Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostatnio biolodzy zajmujący się infekcjami wykorzystali hodowle pochodzące z komórek macierzystych, aby odpowiedzieć na zapotrzebowanie na nowe i lepsze modele do badania interakcji gospodarz-patogen. Wykorzystano trzy źródła komórkowe: embrionalne komórki macierzyste (ESC), indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) lub dorosłe komórki macierzyste. W tym artykule opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, które są wykorzystywane do zakażenia patogenem żołądka Helicobacter pylori. Ludzkie gruczoły żołądkowe są izolowane z materiału reekcyjnego, wysiewane w macierzy podstawowej i zatopione w pożywce zawierającej czynniki wzrostu: naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), R-spondynę, Noggin, Wnt, czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) 10, gastrynę i inhibitor beta transformującego czynnika wzrostu (TGF). W tych warunkach gruczoły żołądkowe rozrastają się w trójwymiarowe organoidy zawierające 4 linie żołądka. Organoidy rozszerzają się w nieskończoność i mogą być zamrażane i rozmrażane podobnie jak linie komórkowe. W badaniach nad infekcjami bakterie są mikrowstrzykiwane do światła organoidów. Zainfekowane organoidy są przetwarzane do obrazowania. Opisane metody można dostosować do innych organoidów i zakażeń innymi bakteriami, wirusami lub pasożytami. Pozwala to na badanie zmian wywołanych infekcją w komórkach pierwotnych.
Wprowadzenie
Badanie patogenów opiera się na odpowiednich systemach modelowych do naśladowania infekcji in vivo. W przypadku niektórych czynników zakaźnych brakuje odpowiednich systemów modelowych, a niektóre z wykorzystywanych systemów są dalekie od optymalnych. Jednym z przykładów jest bakteria żołądkowa Helicobacter pylori (H. pylori), która jest przyczynowo związana z rozwojem raka żołądka. Jednak z powodu braku bardziej odpowiedniego systemu hodowli komórek, wiele badań, które mają na celu analizę mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju raka, wykorzystuje linie komórek rakowych, które stanowią punkt końcowy kaskady nowotworowej. Pierwot....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Założenie hodowli organoidów żołądkowych
Uwaga: Ten protokół może być używany do izolacji gruczołów żołądkowych z tkanek mysich lub ludzkich. Zaleca się stosowanie chusteczki o powierzchni około 1 cm². Tkankę ludzką można uzyskać z resekcji żołądka lub biopsji.
- Przygotowanie materiału
Uwaga: Używana matryca piwniczna to Matrigel. Utrzymuj matrycę piwnicy na lodzie przez cały czas. Przechowywać matrycę piwniczną w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie przed użyciem. Pożywka podstawowa odnosi się do Advanced DMEM/F12 uzupełnionego HEPES; odpowiednie źródło glutaminy, takie jak Glutamax i odpowiednie antybiotyki, taki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół umożliwia izolację gruczołów żołądkowych (Rycina 2). Gruczoły są osadzane w macierzy podstawowej, która krzepnie w postaci kropelki wewnątrz dołka, zapewniając trójwymiarową strukturę bogatą w lamininę i kolagen, co pozwala gruczołom na wzrost w organoidy (Rycina 3). Organoidy zazwyczaj zaczynają jako małe cysty, a w ciągu 12-16 dni przekształcają się w sfery o średnicy 50-300 µm (Rycina 4). Niektóre organoidy pozostaną w formie cystycznej, inne rozwin.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje wykorzystanie stale rozrastających się, nieprzekształconych pierwotnych organoidów z dorosłych komórek macierzystych do biologii infekcji. Kluczowymi etapami są: i) izolacja żywotnych gruczołów, ii) ekspansja organoidów oraz iii) mikroiniekcja. Poniżej znajduje się kilka sugestii dotyczących modyfikacji, rozwiązywania problemów i rozważań technicznych.
W porównaniu z innymi metodami izolacji, które wykorzystują energiczne wytrząsanie lub pipetowanie w celu uwolnienia gruc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Hans Clevers jest wynalazcą kilku patentów na hodowlę organoidów. Poza tym autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) dla S.B. oraz nagrodę badawczą od United European Gastroenterology Foundation dla H.C. Chcielibyśmy podziękować Harry'emu Begthelowi, Jeroenowi Korvingowi i Hubrecht Imaging Center za pomoc techniczną, Meritxell Huch za pomoc we wstępnej hodowli organoidów oraz Yanie Zavros za dyskusję.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, bez fenolu | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stężenie magazynowe 200 mM, stężenie końcowe 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stężenie magazynowe 50 x, stężenie końcowe 1x |
| N-Acetylocysteina | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stężenie zapasowe 500 mM, stężenie końcowe 1 mM |
| Rekombinant mysi EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stężenie magazynowe 500 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 50 ng/ml |
| Ludzki rekombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stężenie podstawowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 200 ng/ml |
| TGFβ i A-83-01 | Tocris | 2939 | Stężenie w magazynie 500 &mikro; M, stężenie końcowe 2 i mikro; M |
| Nikotynamid | Sigma-Aldrich | N0636 | Stężenie magazynowe 1 M, stężenie końcowe 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stężenie zapasów 100 &mikro; M, stężenie końcowe 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stężenie wyjściowe 10 mM, stężenie końcowe 10 &mikro; |
| kondycjonowana M Wnt3A | Stabilna linia komórkowa wytworzona w laboratorium Clevers. Stężenie końcowe 50%. Ogniwa można uzyskać od Hansa Cleversa. | ||
| kondycjonowana R-spondyną1 | Stabilna linia komórkowa wytworzona w laboratorium Kuo. Stężenie końcowe 10%. Linię komórkową można uzyskać od Calvina Kuo ze Stanforda. | ||
| kondycjonowana Noggin | Stabilna linia komórkowa wygenerowana w Clevers Lab. Stężenie końcowe 10%. Ogniwa można uzyskać od Hansa Cleversa. | ||
| R-spondyna3 | R& D | 3500-RS/CF | Alternatywne źródło R-spondyny. Zostało to przetestowane na organoidach jelit ludzkich (1 &mikro; g/ml), ale jeszcze nie na organoidach żołądka. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternatywne źródło dla noggin. Zostało to przetestowane na organoidach jelita ludzkiego (100 ng/ml), ale jeszcze nie na organoidach żołądkowych. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatyczne rozwiązanie dysocjacyjne |
| CoolCell® Bezalkoholowe pojemniki do zamrażania komórek | biocyzja | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antybiotyki | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Kompozycja antybiotykowa przeciwko bakteriom i grzybom. Jest pomocny po zainicjowaniu kultury. W przypadku długotrwałej hodowli można przejść na inne antybiotyki lub nie stosować ich wcale. |
| Penicylina/Streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | Stężenie podstawowe 10 000/10 000 U/ml, stężenie końcowe 100/100 U/ml. Może być stosowany alternatywnie do Primocin w długotrwałej hodowli. |
| Pęseta Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Pęseta z cienkimi końcówkami jest pomocna w usuwaniu warstwy mięśniowej z tkanki. |
| 4 Welles | Multidish Thermo Scientific | 144444 | Możesz użyć innych Multidish. Były one szczególnie pomocne w przypadku mikroiniekcji, ponieważ mają niską zewnętrzną krawędź i pozwalają manipulatorowi na większą mobilność. |
| Mikromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Mikrowtryskiwacz | Narishige | IM-5B | |
| Stereoskop | Leica | MZ75 | |
| Stół warsztatowy | Czyste powietrze | Wykonane na zamówienie, aby pasowało do mikroskopu stereoskopowego w stanie ML2 | |
| Kapilary | Aparat Harvard | GC100T-10 | Średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,78 mm. |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter Instruments | Płonący brązowy ściągacz | |
| anty Cag A przeciwciało Santa | Cruz | sc-25766 |
Bibliografia
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
