Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Substraty do hodowli komórkowych ze zintegrowanymi elastycznymi mikropostami umożliwiają użytkownikowi badanie mechanicznych interakcji między komórkami a ich bezpośrednim otoczeniem. W szczególności głównym zainteresowaniem są interakcje komórka-substrat. Obecnie macierze mikropostowe są dobrze scharakteryzowaną i uznaną metodą o szerokim zakresie zastosowań, które zostały opublikowane w ciągu ostatniej dekady. Wydaje się jednak, że wśród biologów istnieje rezerwa do adaptacji tej techniki ze względu na długi i wymagający proces produkcji mikropostów oraz brak łatwo dostępnego oprogramowania do analizy obrazów komórek oddziałujących z mikropostami.
Odczyt siły z mikrosłupków jest zaskakująco łatwy. Mikrosłupek działa jak sprężyna, a komórka jest idealnie przymocowana na jego końcu. W zależności od wielkości komórka wywiera siłę ze swojego cytoszkieletu przez jeden lub wiele ogniskowych punktów adhezji do mikrosłupka, odchylając w ten sposób mikrosłupek. Wielkość ugięcia jest bezpośrednio skorelowana z przyłożoną siłą w kierunku i wielkości. Liczba mikrosłupków pokrytych przez komórkę i wzorce ugięcia słupków są charakterystyczne i pozwalają na określenie wartości, takich jak siła na słupek i wiele biologicznie istotnych parametrów, które umożliwiają "mechanoprofilowanie" fenotypów komórek.
Wygodna metoda mechano-profilowania jest opisana tutaj, łącząc pierwszą generację gotowych do użycia komercyjnie dostępnych mikropostów z opracowanym przez siebie pakietem oprogramowania, który jest teraz dostępny dla wszystkich badaczy. Jako demonstrację typowego zastosowania, pojedyncze obrazy komórek raka kości wykonano w mikroskopii jasnego pola w celu mechanoprofilowania modeli linii komórkowych przerzutów. To połączenie komercyjnych czujników siły pociągowej i oprogramowania open source do analizy pozwala po raz pierwszy na szybkie wdrożenie techniki matryc mikrosłupkowych do rutynowych prac laboratoryjnych wykonywanych przez użytkowników niebędących ekspertami. Co więcej, solidny i usprawniony proces analizy umożliwia użytkownikowi analizę dużej liczby obrazów mikropostów w bardzo efektywny czasowo.
Wprowadzenie
Mechanosensytywne testy komórkowe umożliwiają badanie komórek adherentnych w szerokim zakresie zastosowań, które odzwierciedlają kluczową rolę mechaniki w biologii komórki. Zastosowania te często koncentrują się na mechanizmach leżących u podstaw procesów subkomórkowych lub zachowania całej komórki. Z jednej strony zewnętrzne czynniki środowiskowe, takie jak skład macierzy zewnątrzkomórkowej lub jej sztywność, mogą drastycznie wpływać na odpowiedź mechaniczną i biologiczną komórki.1 Podobne zjawisko można zaobserwować po zastosowaniu wielu klas związków farmakologicznie czynnych, których efekty są często charakteryzowane z wykorzystaniem modeli hodowli komórkowych.2 Z drugiej strony właściwości genotypowe, takie jak te wywołane spontanicznymi lub eksperymentalnie indukowanymi mutacjami genetycznymi, mogą prowadzić do wyraźnych zmian w fenotypie komórki, które wiążą się z zaburzeniami struktury i funkcji cytoszkieletu.3 Przykłady te stanowią jedynie kilka z wielu możliwych zagadnień, w których istotne jest mechaniczne fenotypowanie komórek, a wszystkie one zostały skutecznie zbadane z wykorzystaniem macierzy mikrosłupków.
W momencie sporządzania niniejszego tekstu opublikowano około 200 artykułów opisujących oddziaływanie komórek z mikrosłupkami. Prace te omawiają teoretyczne aspekty zasad ugięcia mikrosłupków, a także praktyczne instrukcje dotyczące ich wytwarzania. Pierwszy artykuł opisujący oddziaływanie komórek z elastycznymi macierzami mikrosłupków został opublikowany przez Tana i współpracowników w 2003 roku.4 W przeciwieństwie do klasycznej mikroskopii sił trakcyjnych (TFM), w której do szacowania kurczliwości komórek w skali nanoniutonowej stosuje się ciągłe miękkie podłoża, Tan et al. opisali metodę wykorzystującą wiele gęsto rozmieszczonych pionowych belek wykonanych z elastomeru silikonowego. Główne zalety tej techniki wynikają z dwóch kluczowych cech. Po pierwsze, aby zmienić pozorną sztywność podłoża dla komórki, należy jedynie zmienić wymiary mikrosłupków, utrzymując pozostały skład podłoża bez zmian, co pozwala uniknąć różnic w topologii i chemii powierzchni. Po drugie, mikrosłupki działają jak poszczególne sprężyny, które można analizować dyskretnie z rozdzielczością siłową i przestrzenną rzędu pojedynczych adhezji ogniskowych, co może zmniejszyć trudności analityczne nieodłącznie związane z analogiczną analizą za pomocą standardowej TFM.
Obecnie zakres zastosowań macierzy mikrosłupków znacznie wykracza poza samo mapowanie sił dla kilku pojedynczych komórek. Na przykład Akiyama opisuje wykorzystanie wyizolowanej tkanki naczynia grzbietowego gąsienicy ćmy jako aktuatora dla macierzy mikrosłupków w celu opracowania autonomicznego mikrorobota napędzanego mięśniami owada.5
Większość opublikowanych zastosowań mikrosłupków koncentrowała się jednak na badaniach schorzeń medycznych, takich jak infekcje czy nowotwory. Na przykład macierze mikrosłupków były wykorzystywane do badania generowania siły przez pęki pili typu IV w koloniach Neisseria gonorrhoea, co wiąże się z kaskadami sygnałowymi nasilającymi infekcję.6 Inni wykorzystywali mikrosłupki do badania komórek raka piersi traktowanych związkami farmakologicznymi celującymi w cytoszkielet.7
Ugięcie mikrosłupka jest często opisywane przy użyciu klasycznej teorii belek dla wspornika z obciążeniem końcowym, przy założeniu, że komórka przytwierdza się wyłącznie do samego wierzchołka mikrosłupka. W tym przypadku przyłożona siła F, która powoduje ugięcie δ, zależy od „sztywności zginania” k mikrosłupka i jest obliczana według wzoru:
(1)
gdzie E, I i L oznaczają odpowiednio moduł Younga, moment bezwładności przekroju i długość belki. Jednak wyniki z tego równania dają jedynie ogólną aproksymację działających sił, ponieważ nie uwzględniają ścinania i zginania belki oraz odkształcania podłoża. Biorąc pod uwagę, że mikrofilary są zazwyczaj wykonane z miękkich materiałów, takich jak guma silikonowa na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS), czynniki te muszą zostać uwzględnione. Schoen et al. wykazali, że istnieje taki współczynnik korekcyjny oparty na stosunku wysokości do średnicy mikrofilara (L/D) oraz odpowiadającej mu liczbie Poissona polimeru v.8 Jest on wyrażony wzorem:
(2)
Przy czym Ttilt(v) jest współczynnikiem przechyłu, który obejmuje parametr dopasowania a = 1,3, zgodnie z treścią tego samego artykułu:
(3)
Oznacza to, że skorygowana sztywność mikrosłupka kcorr jest iloczynem czystej sztywności zginania k=kbend oraz współczynnika korekcyjnego corr wyrażonego wzorem:
(4)
W związku z tym obliczenia siły komórkowej należy przeprowadzić przy użyciu bardziej doprecyzowanej wersji równania (1), która obecnie przyjmuje postać:
(5)
Wpływ korekty staje się bardziej oczywisty, gdy zastosuje się typowe wartości wymiarów mikrosłupków. Na przykład mikrosłupek o długości 15 µm z kołowym przekrojem poprzecznym i średnicy 5 µm, wykonany z silikonu na bazie PDMS, prowadzi do uzyskania współczynnika korekcji 0,77, co oznacza, że obliczenia bez korekty zawyżyłyby siły wywierane przez komórki o 23%. Zjawisko to jest jeszcze bardziej znaczące w przypadku mikrosłupków o mniejszym stosunku wysokości do średnicy.
Tradycyjnie analiza obrazów mikrosłupków opierała się również na uproszczonej teorii ugięcia belki. W 2005 roku grupa, która zapoczątkowała stosowanie macierzy mikrosłupków, opublikowała oprogramowanie do analizy obrazów dostosowane do analizy mikrosłupków.9 Oprogramowanie wymaga licencji, a użytkownik musi wykonać trzy zdjęcia dla każdej pozycji: po jednym z górnej i dolnej płaszczyzny mikrosłupka w trybie transmisji oraz jedno w trybie fluorescencji z zabarwioną komórką. Po porównaniu górnych i dolnych pozycji dla każdego mikrosłupka oprogramowanie wyznacza wektorowe pole sił i oblicza powiązane parametry, takie jak siła przypadająca na jeden słupkek. Istnieją inne pakiety oprogramowania, a zasady ich analizy są krótko opisane w odpowiednich artykułach, jednak pakiety te zazwyczaj nie są ogólnodostępne.10,11
Macierze mikrosłupków zaprojektowane do mapowania sił komórkowych można sklasyfikować jako posiadające ortogonalny lub heksagonalny układ mikrosłupków, przy czym ten drugi ma zaletę w postaci równoodległych odstępów między wszystkimi sąsiadującymi mikrosłupkami. Typowe mikrosłupki mają okrągły przekrój poprzeczny, a ich wymiary wahają się od 1.0 µm do 10 µm średnicy i od 2 do 50 µm długości. 4 Opisano jednak również mikrosłupki o przekroju eliptycznym lub kwadratowym.12,13
Zastosowanie mieszanin silikonowych na bazie PDMS jako materiału do produkcji mikrofilarów umożliwia dodawanie do mieszaniny nanocząsteczek. Na przykład dodanie nanoprętów kobaltowych pozwala na magnetyczną aktywację mikrofilara, co zapewnia dodatkowy stopień swobody w projektowaniu potencjalnych eksperymentów.14 Większość grup badawczych wytwarza macierze mikrofilarów na płaskich, sztywnych podłożach, takich jak szkiełka podstawowe lub wewnątrz szalek Petriego. Jednak Mann i współpracownicy opisali niedawno macierz mikrofilarów uformowaną na rozciągliwej membranie.15 Pozwala to na przyłożenie sił rozciągających do komórek adherentnych podczas badania subkomórkowych odpowiedzi dynamicznych żywych komórek pod kątem ich kurczliwości.
Powszechnie stosowany i najlepiej ugruntowany proces wytwarzania macierzy mikrofilarów opiera się na litografii miękkiej, zgodnie z opisami w szczegółowych protokołach Sniadeckiego i współpracowników.16-18 W skrócie, do wytworzenia mikrostruktur na podłożu z płytki krzemowej z wykorzystaniem fotorezystu SU8 stosuje się standardowe procesy cleanroomowe. Następnie przeprowadza się proces kopiowania, w którym guma silikonowa jest odlewana na strukturach, przenosząc je do form. W drugim kroku formy te służą do replikacji początkowej mikrostruktury za pomocą gumy silikonowej na wybranym podłożu. Jednak mimo dużej i rosnącej liczby publikacji dotyczących ich zastosowań, opracowanie procesu produkcji mikrofilarów zajmuje znaczną ilość czasu nawet ekspertom w dziedzinie mikroinżynierii; istnieje wiele etapów procesu, które wymagają optymalizacji i adaptacji do konkretnego środowiska laboratoryjnego oraz układu mikrofilarów, aby uzyskać akceptowalny poziom jakości.
Komercyjne macierze mikrosłupków są obecnie dostępne w formacie gotowym do użycia („z półki”), charakteryzującym się konsekwentnie wysoką jakością. W związku z tym stanowią one alternatywę dla złożonego i czasochłonnego procesu produkcyjnego wymaganego przy wytwarzaniu na miejscu. W niniejszej pracy wykorzystano komercyjnie dostępną macierz mikrosłupków do mapowania sił komórkowych przy użyciu pojedynczego obrazu z mikroskopii w polu jasnym. Co ważniejsze, artykuł ten opisuje i dokumentuje w pełni funkcjonalne oprogramowanie open-source o nazwie MechProfiler, które jest dostępne do pobrania jako materiał uzupełniający do niniejszego manuskryptu. Aktywnie utrzymywana wersja oprogramowania znajduje się również pod adresem http://www.orthobiomech.ethz.ch.
Połączenie gotowego testu i kompatybilnego oprogramowania analitycznego o otwartym kodzie źródłowym znacznie obniża próg wejścia w przeprowadzanie precyzyjnych eksperymentów TFM. Badacze nieposiadający dostępu do zaplecza typu clean room ani wiedzy z zakresu tworzenia oprogramowania mogą z sukcesem analizować siły komórkowe. Pozwala to użytkownikowi skupić się na wynikach testu mechanosensytywności, a nie na samej technologii, i udostępnia pomiary sił trakcyjnych szerszemu gronu odbiorców. Ponadto jest to istotny krok torujący drogę do w pełni automatycznego screeningu macierzy mikrosłupków.
Oprogramowanie analityczne MechProfiler przetwarza obrazy w formatach plików tiff, png, bmp i jpg. Obrazy mogą być pozyskane przy użyciu mikroskopii świetlnej z zastosowaniem fluorescencji, kontrastu fazowego lub pola jasnego. Samodzielny program działa wraz z bezpłatnym środowiskiem Matlab Compiler Runtime (dostępnym pod adresem: Figure 12), a zastosowane algorytmy umożliwiają usprawnione przetwarzanie obrazów, co pozwala użytkownikowi na analizę obrazów z pojedynczymi lub wieloma komórkami w czasie około 1 min. Ponadto komórki te mogą być żywe lub „utrwalone”.
Oprogramowanie MechProfiler pozwala na znaczne zwiększenie przepustowości analizy danych dzięki powtarzalności wysokiej jakości komercyjnych macierzy mikrosłupków; dokładniej mówiąc, domyślną pozycję „niewygiętą” każdego słupka w macierzy można założyć w odniesieniu do idealnej siatki (odchyłki wykonawcze siatki w macierzach użytych w niniejszym badaniu były mniejsze niż 100 nm).
W skrócie polega to na otwarciu zestawu plików obrazów do analizy, ich przycięciu do obszaru zainteresowania, zdefiniowaniu słupków pokrytych komórkami lub tych, które należy odrzucić, określeniu pozycji słupków, obliczeniu ugięć/sił względem idealnej siatki, a na koniec zapisaniu wszystkich danych specyficznych dla komórek z możliwością eksportu, w tym do standardowego arkusza kalkulacyjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórek na tablicach mikropostów
Uwaga: Wszystkie kroki muszą być wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić sterylność. Podane tutaj objętości dotyczą kolb do hodowli komórkowych T25. Receptura pożywki do hodowli komórkowych i gęstość wysiewu komórek są zoptymalizowane pod kątem linii komórkowych raka kości HuO9 i M132.
- Przygotuj kulturę komórkową do wysiewu na matrycę mikropostów.
- Sprawdzić jakość hodowli komórkowej, umieszczając kolbę hodowlaną na standardowym mikroskopie świetlnym. Upewnij się, że komórki wykazują typowy wzrost i morfologię, szacując, jaka część dna kolby hodowlanej jest pokryta. Pokrycie na poziomie 70%-80% odzwierciedla zdrowe tempo wzrostu. Zwróć uwagę na ilość pływających komórek, ponieważ reprezentują one martwe komórki i/lub przerośniętą kulturę.
- Trypsynizuj komórki, usuwając pożywkę i przemując 4 ml 1x bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 0,8 ml 1x trypsyna/kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i inkubować w temperaturze pokojowej aż do usunięcia komórek, co zajmuje około 2-4 minut. Sprawdź proces za pomocą mikroskopu i od czasu do czasu delikatnie postukaj w kolbę, aby wspomóc przemieszczanie się.
- Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórkowych (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptawidyną (Pen/Strep)) w celu zatrzymania reakcji i zmycia resztek komórek, które nadal znajdują się na dnie kolby. Następnie kilkakrotnie odpipetować tę zawiesinę w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Upewnij się, że wszystkie roztwory zostały odpipetowane w poprzek pierwotnego obszaru wzrostu kolby, aby uzyskać skuteczne usuwanie.
- Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i odwirować za pomocą wirówki stołowej o sile 0,5 x g przez 3 minuty.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu o objętości 5 ml, pipetując 5 razy w górę i w dół. Upewnij się, że przy tym nie wytwarzasz bąbelków.
- Określ gęstość komórek za pomocą komory do zliczania komórek i mikroskopu świetlnego. Sprawdzić zawiesinę komórek w komorze zliczania komórek pod kątem agregatów komórek i upewnić się, że do następnego eksperymentu mają tylko pojedyncze komórki. Ponownie kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, jeśli komórki mają tendencję do tworzenia agregatów w celu ich rozdzielenia.
- Rozcieńczyć zawiesinę komórkową wystarczającą ilością pożywki, aby uzyskać roztwór komórkowy o objętości 25 000 komórek/ml. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając zamkniętą probówkę.
- Przygotuj tablicę mikropostów do rozsiewania komórek.
Uwaga krytyczna: Nie należy pipetować bezpośrednio na matrycę mikrosłupków, ponieważ może to potencjalnie uszkodzić mikrowkłady, zwłaszcza w przypadku wprowadzenia niechcianych pęcherzyków powietrza. Ponadto upewnij się, że matryca mikrosłupków nigdy nie wysycha, ponieważ występujące siły kapilarne prowadzą do zapadania się mikrosłupków.- Umieść szklane podłoże z matrycą mikrosłupków skierowaną do góry w studzience 12-dołkowej płytki za pomocą pęsety i zwilż je, dodając 1 ml etanolu (99%). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-30 sekund.
- Rozcieńczać etanol stopniowo, dodając około 1 ml sterylnej wody dejonizowanej (woda dejonizowana) po stronie studzienki i odsysając około 1 ml za pomocą pipety transferowej lub urządzenia do aspiracji. Powtórz ten krok co najmniej 3 razy.
- Zastąp wodę defibrylacyjną buforem PBS w ten sam sposób, dodając i zasysając około 1 ml. Powtórz ten krok 3 razy.
- Zastąp bufor PBS pożywką, dodając i odsysając około 1 ml pożywki. Powtórz ten krok 3 razy.
- Odpipetować 1 ml roztworu komórkowego (25 000 komórek) na wierzchu każdego przygotowanego zestawu mikrosłupków. Zamknąć płytkę wielodołkową i przenieść ją do inkubatora (CO2 5%, 37 °C). Pozwól komórkom przylegać i rosnąć na mikrosłupkach przez 6 -7 godzin.
- Od czasu do czasu sprawdzaj proces przyczepności za pomocą mikroskopu świetlnego. Sprawdź, czy większość komórek wydaje się być rozłożona na wiele mikropostów.
2. Utrwalanie i barwienie komórek
Uwaga: Wszystkie podane tutaj kroki i objętości dotyczą pojedynczego dołka płytki 12-dołkowej. Zaleca się przetwarzanie nie więcej niż czterech z dwunastu studzienek na raz, aby uniknąć wysychania studzienek po zasysaniu jakiejkolwiek cieczy, co spowoduje zapadnięcie się mikrosłupków.
- Odessać pożywkę ze studzienki i przepłukać komórki 2x 1 ml buforu PBS. Upewnij się, że podczas mycia PBS należy przyłożyć delikatną siłę, aby usunąć resztki komórek, które nagromadziły się na matrycy mikropostów podczas inkubacji i odłączyć martwe komórki.
- Utrwal komórki 0,5 ml 3,7% buforowanego roztworu formaldehydu przez 5 minut.
- Zastąp roztwór formaldehydu, myjąc matrycę mikrosłupków 2x 1 ml sterylnej wody DI.
- Zabarwić komórki barwnikiem (0,05% Coomassie Brilliant Blue w 50% wodzie, 40% etanolu i 10% kwasu octowego) przez około 90 sekund. Nadmiar roztworu barwiącego zmyć 2x 1 ml sterylnej wody DI. Dodaj 1 ml wody DI do układu mikropostów.
- Sprawdź wynik barwienia za pomocą mikroskopu świetlnego. Powtórz etap barwienia, jeśli ciało komórki jest zbyt słabe, aby można je było uwidocznić.
- Przechowuj układy mikrosłupków z wybarwionymi komórkami na wierzchu w lodówce w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że przez cały czas trzymasz je pod wodą.
3. Obrazowanie komórek
Uwaga: Krok 4 dotyczy tylko mikroskopów bez optyki z korekcją nieskończoności.
- Dodaj 2 ml wody DI do szalki Petriego z cienkim szklanym dnem, aby uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości.
- Przenieś matrycę mikrosłupków za pomocą pęsety do naczynia do obrazowania z mikrosłupkami skierowanymi do góry.
- Umieść obrazującą szalkę Petriego na ruchomym stoliku mikroskopu świetlnego.
- Obróć pierścień kompensacyjny soczewki używanej do obrazowania, aż liczba na skali będzie reprezentować całkowitą grubość wszystkich materiałów wzdłuż ścieżki optycznej, aby skompensować niedopasowanie współczynników załamania światła podłoża szklanego, elastomeru silikonowego i cieczy na górze. Powinno to doprowadzić do jasnego wyglądu rdzeni mikropostów.
- Zamknij przysłonę po stronie oświetlenia do 50% i usuń wszelkie pierścienie kontrastu fazowego ze ścieżki optycznej, umożliwiając zwykły tryb jasnego pola.
- Wyrównaj tablicę mikrosłupków tak, aby mikrosłupki tworzyły poziomą linię w poprzek pola obserwacji. Zdefiniuj punkt początkowy (np. lewy górny róg) i przesuwaj szalkę Petriego krok po stoliku, skanując tablicę mikrosłupków podczas wykonywania wielu zdjęć.
- Rób wszystkie zdjęcia z najwyższym ustawieniem rozdzielczości dla aparatu, używając obiektywu 20X lub 40X. Staraj się, aby pojedyncza komórka znajdowała się na środku obrazu.
- Przeciągnij wzdłuż osi z przez podłoże, aż końcówki mikrosłupka będą ostre. Użyj pokrętła precyzyjnego dostrajania ostrości mikroskopu i obróć je w kierunku ustawiania ostrości na dnie mikrosłupka na około 2-3 μm.
- Ustal standardową procedurę obrazowania, wykonując serię obrazów testowych jednej sekcji matrycy, przemiatając parametry obrazowania pojedynczo (np. czas ekspozycji, ustawienie przysłony, ustawienia lampy itp.). Analizuj obrazy za pomocą MechProfiler i określ odpowiedni zestaw parametrów, aby uzyskać szybką i wiarygodną analizę.
4. Analiza obrazu za pomocą oprogramowania Open Source "MechProfiler"
Uwaga: Wszystkie funkcje oprogramowania mogą być aktywowane za pomocą urządzenia wskazującego za pomocą lewego przycisku myszy. Jednak przeszkolony operator będzie używał udokumentowanych skrótów zaprojektowanych tak, aby znajdowały się po lewej stronie klawiatury, aby umożliwić wydajne przetwarzanie obrazu oburęcznym.
- Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu MechProfiler i otwórz zakres obrazów, które należy przeanalizować, klikając "Otwórz".
- Wstaw wszystkie parametry do sekcji "Ustawienia" podanej przez twórcę oprogramowania. Określ parametry, które muszą być skonfigurowane na zamówienie (tj. próg konturu i minimalna odległość) zgodnie z procedurami opisanymi szczegółowo w instrukcji oprogramowania.
- Analizuj obrazy jeden po drugim, przycinając je do obszaru zainteresowania za pomocą "Przytnij" (kliknij i przeciągnij z wciśniętym przyciskiem myszy). Kliknij dwukrotnie wewnątrz narysowanego prostokąta, aby zakończyć tę czynność.
- Zaznaczanie każdego widocznego konturu komórki jeden po drugim, klikając "Narysuj kontury komórek" i użyj kursora krzyżyka do rysowania, w tym wszystkich mikropostów, do których dołączona jest komórka.
- Odrzuć wszelkie niechciane mikroposty, klikając "Odrzuć posty" i użyj kursora celownika do rysowania. Umieść wszystkie mikrowpisy, które należą do komórki, poza sekcją obrazu lub które są odchylone z jakiegokolwiek innego powodu, ale nie przez komórkę będącą przedmiotem zainteresowania.
- Uruchom podprogram oprogramowania "Znajdź centroidy" za pomocą kliknięcia myszą. Dostosuj ustawienie filtra tuż obok przycisku "Znajdź centroidy", aż wszystkie mikrosłupy zostaną zarejestrowane, co jest widoczne za pomocą czerwonego krzyżyka w ich środku. Jeśli ustawienie filtra jest zbyt niskie, mikroposty zostaną zignorowane, jeśli jest zbyt wysokie, dla jednego mikrosłupka zostanie zaznaczonych wiele pozycji. Utrzymuj stałe ustawienie filtra podczas sesji analizy.
- Użyj funkcji edycji ręcznej "Edycja ręczna" dla centroidów z wieloma lub pominiętymi pozycjami mikrosłupków. Użyj krzyżyka myszy, aby wybrać dany mikropost, klikając i przeciągając go w poprzek. Kliknij dwukrotnie wewnątrz prostokąta i umieść brakujący czerwony znacznik w powiększonej sekcji obrazu, która automatycznie się zamknie. Przed kontynuowaniem należy odrzucić taki mikropost, jeśli znajduje się on poza narysowanym konturem komórki (patrz krok 4.5).
- Znajdź idealną siatkę mikropostów, aktywując funkcję "Generuj siatkę" jednym kliknięciem myszy. Upewnij się, że pozycja odpowiada prawdziwej głowicy mikrosłupka, pokazanej przez niebieski pierścień, wewnątrz narysowanego konturu komórki.
- W razie potrzeby popraw wszelkie zagubione narzędzia do tworzenia siatki w obszarze komórki, korzystając z odpowiedniej funkcji "Manuel Edit" za pomocą kliknięcia myszą. Użyj celownika, aby wybrać dany mikropost, klikając i przeciągając go w poprzek. Kliknij dwukrotnie wewnątrz pojawiającego się prostokąta i umieść brakujący niebieski znacznik w sekcji powiększonego obrazu, która automatycznie się zamknie.
- Użyj przycisku "Oblicz ugięcia" za pomocą kliknięcia myszą, aby uzyskać histogram obliczonych wartości ugięcia na podstawie różnicy między położeniem mikrosłupka w sekcji obrazu a wygenerowaną idealną siatką.
- Zapisz pełną analizę wraz z tabelami wartości, klikając myszką "Zapisz".
- Kontynuuj analizę obrazu, klikając "Resetuj widok" i przeanalizuj inną sekcję obrazu lub klikając myszą "Następny obraz", co wygodnie można zrobić za pomocą prawego klawiatury.
5. Analiza danych — Mechanoprofilowanie
- Otwórz plik "results.xls" za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych pakietu Office z folderu z analizowanymi obrazami. Zawiera dane ze wszystkimi obliczonymi wartościami, w tym wszystkimi ugięciami mikrosłupków i standardowymi miarami pochodnymi, takimi jak praca (tj. energia deformacji podłoża) przez analizowane ogniwo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Główna zaleta opisanego podejścia polega na jego prostocie oraz potencjale do szybkiej i skutecznej integracji z rutynową pracą laboratoryjną. Połączenie wysokiej jakości komercyjnych matryc sensorów z oprogramowaniem open-source dostarcza informacji o mechanoczułości, które w przeciwnym razie wymagałyby dostępu do zaplecza typu cleanroom oraz dogłębnej wiedzy z zakresu analizy obrazu i rozwoju oprogramowania. Rysunek 1 ilustruje schemat pracy przedstawionej metody. Rozpoczyna się ona od przygotowania i ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Prace te mają na celu postęp w dziedzinie mikroskopii sił trakcyjnych poprzez znaczne obniżenie technicznych i praktycznych barier wejścia. Bariery te nadchodzą z dwóch stron. Pierwszym i najważniejszym z nich są liczne nietrywialne wyzwania techniczne, które należy pokonać, aby w sposób powtarzalny wyprodukować i eksperymentalnie uruchomić układ mikrosłupków. Po drugie, podobnie nietrywialna jest potrzeba wiarygodnej, półautomatycznej analizy sił pojedynczych komórek – mając na uwadze, że typowy eksperyment może wymagać...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Główny autor (NG) jest współzałożycielem MicroDuits GmbH, komercyjnego dostawcy matryc mikrosłupkowych wykorzystywanych w tym badaniu. Żaden inny autor nie ma potencjalnego konfliktu interesów z tą pracą.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Komitet ds. Technologii i Innowacji (CTI) Szwajcarski grant 14796-PFLS-LSCTI. Macierze MicroPost zostały hojnie dostarczone przez MicroDuits GmbH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolby do hodowli komórkowych T25 | Nunc | 156367 | |
| 1x bufor PBS | Sigma | D8537 | |
| 0,5% Trypsyna-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS Ameryka Południowa | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicylina-Streptomycyna 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml fiolki wirówkowe | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Matryca mikrosłupków wstępnie pokryta Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Wymiary mikropostu: Ø=6.4 &mikro; m, l=18,2 &mikro; m; siatka=13 &mikro; m, kcorr=2.87 nN/&mikro; m |
| Etanol abs p.a. | Merck | 100.983 | |
| 12-dołkowa płytka | Nunc | 150628 | |
| Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Metanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Kwas octowy | Sigma | 695092 | |
| Naczynie ze szklanym dnem | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | Średnica 35 mm, otwór 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Mikroskop odwrócony |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Kontroler aparatu |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
Bibliografia
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311(2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
