3.
  6. Dodać 200 μl pożywki mTeSR do każdej studzienki i ostrożnie pipetować w górę iw dół, aby rozbić kolonię na małe grudki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pipety 200 μl. Wyjąć roztwór matrycy błony podstawnej z dołka przygotowanego w 5.2 i umieścić każdą kolonię w jednym dołku 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej z 2 ml pożywki mTeSR na studzienkę.
  7. Zmieniać pożywkę na 2 ml pożywki mTeSR miąższu co drugi dzień.

6. Utrzymanie iPSC pochodzących z limfocytów T

Komórki iPS pochodzące z limfocytów T mogą być utrzymywane i przechowywane przy użyciu tych samych technik, co w przypadku ludzkich iPSC i ludzkich ESC. Gdy kolonie iPSC dorosną, rozwiń je w większe szalki, powtarzając tę samą procedurę.

  1. Zmieniaj pożywkę mTeSR co 1–2 dni.
  2. Gdy kolonie zlewają się co 5–7 dni, należy przejść komórki za pomocą roztworu dysocjacyjnego dla ludzkich iPSC i ludzkich ESC zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, użytkownicy są w stanie stabilnie generować iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T. Generowanie iPSC z limfocytów T z SeV i matrigelem wykazało około 0,002% - 0,005% skuteczności przeprogramowania komórek pomiędzy kilkoma przypadkami dawcy, a SeV nie zostały wykryte po kilku przejściach16. Rysunek 1A przedstawia schemat protokołu generowania iPSC pochodzących z limfocytów T w warunkach bezzasilających przy użyciu matrigelu i pożywki mTeSR. Około 20-30 dni po zakażeniu SeV, kolonie iPSC są rozpoznawane na podstawie morfologii podobnej do kolonii ESC (Figura 1B). Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło ekspresję typowych pluripotencjalnych markerów komórkowych (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 i TRA-1-81) w iPSC pochodzących z limfocytów T generowanych w warunkach wolnych od zasilania (Figura 1C).

figure-results-1
Rysunek 1. (A): Schemat protokołu przeprogramowania limfocytów T w warunkach wolnych od zasilania w tym badaniu. (B): Typowa kolonia iPSC podobna do ESC w 27 dniu po pobraniu krwi w warunkach wolnych od karmienia. (C): Barwienie ALP i barwienie immunofluorescencyjne dla pluripotencji i markerów powierzchniowych (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 i TRA-1-81) w iPSC pochodzących z limfocytów T generowanych w warunkach bezzasilających. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół generowania iPSC z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach bez surowicy i bez karmienia przy użyciu kombinacji matrigelu, pożywki mTeSR i wektorów SeV. W przypadku zastosowań klinicznych iPSC ważne jest, aby mieć protokół stabilnego generowania iPSC i mniej inwazyjną metodę pobierania próbek komórek. Chociaż wytwarzanie iPSC za pomocą kombinacji matrigelu i pożywki mTeSR wykazało niższą skuteczność przeprogramowania niż w przypadku pożywki zastępującej surowicę nokautującą (KSR) i komórek zasilających, ta kombinacja zapewnia stabilne wytwarzanie iPSC od dawców16. Stabilne wytwarzanie iPSC i mniej inwazyjne pobieranie próbek komórek ma tę zaletę, że jest w stanie zwiększyć liczbę dawców do wytwarzania iPSC.

Wektory SeV, wirus o ujemnej nici RNA, nie jest zintegrowany z genomem gospodarza. W związku z tym ryzyka nowotworzenia można uniknąć na etapie indukcji czynnika przeprogramowania20-24. Dodatkowo, warunki wolne od karmnika, w których wykorzystuje się kombinację zdefiniowanej pożywki hodowlanej i matrycy zamiast warstwy paszowej, umożliwiają zminimalizowanie potencjalnego ryzyka narażenia na nieznane czynniki egzogenne. Połączenie tych technik zapewnia mniej inwazyjną i bezpieczniejszą technologię iPSC dla medycyny regeneracyjnej16.

Ważnymi krokami w tym protokole są etap aktywacji ludzkich limfocytów T (krok 1) i zakażenie ich wektorami SeV (krok 2). Jeżeli w naczyniu hodowlanym nie uzyskano kolonii podobnej do ESC w optymalnym czasie po zakażeniu SeV, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie. Po pierwsze, zbieganie się komórek jednojądrzastych przed aktywacją limfocytów T może nie być odpowiednie, ponieważ optymalna aktywacja limfocytów T ma kluczowe znaczenie dla infekcji SeV25,26. Zbyt duże zagęszczenie komórek jednojądrzastych prowadzi do śmierci komórki, zaburzając prawidłową aktywację limfocytów T. Zbyt małe zagęszczenie komórek jednojądrzastych zaburza również prawidłową aktywację i proliferację limfocytów T. Dlatego należy sprawdzić i odpowiednio dostosować zbieganie się komórek jednojądrzastych. Po drugie, dawka wektorów SeV może być niewystarczająca. Skuteczność indukcji kolonii iPSC zależy od dawki wirusa6. Jeżeli po zakażeniu SeV nie obserwuje się kolonii podobnej do ESC, należy rozważyć możliwość zwiększenia dawki wirusa do MOI 15-20. W przypadku zaobserwowania oznak różnicowania kolonii iPSC, częstotliwość, z jaką zmienia się pożywka, może być zwiększona do co drugi dzień lub do każdego dnia, gdy kolonie są większe.

Ograniczenie w tym protokole polega na tym, że ta metoda nie jest wolna od wirusów. Chociaż SeV do przeprogramowania ogniw jest łatwo dostępny na rynku, użytkownicy muszą przygotować sprzęt zgodnie z odpowiednim poziomem bezpieczeństwa biologicznego. Jako inną metodę generowania iPSC bez integracji, wektory episomalne były stosowane do tej pory27-29. Chociaż wektory episomalne mogą być używane ze sprzętem o niższym poziomie bezpieczeństwa biologicznego, wektory episomalne mogą wstawiać się do genomu gospodarza w bardzo niskich prędkościach. W związku z tym wymagane są dodatkowe kontrole w celu potwierdzenia zaniku transgenów, tak jak w przypadku stosowania SeV.

Jest jeszcze jedno ograniczenie, polegające na tym, że technika ta nie jest całkowicie wolna od produktów pochodzenia zwierzęcego. Niektóre substraty, takie jak matrigel, anty-CD3 mAb, roztwór dysocjacyjny i roztwór SeV, pochodzą z produktów pochodzenia zwierzęcego i dlatego wiążą się z ryzykiem przenoszenia patogenów ksenogenicznych. Jednak zmniejszenie ilości substratów pochodzenia zwierzęcego w systemie hodowli ma znaczenie dla klinicznego zastosowania technologii iPSC ze względu na mniejsze ryzyko.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konkurencyjnych ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi i Rei Ohno z Keio University School of Medicine za pomoc techniczną. Prace te zostały częściowo sfinansowane z programu wsparcia systemów badawczo-rozwojowych w celu przyspieszenia praktycznego wykorzystania wyników badań nad zdrowiem oraz programu Highway for the Implementation of Regenerative Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ficoll-Paque PREMIUMGE Healthcare17-5442-02
Oczyszczona mysz NA/LE anty-ludzka CD3BD Pharmingen555336
Albumina bydlęca frakcja frakcji V roztwórGibco15260-037
mTeSR1 średni zestawKOMÓRKA STEM5850Przed użyciem ogrzać w temperaturze pokojowej
Roztwór dysocjacyjnyReproCELLRCHETP002
D-PBS(–)Wako045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0DNAVECDV-0303cRozmrozić na lodzie przed użyciem
100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowychFalcon353003
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFalcon353078
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFalcon353046
15  ml Probówka wirówkowaGreiner Bio-One188271
50  ml Probówka wirówkowaGreiner Bio-One227261

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
  5. Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
  6. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  7. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  8. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  9. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
  10. Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
  11. Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
  12. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  13. Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
  14. Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263(2014).
  15. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  16. Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397(2014).
  17. Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  19. Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
  20. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  21. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612(2012).
  22. Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
  23. Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
  24. Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
  25. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
  26. Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
  27. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  28. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
  29. Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura aktywowanych limfocyt w TRearan acja receptora limfocyt w TMacierz b ony podstawnejPoziomka M T E S RMarkery kom rek pluripotencjalnychBarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły