Artykuł metodologiczny

Charakterystyka hemodynamiczna modeli tętniczego nadciśnienia płucnego u gryzoni

DOI:

10.3791/53335

⸱

11 kwietnia 2016

 ,  , 
1Department of Medicine, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) to choroba tętniczek płucnych, która prowadzi do ich zatarcia i rozwoju niewydolności prawej komory. Modele WWA u gryzoni mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii WWA. Tutaj pokazujemy charakterystykę hemodynamiczną, z cewnikowaniem prawego serca i echokardiografią, u myszy i szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) jest rzadką chorobą układu krążenia płuc, charakteryzującą się apoptozą komórek śródbłonka, proliferacją mięśni gładkich i zanikiem tętniczek płucnych. To z kolei prowadzi do niewydolności prawej komory (RV), ze znaczną zachorowalnością i śmiertelnością. Modele WWA u gryzoni u myszy i szczurów są ważne dla zrozumienia patofizjologii leżącej u podstaw tej rzadkiej choroby. Warto zauważyć, że różne modele TNP mogą być związane z różnymi stopniami nadciśnienia płucnego, przerostem RV i niewydolnością RV. Dlatego pełna charakterystyka hemodynamiczna myszy i szczurów z TNP ma kluczowe znaczenie dla określenia wpływu leków lub modyfikacji genetycznych na chorobę.

Tutaj demonstrujemy standardowe procedury oceny funkcji prawej komory i hemodynamiki zarówno w szczurzych, jak i mysich modelach PAH. Echokardiografia jest przydatna w określaniu funkcji RV u szczurów, chociaż uzyskanie standardowych widoków prawej komory jest trudne u obudzonej myszy. Dostęp do cewnikowania prawego serca uzyskuje się przez żyłę szyjną wewnętrzną u myszy i szczurów z zamkniętą klatką piersiową. Ciśnienie można mierzyć za pomocą rurki polietylenowej z przetwornikiem ciśnienia płynu lub miniaturowym cewnikiem ciśnieniowym z mikromanometrem. Analizę pętli ciśnienie-objętość można przeprowadzić w otwartej klatce piersiowej. Po uzyskaniu hemodynamiki gryzoń jest poddawany eutanazji. Serce można wypreparować w celu oddzielenia ściany wolnej od RV od lewej komory (LV) i przegrody, co pozwala na ocenę przerostu RV za pomocą wskaźnika Fultona (RV/(LV+S)). Następnie w razie potrzeby można pobrać próbki z serca, płuc i innych tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) jest chorobą układu krążenia płucnego związaną z infiltracją komórek zapalnych, proliferacją mięśni gładkich i apoptozą komórek śródbłonka. Zmiany te prowadzą do zaniku tętniczek płucnych, co w konsekwencji prowadzi do dysfunkcji prawej komory (RV) i niewydolności serca. Aby zrozumieć patofizjologię leżącą u podstaw niewydolności TNP i RV w PAH, opracowano szereg różnych modeli, w tym modele genetyczne i farmakologiczne, do badania tej choroby (przegląd w innym miejscu1,2).

Spośród tych modeli, najbardziej popularne to PAH wywołane hipoksją (Hx) u myszy oraz modele monokrotaliny (MCT) i SU5416-hipoksji (SuHx) u szczurów. W mysim modelu Hx myszy są narażone na 4 tygodnie niedotlenienia (normobarycznego lub hipobarycznego, odpowiadającego wysokości 18 000 stóp z FiO2 0,10), z wynikiem rozwoju proliferacji przyśrodkowej, zwiększonego ciśnienia skurczowego RV i rozwoju przerostu RV3. MCT w pojedynczej dawce 60 mg/kg powoduje uszkodzenie komórek śródbłonka płuc poprzez niejasny mechanizm, który następnie prowadzi do rozwoju PAH4. SU5416 jest inhibitorem receptorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR) 1 i 2 blokera, a leczenie pojedynczym wstrzyknięciem podskórnym 60 mg/kg, a następnie narażenie na przewlekłe niedotlenienie przez 3 tygodnie powoduje trwałe nadciśnienie płucne ze zmianami patologicznymi podobnymi do obserwowanych w chorobie ludzkiej, z powstawaniem zarostowych zmian naczyniowych5. W ostatnich latach opracowano kilka transgenicznych mysich modeli nadciśnienia płucnego. Należą do nich nokaut i mutacje receptora białka morfogenetycznego kości 2 (BMPR2), ponieważ mutacje genu BMPR2 występują zarówno w rodzinnych, jak i idiopatycznych formach WWA, nokaut oksygenazy hemowej-1 i nadekspresja IL-6 (przegląd gdzie indziej1,2).

Te różne modele PH gryzoni mają różne poziomy nadciśnienia płucnego, przerostu RV i niewydolności RV. Podczas gdy niedotlenienie i różne transgeniczne modele myszy skutkują znacznie łagodniejszym TNP niż którykolwiek z modeli szczurzych1, pozwala to na testowanie różnych mutacji genetycznych i związanych z nimi molekularnych szlaków sygnałowych. Model MCT powoduje ciężkie TNP, chociaż MCT wydaje się być toksyczny dla komórek śródbłonka w wielu tkankach4. Model SuHx charakteryzuje się zmianami naczyniowymi bardziej podobnymi do tych obserwowanych w idiopatycznym TNP u ludzi, chociaż wymaga zarówno manipulacji farmakologicznej, jak i ekspozycji na niedotlenienie. Co więcej, we wszystkich tych modelach może występować rozdźwięk między zmianami histopatologicznymi, ciśnieniem w płucach i funkcją RV związaną z rozwojem PAH. Jest to przeciwieństwo choroby człowieka, w której zwykle występuje proporcjonalny związek między zmianami histopatologicznymi, nasileniem nadciśnienia płucnego i stopniem niewydolności RV. W związku z tym wymagana jest kompleksowa charakterystyka tych modeli pH gryzoni i obejmuje ocenę funkcji RV (zwykle za pomocą echokardiografii), hemodynamiki (przez cewnikowanie serca) oraz histopatologię serca i płuc (od pobrania tkanek).

W tym protokole opisujemy podstawowe techniki używane do hemodynamicznej charakterystyki modeli PAH u szczura i myszy. Te ogólne techniki mogą być stosowane do każdego badania prawej komory i unaczynienia płuc i nie ograniczają się do modeli PAH. Wizualizacja RV za pomocą echokardiografii jest stosunkowo prosta u szczurów, ale jest trudniejsza u myszy ze względu na ich rozmiar i złożoną geometrię RV. Co więcej, niektóre substytuty stosowane do ilościowego określania funkcji RV, takie jak TAPSE, czas przyspieszenia tętnicy płucnej (PA) i nacięcie fali Dopplera PA, nie są dobrze zwalidowane u ludzi i tylko słabo korelują z oceną nadciśnienia płucnego i funkcji RV za pomocą hemodynamiki inwazyjnej. Określenie hemodynamiki RV najlepiej wykonać przy zamkniętej klatce piersiowej, aby utrzymać skutki ujemnego ciśnienia w klatce piersiowej z wdechem, chociaż otwarte cewnikowanie klatki piersiowej z cewnikiem impedancyjnym pozwala na określenie pętli ciśnienie-objętość (PV) i bardziej szczegółową charakterystykę hemodynamiczną. Podobnie jak w przypadku każdej procedury, zdobycie doświadczenia w zakresie procedur ma kluczowe znaczenie dla sukcesu eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane procedury są zgodne z wytycznymi Duke University School of Medicine dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Przed rozpoczęciem procedury

Uwaga: Przed przystąpieniem do jakichkolwiek procedur na zwierzętach, upewnij się, że uzyskano odpowiednie pozwolenie instytucjonalne. Podobnie jak w przypadku wszystkich zabiegów, należy stosować odpowiednie leki przeciwbólowe, aby upewnić się, że zwierzę nie cierpi.

  1. Przepłukać cewniki sterylnym roztworem soli fizjologicznej (100 j./ml) w celu zapewnienia drożności. Zaznacz punkt od końca cewnika równy długości od serca do połowy szyi (około 4 cm dla szczurów i 2 cm dla myszy).
  2. Znieczul mysz lub szczura. Do wyboru są izofluran (indukcja 3-4%, leczenie podtrzymujące 1,5% zmieszane ze 100% tlenem), ketamina/ksylazyna (80-120/10 mg/kg) i pentobarbital (40-80 mg/kg)6.
    1. Na przykład w przypadku ketaminy: ksylazyny (80-120 mg / kg: 10-16 mg / kg IP dla myszy i 80-100 mg / kg: 5-10 mg / kg IP dla szczurów) pojedyncza dawka wystarcza na 20-50 minut znieczulenia. W przypadku echokardiografii znieczulenie myszy lub szczura izofluranem (3-4% w przypadku indukcji i 1,5% w celu leczenia podtrzymującego). Oceń głębokość znieczulenia, ściskając gryzonia w obszarze operacyjnym, aby potwierdzić, że odruchy odstawienia są nieobecne. Stosuj maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
      Uwaga: W celu uzyskania wiarygodnych wyników przy prawidłowym stosowaniu i optymalizacji można stosować różne środki znieczulające (omówione w innym miejscu6). Preferujemy cewnikowanie przy użyciu ketaminy:ksylazyny. Przedawkowanie ketaminy/ksylazyny może znacznie zmniejszyć częstość akcji serca i czynność serca, dlatego tak ważne jest utrzymanie prawidłowej temperatury i kontroli oddechu. Aby utrzymać częstość akcji serca (> 400/min) u myszy, rutynowo wykonujemy obustronną wagotomię. Ilość ketaminy/ksylazyny w tym przypadku zwykle trwa 20-30 minut, co jest wystarczające do wykonania cewnikowania serca w otwartej lub zamkniętej klatce piersiowej, a następnie eutanazji zwierzęcia.
  3. Przygotuj szczura/mysz do zabiegu chirurgicznego (ryc. 1).
    1. Ogolić sierść od klatki piersiowej (aby umożliwić echokardiografię) i od okolicy operacyjnej, na prawej szyi.
    2. Wyszoruj ogolone obszary chirurgiczne okrężnym ruchem od środka na zewnątrz za pomocą betadyny, a następnie oczyść je wacikiem nasączonym 70% alkoholem.
    3. Umieść zwierzę na platformie chirurgicznej z podkładką rozgrzewającą pod spodem. Ustaw poziom ogrzewania, aby utrzymać temperaturę ciała 37-37.5 °C. Monitoruj temperaturę ciała za pomocą sondy doodbytniczej. Hipotermia może spowodować znaczną bradykardię, a hipertermia powoduje znaczną tachykardię.

2. Echokardiografia

Uwaga: Pełny opis echokardiografii gryzoni jest opisany gdzieindziej 7. W przypadku myszy, przed znieczuleniem, można uzyskać obrazy na przytomnym, ręcznie unieruchomionym zwierzęciu. W przypadku szczurów preferowane jest znieczulenie przed echokardiografią, ponieważ szczury są zbyt duże, aby można je było ręcznie krępować podczas czuwania).

  1. Widok przymostkowej osi długiej (PLAX).
    1. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na platformie lub przytrzymuj je ręcznie.
    2. Wybierz tryb B, aby wyświetlić obraz 2D na żywo.
    3. Ustaw przetwornik ultradźwiękowy z częstotliwością 40 MHz dla myszy lub 25 MHz dla szczurów do lewej linii przymostkowej, a następnie obróć przetwornik w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 30° ze wskaźnikiem sondy skierowanym w kierunku ogonowym (pozycja linii godziny od 5 do 11). Ustaw przetwornik pod lekkim kątem (kołysząc się wzdłuż krótkiej osi przetwornika w tej samej płaszczyźnie tomograficznej), aby uzyskać pełny widok komory niskiego napięcia na środku ekranu.
    4. Zlokalizuj i wyświetl te struktury anatomiczne (ryc. 2A): światło lewej komory (LV); Przegroda międzykomorowa (IVS); światło prawej komory (RV); Aorta wstępująca (AO); i lewe przedsionek (LA).
    5. Przełącz się na tryb M, gdy powyższe struktury zostaną wyraźnie zwizualizowane. Umieść linię wskaźnika w najszerszej części światła niskiego napięcia, używając AO jako punktu odniesienia, a także spraw, aby głębokość ostrości leżała w środku komory niskiego napięcia (rysunek 2B). Wykonaj podobne pomiary RV, zmieniając kątowanie przetwornika i uzyskując pomiary w trybie M.
    6. Użyj cine store, aby utworzyć pętlę wideo do nagrywania danych do pomiaru offline (wymiar komory niskiego napięcia, FS i grubość ścianki niskiego napięcia).
    7. Uzyskaj śledzenie dopplerowskie odpływu z aorty w trybie dopplerowskim PW, umieszczając kursor PW w aorcie i rejestrując (rysunek 2C).
  2. Widok przymostkowy w krótkiej osi (PSAX) na poziomie aorty.
    1. Przełącz na tryb B.
    2. Obróć przetwornik o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara od przymostkowego widoku długiej osi, aby uzyskać przymostkowy view krótkiej osi (rysunek 3). Przesuń przetwornik i ustaw go pod kątem w kierunku czaszki, aby zidentyfikować przekrój poprzeczny zastawki aortalnej.
    3. Zidentyfikuj drogę odpływu prawej komory (RVOT) jako strukturę w kształcie półksiężyca zlokalizowaną w prawym górnym rogu aorty, kontynuowaną przez płatki zastawki płucnej i tętnicę płucną.
    4. Trzymaj nieruchomo w tej samej pozycji ręcznie. Przełącz na tryb Dopplera PW.
      Uwaga: Platforma stacji do trzymania gryzonia i sondy może być użyta do zminimalizowania ruchu i zmian w położeniu przetwornika.
    5. Umieść objętość próbki proksymalnie do poziomu zastawki płucnej pośrodku drogi odpływu prawej komory, a następnie ustaw kursor równolegle do kierunku przepływu krwi przez naczynie (ryc. 3B).
      Uwaga: Ważne jest, aby dostosować kąt pobierania próbek do kierunku przepływu krwi lub użyć oprogramowania ultrasonograficznego w celu skorygowania zmiany kąta. Bez korekcji maksymalny kąt do naczynia wynosi 30°, co odpowiada ~15% niedoszacowaniu prędkości.
    6. Dostosuj skalę (prędkość przepływu krwi) zgodnie z potrzebami, aby uzyskać "dobrą" obwiednię Dopplera, która ma białe obwódki i ciemne wgłębienie w środku wskazujące na laminarny przepływ krwi (ryc. 3C). Zapisz śledzenie dopplerowskie.
      Uwaga: "Zła" koperta dopplerowska nie mieści wystarczającej ilości białych obwódek i ciemnego wgłębienia.
    7. Jeśli cewnikowanie nie zostanie wykonane w tym momencie, pozwól gryzoniu dojść do siebie, jeśli zastosowano znieczulenie. Nie pozostawiaj gryzonia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i nie zwracaj go do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Jeśli wykonywane jest cewnikowanie, przejdź do punktu 3.

3. Cewnikowanie prawego serca

  1. Podejście z zamkniętą klatką piersiową do pomiaru ciśnienia w kamperze
    1. Instalacji:
      1. Podłącz przetwornik ciśnienia do kanału wejściowego 1. W oprogramowaniu ustaw kanał 1 dla ciśnienia i kanał 2 dla tętna.
      2. Aby przeliczyć jednostki na mmHg, zapisz ślad linii podstawowej, wykonaj kalibrację ciśnienia ręcznie za pomocą manometru (jeśli używasz przetwornika ciśnienia krwi i rurki PE). Następnie wykonaj konwersję jednostek w kanale 1.
      3. Aby ustawić tętno, wyłącz wejście kanału 2. Wybierz pomiary cykliczne w obszarze kanał 2 i wybierz kanał 1 jako źródło i szybkość pomiaru.
    2. Umieść mysz/szczura pod mikroskopem preparacyjnym z głębokością ostrości i powiększeniem 5x.
    3. Naciąć skórę od żuchwy do mostka (ryc. 1). Umieść parę retraktorów po każdej stronie nacięcia, aby całkowicie odsłonić obszar szyjki macicy.
    4. Tępo wypreparuj, aby oddzielić gruczoły ślinowe, aby odsłonić prawą zewnętrzną żyłę szyjną za pomocą cienkich kleszczyków z końcówką (ryc. 4A, B).
    5. Ostrożnie odizoluj prawą żyłę szyjną zewnętrzną od otaczającej tkanki łącznej.
    6. Umieść dwa kawałki jedwabnego szwu (4-0 dla szczurów; 6-0 dla myszy) pod prawą zewnętrzną żyłą szyjną, podwiąż żyłę dystalnie (jak najbliżej żuchwy), a następnie zawiąż luźny węzeł proksymalnie (ryc. 4C).
    7. Użyj nożyczek do tęczówki, aby zrobić małe "nacięcie" (nacięcie) proksymalnie do dystalnego węzła wiązanego.
    8. Przytrzymaj cewnik kleszczami i włóż cewnik do nacięcia żyły, a następnie zaciśnij węzeł proksymalny.
      Uwaga: Zwykle używamy rurki polietylenowej (PE)-10 (rozmiar ~2 Fr) dla myszy i PE-50 (rozmiar ~3 Fr) dla szczurów, która jest podłączona do zwykłego przetwornika ciśnienia za pomocą igły 31 G lub 21 G i skalibrowana. Oznacz cewnik markerem na długości mniej więcej odpowiadającej umieszczeniu końcówki w prawej komorze. Jako alternatywę dla rurki PE można zastosować cewnik mikromanometryczny. Delikatne pociągnięcie za dystalny węzeł może pomóc we wprowadzeniu cewnika.
    9. Delikatnie wepchnij cewnik do prawego serca i monitoruj głębokość zaawansowania zgodnie z oznaczeniem. Monitoruj ślad ciśnienia w oprogramowaniu, aby zweryfikować położenie cewnika i zidentyfikować ciśnienie RV (Rysunek 5).
    10. Utrzymuj cewnik nieruchomo i zbieraj dane (przełącz nagrywanie danych obok przycisku Start) przez 2 minuty.
    11. Przystąpić do pobierania próbek (sekcja 4).
  2. Podejście otwarte do analizy pętli RV P-V.
    Uwaga: Analiza pętli P-V prawej komory nie może być wykonana z dostępu zamkniętego w klatce piersiowej ze względu na sztywność cewnika przewodzącego, który nie przechodzi z SVC do RA. Dostępne na rynku cewniki konduktancyjne są przeznaczone do analizy pętli PV P-V.
    1. W oprogramowaniu ustaw kanał 1 dla przewodności; Kanał 2 dla ciśnienia; i kanał 3 dla tętna.
    2. Zaintubuj szczury rurką teflonową o pojemności 16 g i podłącz rurkę do respiratora mechanicznego. Oblicz i ustaw parametry wentylacji dla myszy lub szczurów za pomocą następujących wzorów6: objętość oddechowa (V, t, ml) = 6,2 x M1,01 (M = masa zwierzęcia, kg); częstość oddechów (RR, min-1) = 53,5 x M-0,26 (Rysunek 6A).
    3. Rozprowadź 70% alkoholu na sierści, aby zmniejszyć rozprzestrzenianie się futra na pole operacyjne.
    4. Wykonaj nacięcie poniżej wyrostka ksyloidalnego i obustronnie rozetnij skórę nożyczkami w kierunku boku.
    5. Przeciąć ścianę brzucha i otworzyć jamę brzuszną przez obustronne rozwarstwienie wzdłuż przepony.
    6. Otwórz membranę, aby odsłonić wierzchołek serca i obustronnie przetnij klatkę piersiową (ryc. 6A). Zapobiegaj parowaniu i wysuszaniu tkanek, rozpylając sól fizjologiczną do jamy klatki piersiowej i otrzewnej za pomocą strzykawki.
      Uwaga: Zwykle używamy nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć jamę brzuszną i klatkę piersiową. Krwawienie zwykle nie jest znaczące, ale jeśli wystąpi krwawienie, można zastosować elektrokoagulację.
    7. Ostrożnie odizoluj żyłę główną dolną (IVC) od otaczającej tkanki łącznej.
    8. Umieść kawałek jedwabnego szwu (4-0 dla szczurów; 6-0 dla myszy) wokół IVC, a następnie zawiąż luźny węzeł (lub przeciągnij szew przez rurkę teflonową o wadze 16 G) (ryc. 6B).
    9. Nakłuć wierzchołkową ścianę wolną od RV igłą o rozmiarze 27-30 równolegle do ściany wolnej od RV i usunąć igłę. Uważaj, aby nie wbić igły na więcej niż 4 mm.
      Uwaga: Alternatywnie można użyć małego kawałka rurki PE-60 do wprowadzenia nakłucia cewnika konduktanckiego do wierzchołka RV.
    10. Wprowadzić końcówkę cewnika konduktanckiego przez ranę kłutą na wierzchołkowej ścianie wolnej od RV, aż wszystkie elektrody znajdą się wewnątrz komory (ryc. 6C).
    11. Monitoruj pętlę objętości ciśnienia w oprogramowaniu, a następnie dostosuj położenie cewnika, aby uzyskać pętle o spójnym kształcie, które nie wykazują znaczącej zmienności oddechowej (ryc. 7B, C).
    12. Nagrywaj bazowe pętle P-V (przełącz nagrywanie danych obok przycisku Start) przez co najmniej 10 sekund, aby uzyskać pewną liczbę pętli P-V.
    13. Pociągnij szew umieszczony wokół IVC, aby zmienić napięcia wstępne i nagrać pętle P-V. Analizuj dane w trybie off-line i wyznacz różne parametry funkcji skurczowej RV (rysunek 7D). Ta analiza została opisana wcześniej8.
      Uwaga: IVC można alternatywnie zatkać kleszczami. Monitoruj ślad ciśnienia w układzie hydraulicznym, aby potwierdzić zmniejszenie napięcia wstępnego.
    14. Wykonaj kalibracje soli fizjologicznej i kuwety zgodnie z wcześniejszym opisem, aby umożliwić konwersję z jednostek przewodnościna jednostki objętości 6.
    15. Po zarejestrowaniu danych delikatnie wyciągnij cewnik i natychmiast umieść końcówkę cewnika w łaźni wodnej z solą fizjologiczną. Po zakończeniu wyczyść cewnik zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Pobieranie próbek serca i płuc

Uwaga: Ponieważ tutejsze procedury są opisane jako nieuleczalne, zwierzę musi zostać poddane eutanazji po cewnikowaniu prawego serca z zamkniętą lub otwartą klatką piersiową.

  1. Poddaj myszy eutanazji poprzez otwarcie klatki piersiowej (obustronna torakotomia), jeśli zastosowano podejście z zamkniętą klatką piersiową, wykrwawienie lub wyłączenie respiratora po przedawkowaniu środka znieczulającego.
    Uwaga: Zwichnięcie szyjki macicy nie jest zalecane.
  2. Aby wykonać perfuzję napompowania płuc, podłącz rurkę do pompowania do statywu pierścieniowego ustawionego do napompowania płuc pod ciśnieniem 20 cmH2O (ale nie otwieraj jeszcze zaworu, aby napompować płuca).
  3. Dosadnie wypreparuj tchawicę z otaczających mięśni i tkanki łącznej.
  4. Umieść kawałek jedwabnego szwu (4-0 dla szczurów; 6-0 dla myszy) wokół tchawicy, a następnie zawiąż luźny węzeł.
  5. Delikatnie rozciągnij tchawicę, naciskając głowę i wykonaj nacięcie (70% obwodu) blisko żuchwy.
  6. Zachowaj delikatne rozciągnięcie i włóż kaniulę tchawicy (20 G dla myszy lub 16 G dla szczurów). Zabezpiecz kaniulę za pomocą szwu. Podłącz kaniulę do rurki do pompowania i zawiąż szew wokół kaniuli, aby zapobiec cofaniu się utrwalaczy.
  7. Przepłukać płuca PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aby nakłuć ścianę wolną od RV i wstrzyknąć w kierunku tętnicy płucnej. Uderz w lewy przedsionek, gdy płuca zaczną blednąć.
  8. Zbierz serce, przecinając nasadę aorty.
  9. Zacisnąć prawy dolny płat płuca za pomocą hemostatu komara i przeciąć prawy dolny płat. Umieść kawałki w probówkach do mikrowirówek i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie.
  10. Napompuj płuco 10% buforowaną neutralną formaliną przez 5 minut i usuń kaniulę tchawicy, a następnie podwiąż tchawicę.
  11. Wyciąć płuco z klatki piersiowej i utrwalić za pomocą 10% buforowanej neutralnej formaliny.
    Uwaga: Alternatywnie, nadmuchać płuca optymalnym środkiem tnącym (OCT, rozcieńczony 1:1 PBS) i zamrozić w nierozcieńczonym OCT w celu późniejszego przygotowania zamrożonych skrawków.
  12. Ostrożnie oddziel przedsionki od komór i odizoluj ścianę wolną od prawej komory, preparując wzdłuż przegrody międzykomorowej.
  13. Zważ RV i LV + przegrodę (LV+S), aby obliczyć wskaźnik Fultona (RV/LV+S)9, który określa ilościowo stopień przerostu RV.
    Uwaga: Indeks Fultona różni się w różnych modelach PH. Szczur10: kontrola, 0,28 ±0,01; wywołane niedotlenieniem, 0,57 ±0,02; Leczone MCT, 0,51 ±0,03. Mysz C57BL6/J11: kontrola, 0,26 ±0,01; SuHx (14 dni), 0,40 ±0,02; SuHx (21 dni), 0,43 ±0,01; SuHx (28 dni), 0,44 ±0,03.
  14. Zamroź RV i LV+S w ciekłym azocie lub utrwal w 10% buforowanej neutralnej formalinie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ cewnikowanie prawego serca u gryzoni jest zazwyczaj procedurą terminalną, która nie ma zastosowania do obserwacji podłużnej, echokardiografia jest doskonałą nieinwazyjną alternatywą dla badań przesiewowych i obserwacji12. Podczas gdy ciśnienie skurczowe w tętnicy płucnej w ludzkim TNP w echokardiografii zwykle wynika z niedomykalności zastawki trójdzielnej, która jest zwykle łatwa do uzyskania w widoku wierzchołkowym, taki obraz nie jest wiarygodnie uzyskiwany u gryzoni, co uniemożliwia oszacowanie ci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj protokoły opisują kompleksową charakterystykę hemodynamiki i funkcji prawej komory w modelach nadciśnienia płucnego u gryzoni. Podczas gdy cewnikowanie prawego serca, jak opisano tutaj, jest zabiegiem terminalnym, śmiertelność związana z echokardiografią jest minimalna, co pozwala na badania przesiewowe i obserwację postępu choroby. Jednakże, podobnie jak pacjenci z PH, którzy mają znacznie zwiększoną śmiertelność po znieczuleniu17, z naszego doświadczenia wynika, że szczury z ciężkim PH ró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SR jest wspierany przez NIH K08HL114643, Gilead Research Scholars in Pulmonary Arterial Hypertension oraz Burroughs Wellcome Fund Career Award dla naukowców medycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System obrazowania Vevo 2100 (120V) VisualSonics, inc. VS-11945
Stacja obrazowania Vevo 2100 VisualSonics, inc. 
Mechaniczne przetworniki wysokiej częstotliwościVisualSonics, inc. MS250, MS550D, MS400
Żel ultradźwiękowy Parker Laboratoria Inc. 01-08
Aparatura PowerLab 4/35AparaturaML765
Labchart 8ADInstruments
Przetwornik ciśnienia tętniczego z kranem iADInstrumentsMLT1199
Mikro-Tip Cewnik ciśnieniowy dla myszyMillarSPR-1000Alternatywny cewnik dostępny w Scisense FT111B (mysz) i FT211B (szczur)
Cewnik ciśnieniowy Mikro-Tip dla szczuraMillarSPR-513Alternatywny cewnik dostępny w Scisense FT111B (mysz) i FT211B (szczur)
Millar Mikro-Tip  ultraminiaturowy cewnik pętlowy PV dla myszyMillarPVR-1035Alternatywny cewnik dostępny w Scisense FT112 (mysz)
Ultraminiaturowy cewnik pętlowy PV Millar Mikro-Tip dla szczurówMillarSPR-869Alternatywny cewnik dostępny w Scisense FT112 (mysz)
Millar PV system MPVS-300 MillarMPVS-300
4-0 Jedwabny warkocz 100 jardów SzpulaRoboz SurgicalSUT-15-2
6-0 Jedwabny warkocz 100 jardów SzpulaRoboz SurgicalSUT-14-1
Nożyczki do irysu, delikatne, Integra MiltexVWR21909-248
Nożyczki preparacyjne VWR, ostra/końcówkaVWR82027-588
VWR Delikatne nożyczki, 4 1/2"VWR82027-582
Dwugwiazdkowe hemostatyki, ExceltaVWR63042-090
Formalina buforowana neutralnieVWR89370-094
CrotalineSigmaC2401
SU5416Tocris Biosciences3037
3,5X-45X Statyw wysięgnika Trójokularowy mikroskop stereoskopowy z zoomem AmScopeSM-3BX
PE (rurki polietylenowe)-10Braintree Scientific IncPE10 36 FT
PE (rurki polietylenowe)-50Braintree Scientific IncPE50 36 FT
PE (rurki polietylenowe)-60Braintree Scientific IncPE60 36 FT
Stołowe urządzenie anestezjologiczne z izofluranemKent ScientificACV-1205S
Wielofunkcyjna platforma chirurgiczna SurgisuiteKent ScientificSurgisuite
Kent ScientificSURGI-5002
Komora indukcyjna anestezjologiiVetEquip941443
Anestezjologia Kanister z filtrem gazuKent ScientificACV-2001
Stożek nosa gryzoniVetEquip921431
zestaw do kalibracji przetwornika ciśnienia MLA1052 Zestaw retraktora

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 977-991 (2012).
  2. Ryan, J. J., Marsboom, G., Archer, S. L. Rodent models of group 1 pulmonary hypertension. Handbook of experimental pharmacology. 218, 105-149 (2013).
  3. Voelkel, N. F., Tuder, R. M. Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling: a model for what human disease. J Clin Invest. 106, 733-738 (2000).
  4. Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 363-369 (2012).
  5. Abe, K., et al. Formation of plexiform lesions in experimental severe pulmonary arterial hypertension. Circulation. 121, 2747-2754 (2010).
  6. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
  7. Brittain, E., Penner, N. L., West, J., Hemnes, A. Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice. J. Vis. Exp. (81), e50912(2013).
  8. Abraham, D. M., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analyses Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , In revision (2015).
  9. Vergadi, E., et al. Early macrophage recruitment and alternative activation are critical for the later development of hypoxia-induced pulmonary hypertension. Circulation. 123, 1986-1995 (2011).
  10. Mam, V., et al. Impaired vasoconstriction and nitric oxide-mediated relaxation in pulmonary arteries of hypoxia- and monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats. J Pharmacol Exp Ther. 332, 455-462 (2010).
  11. Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiol Rep. 1, 00184(2013).
  12. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circ Cardiovasc Imaging. 3, 157-163 (2010).
  13. Abe, K., et al. Long-term treatment with a Rho-kinase inhibitor improves monocrotaline-induced fatal pulmonary hypertension in rats. Circ Res. 94, 385-393 (2004).
  14. Ma, W., et al. hypoxia chamer info--Calpain mediates pulmonary vascular remodeling in rodent models of pulmonary hypertension, and its inhibition attenuates pathologic features of disease. J Clin Invest. 121, 4548-4566 (2011).
  15. de Man, F. S., et al. Bisoprolol delays progression towards right heart failure in experimental pulmonary hypertension. Circ Heart Fail. 5, 97-105 (2012).
  16. de Man, F. S., et al. Dysregulated renin-angiotensin-aldosterone system contributes to pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186, 780-789 (2012).
  17. Pritts, C. D., Pearl, R. G. Anesthesia for patients with pulmonary hypertension. Curr Opin Anaesthesiol. 23, 411-416 (2010).
  18. Paulin, R., et al. A miR-208-Mef2 Axis Drives the Decompensation of Right Ventricular Function in Pulmonary Hypertension. Circ Res. 116, 56-69 (2015).
  19. Brittain, E., Penner, N. L., West, J., Hemnes, A. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. J Vis Exp. , (2013).
  20. Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. J Vis Exp. , e51041(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cewnikowanie prawej komory sercaechokardiografiaanaliza p tli ci nienie obj tofunkcja prawej komorywska nik Fultoncewnikowanie z zamkni t klatk piersiowcewnikowanie z otwart klatk piersiow

Powiązane artykuły