Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Podsumowanie

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Streszczenie

Substraty do hodowli komórkowych ze zintegrowanymi elastycznymi mikropostami umożliwiają użytkownikowi badanie mechanicznych interakcji między komórkami a ich bezpośrednim otoczeniem. W szczególności głównym zainteresowaniem są interakcje komórka-substrat. Obecnie macierze mikropostowe są dobrze scharakteryzowaną i uznaną metodą o szerokim zakresie zastosowań, które zostały opublikowane w ciągu ostatniej dekady. Wydaje się jednak, że wśród biologów istnieje rezerwa do adaptacji tej techniki ze względu na długi i wymagający proces produkcji mikropostów oraz brak łatwo dostępnego oprogramowania do analizy obrazów komórek oddziałujących z mikropostami.

Odczyt siły z mikrosłupków jest zaskakująco łatwy. Mikrosłupek działa jak sprężyna, a komórka jest idealnie przymocowana na jego końcu. W zależności od wielkości komórka wywiera siłę ze swojego cytoszkieletu przez jeden lub wiele ogniskowych punktów adhezji do mikrosłupka, odchylając w ten sposób mikrosłupek. Wielkość ugięcia jest bezpośrednio skorelowana z przyłożoną siłą w kierunku i wielkości. Liczba mikrosłupków pokrytych przez komórkę i wzorce ugięcia słupków są charakterystyczne i pozwalają na określenie wartości, takich jak siła na słupek i wiele biologicznie istotnych parametrów, które umożliwiają "mechanoprofilowanie" fenotypów komórek.

Wygodna metoda mechano-profilowania jest opisana tutaj, łącząc pierwszą generację gotowych do użycia komercyjnie dostępnych mikropostów z opracowanym przez siebie pakietem oprogramowania, który jest teraz dostępny dla wszystkich badaczy. Jako demonstrację typowego zastosowania, pojedyncze obrazy komórek raka kości wykonano w mikroskopii jasnego pola w celu mechanoprofilowania modeli linii komórkowych przerzutów. To połączenie komercyjnych czujników siły pociągowej i oprogramowania open source do analizy pozwala po raz pierwszy na szybkie wdrożenie techniki matryc mikrosłupkowych do rutynowych prac laboratoryjnych wykonywanych przez użytkowników niebędących ekspertami. Co więcej, solidny i usprawniony proces analizy umożliwia użytkownikowi analizę dużej liczby obrazów mikropostów w bardzo efektywny czasowo.

Wprowadzenie

Mechanosensytywne testy komórkowe umożliwiają badanie komórek adherentnych w szerokim zakresie zastosowań, które odzwierciedlają kluczową rolę mechaniki w biologii komórki. Zastosowania te często koncentrują się na mechanizmach leżących u podstaw procesów subkomórkowych lub zachowania całej komórki. Z jednej strony zewnętrzne czynniki środowiskowe, takie jak skład macierzy zewnątrzkomórkowej lub jej sztywność, mogą drastycznie wpływać na odpowiedź mechaniczną i biologiczną komórki.¹ Podobne zjawisko można zaobserwować po zastosowaniu wielu klas związków farmakologicznie czynnych, których efekty są często charakteryzowane z wykorzystaniem modeli hodowli komó....

Protokół

1. Hodowla komórek na tablicach mikropostów

Uwaga: Wszystkie kroki muszą być wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić sterylność. Podane tutaj objętości dotyczą kolb do hodowli komórkowych T25. Receptura pożywki do hodowli komórkowych i gęstość wysiewu komórek są zoptymalizowane pod kątem linii komórkowych raka kości HuO9 i M132.

1. Przygotuj kulturę komórkową do wysiewu na matrycę mikropostów.
   1. Sprawdzić jakość hodowli komórkowej, umieszczając kolbę hodowlaną na standardowym mikroskopie świetlnym. Upewnij się, że komórki wykazują typowy wzrost i morfologię, szacując, jaka część dna kolby hodowlanej ....

Wyniki

Główna zaleta opisanego podejścia polega na jego prostocie oraz potencjale do szybkiej i skutecznej integracji z rutynową pracą laboratoryjną. Połączenie wysokiej jakości komercyjnych matryc sensorów z oprogramowaniem open-source dostarcza informacji o mechanoczułości, które w przeciwnym razie wymagałyby dostępu do zaplecza typu cleanroom oraz dogłębnej wiedzy z zakresu analizy obrazu i rozwoju oprogramowania. Rysunek 1 ilustruje schemat pracy przedstawionej metody. Rozpoczyna się ona od przygotowania i .......

Dyskusja

Prace te mają na celu postęp w dziedzinie mikroskopii sił trakcyjnych poprzez znaczne obniżenie technicznych i praktycznych barier wejścia. Bariery te nadchodzą z dwóch stron. Pierwszym i najważniejszym z nich są liczne nietrywialne wyzwania techniczne, które należy pokonać, aby w sposób powtarzalny wyprodukować i eksperymentalnie uruchomić układ mikrosłupków. Po drugie, podobnie nietrywialna jest potrzeba wiarygodnej, półautomatycznej analizy sił pojedynczych komórek – mając na uwadze, że typowy eksperyment może wymagać.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolby do hodowli komórkowych T25	Nunc	156367
1x bufor PBS	Sigma	D8537
0,5% Trypsyna-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS Ameryka Południowa	Life Technologies	10270106
Penicylina-Streptomycyna 100x	Sigma	P4333
15 ml fiolki wirówkowe	Sarstedt	62.554.502
Matryca mikrosłupków wstępnie pokryta Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Wymiary mikropostu: Ø=6.4  &mikro; m, l=18,2 &mikro; m; siatka=13 &mikro; m, kcorr=2.87  nN/&mikro; m
Etanol abs p.a.	Merck	100.983
12-dołkowa płytka	Nunc	150628
Roztwór formaliny, neutralny buforowany 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Metanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Kwas octowy	Sigma	695092
Naczynie ze szklanym dnem	WillCo Wells BV	GWSb-3522	Średnica 35 mm, otwór 22  mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Mikroskop odwrócony
D3-L3	Nikon	n/a	Kontroler aparatu
DS Fi2	Nikon		Camera