Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

34.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53359

⸱

12 listopada 2015

 , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

W tym artykule

Podsumowanie

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Streszczenie

Ostatnio biolodzy zajmujący się infekcjami wykorzystali hodowle pochodzące z komórek macierzystych, aby odpowiedzieć na zapotrzebowanie na nowe i lepsze modele do badania interakcji gospodarz-patogen. Wykorzystano trzy źródła komórkowe: embrionalne komórki macierzyste (ESC), indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) lub dorosłe komórki macierzyste. W tym artykule opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, które są wykorzystywane do zakażenia patogenem żołądka Helicobacter pylori. Ludzkie gruczoły żołądkowe są izolowane z materiału reekcyjnego, wysiewane w macierzy podstawowej i zatopione w pożywce zawierającej czynniki wzrostu: naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), R-spondynę, Noggin, Wnt, czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) 10, gastrynę i inhibitor beta transformującego czynnika wzrostu (TGF). W tych warunkach gruczoły żołądkowe rozrastają się w trójwymiarowe organoidy zawierające 4 linie żołądka. Organoidy rozszerzają się w nieskończoność i mogą być zamrażane i rozmrażane podobnie jak linie komórkowe. W badaniach nad infekcjami bakterie są mikrowstrzykiwane do światła organoidów. Zainfekowane organoidy są przetwarzane do obrazowania. Opisane metody można dostosować do innych organoidów i zakażeń innymi bakteriami, wirusami lub pasożytami. Pozwala to na badanie zmian wywołanych infekcją w komórkach pierwotnych.

Wprowadzenie

Badanie patogenów opiera się na odpowiednich systemach modelowych do naśladowania infekcji in vivo. W przypadku niektórych czynników zakaźnych brakuje odpowiednich systemów modelowych, a niektóre z wykorzystywanych systemów są dalekie od optymalnych. Jednym z przykładów jest bakteria żołądkowa Helicobacter pylori (H. pylori), która jest przyczynowo związana z rozwojem raka żołądka. Jednak z powodu braku bardziej odpowiedniego systemu hodowli komórek, wiele badań, które mają na celu analizę mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju raka, wykorzystuje linie komórek rakowych, które stanowią punkt końcowy kaskady nowotworowej. Pierwotne, nieprzekształcone komórki byłyby lepszym modelem dla tych badań. Jednak komórki pierwotne są dostępne tylko od niewielkiej liczby dawców i nie mogą być hodowane przez dłuższy czas. W ostatnich latach badania nad komórkami macierzystymi poczyniły znaczne postępy, aby zapewnić nowe źródła pierwotnych kultur komórkowych do badań nad biologią zakażeń.

Użyto kultur z trzech źródeł komórek macierzystych: embrionalnych komórek macierzystych (ESC), indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) lub dorosłych komórek macierzystych. Wykorzystano je do modelowania zakażeń wirusami, takimi jak wirus cytomegalii1,2 lub wirus zapalenia wątroby typu C3–7, pasożytami, takimi jak Plasmodium falciparum8 lub Toxoplasma gondii9 oraz bakteriami, takimi jak Bacterioides thetaiotaomicron10 lub Salmonella enterica11. Ostatnio opublikowano kilka podejść do modelowania zakażenia H. pylori organoidami pochodzącymi z komórek ESC lub iPS12, dorosłych komórek macierzystych myszy21,22 lub dorosłych ludzkich komórek macierzystych13–15.

Rozwój kultur organoidowych z dorosłych komórek macierzystych rozpoczął się w badaniu, w którym pojedyncze komórki macierzyste wyizolowane z nabłonka jelita mysiego zostały umieszczone w trójwymiarowej matrycy i osadzone w pożywce, która naśladowała środowisko jelitowych komórek macierzystych zawierających EGF jako mitogen, R-spondynę w celu wzmocnienia sygnalizacji Wnt i Noggin w celu zahamowania sygnalizacji białka morfogennego kości (BMP)16. Warto zauważyć, że kultury te nie wymagają kohodowli z komórkami mezenchymalnymi. W tych warunkach komórki macierzyste namnażają się i tworzą małe struktury z domenami zawierającymi komórki krypt jelitowych i domenami zawierającymi komórki kosmków jelitowych. W ten sposób organoidy samoorganizują się, aby naśladować sytuację in vivo. Obecnie dorosłe komórki macierzyste z wielu tkanek mysich i ludzkich mogą być hodowane in vitro i samoorganizować się w organoidy, które przypominają ich odpowiedniki in vivo, takie jak jelito cienkie i okrężnica17, żołądek13,18, wątroba19,20, trzustka21 i prostata22.

Tutaj udostępniamy protokół wideo do hodowli mysich lub ludzkich organoidów żołądkowych z dorosłych komórek macierzystych i mikrowstrzykiwania im H. pylori. Protokół ten opiera się na poprzednich raportach13,18. Metodę tę można dostosować do hodowli i infekowania innych kultur organoidów, takich jak organoidy jelitowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Założenie hodowli organoidów żołądkowych

Uwaga: Ten protokół może być używany do izolacji gruczołów żołądkowych z tkanek mysich lub ludzkich. Zaleca się stosowanie chusteczki o powierzchni około 1 cm². Tkankę ludzką można uzyskać z resekcji żołądka lub biopsji.

  1. Przygotowanie materiału
    Uwaga: Używana matryca piwniczna to Matrigel. Utrzymuj matrycę piwnicy na lodzie przez cały czas. Przechowywać matrycę piwniczną w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie przed użyciem. Pożywka podstawowa odnosi się do Advanced DMEM/F12 uzupełnionego HEPES; odpowiednie źródło glutaminy, takie jak Glutamax i odpowiednie antybiotyki, takie jak 1x Primocin. Zastosowany inkubator to standardowy inkubator do hodowli komórkowych (37 °C, wilgotna atmosfera, 5% CO2 )
    1. Sterylizuj przybory przygotowawcze przez autoklawowanie lub przy użyciu 100% alkoholu izopropylowego: ostrych kleszczy, nożyczek, skalpela i szklanego szkiełka mikroskopowego.
    2. Dzień przed izolacją umieścić w inkubatorze 24-dołkową płytkę do hodowli komórek.
    3. Przygotuj matrycę piwnicy zgodnie z zaleceniami producentów. Przygotować porcje po 1 ml, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
    4. Przygotować 500 ml buforu chelatującego i ostudzić na lodzie. Przygotować 1x bufor ze sterylnej wody destylowanej z 5,6 mM Na2HPO4, 8,0 mM KH2PO4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM sacharozy, 54,9 mM D-sorbitol, 0,5 mM DL-ditiotreitol (UWAGA), pH 7. Jeśli planujesz kilka izolacji, przygotuj 5x stężony roztwór bez DL-ditiotreitolu. Sterylny przefiltrować bufor. Przed izolacją rozcieńczyć 5x bufor sterylną wodą do 1x i dodać DL-ditiotreitol tuż przed izolacją.
    5. Przygotować i rozcieńczyć wszystkie czynniki wzrostu zgodnie z zaleceniami producentów. Używaj małych porcji i unikaj cykli zamrażania i rozmrażania. Funkcjonalne czynniki wzrostu mają kluczowe znaczenie dla wyników.
    6. Schłodzić podłoże podstawowe na lodzie i schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
    7. Ogrzać kolejną porcję podłoża podstawowego do temperatury 37 °C.
  2. Izolacja gruczołów
    1. Zebrać około 1 cm² tkanki w lodowato zimnym podłożu podstawowym. Trzymaj na lodzie do czasu przygotowania. Chociaż zaleca się jak najszybsze przetworzenie tkanki, w razie potrzeby przechowuj tkankę w podłożu na lodzie.
    2. Umieść tkankę na 10 cm szalce Petriego i przykryj ją zimnym buforem chelatacyjnym 1x. Umyj, delikatnie poruszając się w przód iw tył.
    3. Umieść chusteczkę na suchej 10 cm szalce Petriego. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń śluz, a także warstwę mięśniową pod mikroskopem stereoskopowym. Umyj tkankę w zimnym buforze chelatującym 1x, delikatnie poruszając się w przód iw tył.
    4. Umieść 1 cm2 chusteczki na nowej, suchej 10 cm szalce Petriego. Za pomocą nożyczek pokrój go na 20-50 małych kawałków o wielkości około 2-5 mm².
    5. Za pomocą kleszczy umieść wszystkie kawałki w probówce o pojemności 50 ml.
    6. Weź sterylną plastikową pipetę o pojemności 10 ml. Zwilżyć pipetę w 1x buforze chelatującym. Używaj tej samej pipety przez cały czas trwania zabiegu.
    7. Dodać 10 ml zimnego buforu chelatującego 1x do probówki o pojemności 50 ml. Umyj kawałki, energicznie pipetując w górę i w dół 10 razy. Niech kawałki się usiądą. Usunąć supernatant.
    8. Powtarzać płukanie (krok 1.2.7) aż do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Potrzeba około 50-100 ml 1x buforu chelatującego na 1 cm² tkanki ludzkiej.
    9. Inkubować kawałki tkanek w 20 ml 1x bufor chelatujący uzupełniony 10 mM EDTA w temperaturze RT przez 10 minut z delikatnym odwracaniem co 2 min.
      Uwaga: Czas i temperaturę tej inkubacji można zoptymalizować pod kątem szybkości i/lub zachowania architektury gruczołowej. Mogą one trwać od kilku godzin inkubacji w temperaturze 4 °C na platformie rolkowej do 5 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce o prędkości 200 obr./min. Dobrym punktem wyjścia dla żołądka myszy jest 30 min w 4 °C na platformie na kółkach, a dla ludzkiego żołądka 10 min w temperaturze mokrej.
    10. Raz delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pozwól kawałkom osiąść. Odrzucić supernatant.
    11. Za pomocą pipety przenieś kawałki na czystą 10-centymetrową szalkę Petriego. Usuń płyn.
    12. Umieść szklane szkiełko mikroskopowe na kawałkach tkanki. Obserwuj nienaruszoną tkankę pod odwróconym mikroskopem pod kątem hodowli komórkowej w 10-krotnym powiększeniu.
    13. Wywierać nacisk na szkiełko podstawowe i szalkę Petriego. Trzymaj oba w dłoni (w sterylnych rękawiczkach) i dociskając szklankę kciukiem. Brzeg tkanki będzie wyglądał na mętny, co oznacza, że gruczoły są uwalniane z tkanki.
    14. Obserwuj uwolnione gruczoły pod odwróconym mikroskopem do hodowli komórek z 10-krotnym powiększeniem.
    15. Zebrać gruczoły i tkanki w 30 ml zimnego podłoża podstawowego. Niech duże fragmenty tkanek osiądą.
    16. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający gruczoły do dwóch probówek o pojemności 15 ml.
    17. Odwirować 5 minut przy 200 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane gruczoły. Trzymaj je na lodzie.
  3. Wysiew gruczołów
    1. Do siewu utrzymuj matrycę piwniczną przez cały czas lodowatą, aby pozostała płynna.
    2. Alternatywa 1: Wysiew 6 dołków rzędu rozcieńczania.
      1. Zawiesić osad w 60 μl matrycy podstawowej.
      2. Przygotować 5 sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml na lodzie, z których każda zawiera 50 μl matrycy podstawowej. Przenieść 10 μl zawiesiny gruczołów/macierzy podstawnej do pierwszej probówki o pojemności 1,5 ml. Zawiesić gruczoły i przenieść 10 μl tego roztworu do następnej probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz dla następnych probówek.
    3. Alternatywa 2: Wysiej obliczoną ilość gruczołów na dołek. Zacznij od 100 gruczołów na 50 μl macierzy podstawowej w jednym dołku na 24-dołkowej płytce.
      1. Ostrożnie zawiesić granulowane gruczoły w 10 ml podłoża podstawowego. Umieścić 50 μl na czystej szalce Petriego o pojemności 10 ml. Policz liczbę gruczołów pod odwróconym mikroskopem do hodowli komórkowej przy 10-krotnym powiększeniu.
      2. Oblicz stężenie gruczołów w roztworze. Przenieść objętość zawierającą 400 gruczołów do nowej probówki o pojemności 15 ml.
      3. Odwirować przez 5 minut w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i trzymać probówkę na lodzie. Dodać 200 μl matrycy podstawowej i ostrożnie zawiesić. Trzymaj na lodzie.
    4. Pobrać ciepłą płytkę 24-dołkową o temperaturze 37 °C (patrz krok 1.1.2) z inkubatora. Umieść jedną kroplę 50 μl gruczołów w matrycy piwnicznej na środku studzienki. Kropla utworzy kopułę.
    5. Ostrożnie przenieść płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Pozwól matrycy piwnicznej zestalić się przez 10 minut.
    6. Przygotuj ciepłe podłoże ze wszystkimi czynnikami wzrostu.
      1. Dla gruczołów ludzkich: Uzupełnij podłoże podstawowe następującymi czynnikami wzrostu dla organoidów żołądka ludzkiego: 50 ng/ml EGF, 10% pożywka kondycjonowana noggin, 10% pożywka kondycjonowana R-spondyną1, pożywka 50% pożywka kondycjonowana Wnt, 200 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)10, 1 nM gastryna i 2 μM inhibitor TGFbeta i 10 μM rho związany z rho inhibitor kinazy serynowo-treoninowej tworzącej spiralę tworzącą cewkę (RHOKi).
      2. W przypadku gruczołów mysich: Uzupełnij podłoże podstawowe następującymi czynnikami wzrostu organoidów żołądka myszy: 50 ng/ml EGF, 10% pożywka kondycjonowana noggin, 10% pożywka kondycjonowana R-spondyną1, pożywka kondycjonowana 50% pożywka kondycjonowana Wnt, 100 ng/ml FGF10, 10 nM gastryna, 0,5 mM inhibitor TGFbeta i 10 μM RHOKi.
    7. Wyjmij płytkę z inkubatora. Ostrożnie dodać 500 μl pożywki ze wszystkimi czynnikami wzrostu (1.3.6) do każdej studzienki, nie naruszając matrycy podstawowej. Umieść go z powrotem w inkubatorze.
    8. Odświeżaj podłoże 3 razy w tygodniu (co 2-3 dni). Aby odświeżyć podłoże, usuń stare podłoże, pozostawiając nienaruszoną kroplę matrycy podstawowej. Ostrożnie dodaj świeże, ciepłe podłoże ze wszystkimi czynnikami wzrostu. Nie dodawaj RHOKi. Dodawać RHOKi bezpośrednio po wysianiu gruczołów lub po rozszczepieniu organoidów (krok 2).

2. Przejście hodowli organoidów żołądkowych przed mikroiniekcją.

Uwaga: Każdy rodzaj hodowli organoidów ma swój własny czas podwojenia. Posiewy jelitowe i żołądkowe myszy są zwykle dzielone 1:5 co 5-7 dni. Ludzkie posiewy jelitowe dzieli się 1:5 co 10-12 dni. Posiewy żołądkowe u ludzi dzieli się w stosunku 1:5 co 14 dni. W przypadku zainicjowania z pojedynczych komórek, ludzkie organoidy żołądkowe mogą również potrzebować 20 dni, aby prawidłowo się uformować. To dobry znak, jeśli pączkujące struktury otaczają centralne światło. W tym protokole organoidy są dzielone na 4-dołkowe płytki do mikroiniekcji. Utrzymanie organoidów odbywa się zgodnie z tym samym protokołem, ale można użyć dowolnej innej płytki do hodowli komórkowych, takiej jak standardowe 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych.

  1. Przygotowanie materiału
    1. Autoklaw Pipety Pasteura.
    2. Dzień przed pasażem umieścić 4-dołkową płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Płytki z 4 dołkami mają niskie krawędzie i umożliwiają mikromanipulację.
    3. Przygotuj matrycę piwnicy zgodnie z zaleceniami producentów. W dniu pasażu rozmrozić matrycę piwniczną na lodzie.
    4. Przygotować i rozcieńczyć wszystkie czynniki wzrostu zgodnie z zaleceniami producentów.
    5. Schłodzić podłoże podstawowe na lodzie i schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Przejście kultur organoidowych
    1. Pobrać płytkę z organoidami z inkubatora. Usuń podłoże z jednej studzienki.
    2. Dodaj 1 ml zimnego podłoża podstawowego do matrycy podstawowej w studzience. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml energicznie pipetuj w górę i w dół, aż matryca podstawowa zostanie rozbita. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Ułóż na lodzie.
    3. Weź szklaną pipetę Pasteura i źródło ognia, takie jak palnik Bunsena.
      1. Trzymaj końcówkę pipety w ogniu, aż otwór końcówki zwęzi się z 1,5 mm do około 0,5 mm (Rysunek 1). Poczekaj, aż pipeta ostygnie do temperatury regulowanej.
      2. Zwilż pipetę w podłożu podstawowym. Optymalnie zwężona pipeta będzie pobierać medium widocznie wolniej niż pipeta bez zwężenia, ale nadal pozwoli na dobre pipetowanie.
    4. Weź organoidy z pipety i energicznie pipetuj 10 razy w górę iw dół. Rozpad organoidów można zaobserwować gołym okiem.
    5. Dodać 9 ml zimnego podłoża podstawowego i wirować przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Ostrożnie wyrzucić cały supernatant. Zawiesić osad w matrycy podstawowej o pojemności 250 μl. Trzymaj na lodzie.
    7. Wziąć ciepłą 4-dołkową płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C i umieścić kroplę 50 μl organoidów/matrycy podstawowej w każdym dołku.
    8. Ostrożnie przenieść płytkę z powrotem do inkubatora. Pozostawić matrycę podstawową do zestalenia się w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    9. Przygotować odpowiednią pożywkę dla organoidów mysich lub ludzkich, jak podano w kroku 1.3.6.
    10. Wyjąć płytkę z inkubatora i pokryć każdą kroplę matrycy podstawowej podłożem o objętości 500 μl.
    11. Przenieś płytkę do inkubatora.
    12. Odświeżaj pożywkę 3 razy w tygodniu co 2-3 dni (patrz 1.3.8.).
    13. W celu zamrożenia organoidów należy je mechanicznie rozbić, jak opisano w niniejszym protokole (kroki 2.2.1-2.2.5). Zawiesić fragmenty organoidów w 500 ml pożywki zamrażającej i zamrozić do temperatury -80 °C za pomocą krioprobówek i pojemnika do zamrażania. W celu długotrwałego przechowywania przenieś probówki do ciekłego azotu.
    14. Do rozmrażania organoidów należy przygotować płytkę hodowlaną, matrycę podstawową, czynniki wzrostu, zimne i ciepłe podłoże, jak opisano w krokach 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Ogrzać zamrożoną fiolkę w łaźni wodnej i natychmiast po rozmrożeniu przenieść komórki do 15 ml probówki z 10 ml zimnego podłoża podstawowego. Odwirować i pokryć płytki komórki, jak opisano w ppkt 2.2.5 do 2.2.12.
      Uwaga: Mikroiniekcja organoidów jest pracochłonna, ale daje unikalną możliwość badania interakcji w 3D.
    15. Jeśli badania 3D nie są potrzebne, organoidy nasienne w dwóch wymiarach. W tym celu należy rozbić organoidy zgodnie z krokami 2.2.1 do 2.2.6. Dodać 2,250 μl zimnej pożywki ze wszystkimi czynnikami wzrostu do 250 μl macierzy podstawowej z fragmentami organoidów.
      1. Wysiewać nasiona w 5 dołkach na 24-dołkowej płytce po 500 μl na studzienkę. Zmieniaj podłoże 3 razy w tygodniu, ostrożnie wymieniając tylko górne 400 μl, aby nie naruszyć matrycy podstawowej na dole płyty.
        Uwaga: Organoidy przyczepiają się do płytki hodowli komórkowej i rozszerzają się w 2D. Mikroskopia elektronowa wykazała, że wierzchołkowa strona komórek jest skierowana w stronę pożywki w studzience (dane nie pokazane).
      2. Przed infekcją wymień całe podłoże, w tym macierz podstawną, aby umożliwić bakteriom przyczepienie się do komórek. Podobny protokół został również opisany w przypadku zakażenia H. pylori14. Warstwy komórek 2D mogą zawierać nie wszystkie typy komórek, które są obecne w organoidach 3D.

3. Mikroiniekcja hodowli organoidów.

Uwaga: Ten protokół może być używany do mikrowstrzykiwania bakterii do organoidów. Pomocne może być rozpoczęcie iniekcji od organoidów, które są bardziej podatne na mikroiniekcje. Na przykład organoidy żołądka myszy mogą wyrosnąć na bardzo duże organoidy torbielowate, które są łatwe do namierzenia.

  1. Przygotowanie materiału
    1. Pobrać szklaną kapilę do dwóch igieł iniekcyjnych za pomocą ściągacza do mikropipet, zgodnie z zaleceniami producenta. Ściągacz do mikropipet podgrzeje szklaną kapilarnę w środku i rozciągnie kapilarnę na dwie części, tworząc w ten sposób dwie szklane igły. Praktyczne jest wyciągnięcie kilku igieł i przechowywanie ich na czystej szalce Petriego.
    2. Aby umożliwić infekcję bakteryjną, usuń antybiotyki ze wszystkich pożywek na co najmniej 3 zmiany pożywki (= jeden tydzień). Spowoduje to rozcieńczenie antybiotyków z macierzy podstawnej. Jeśli używasz szczepu bakteryjnego, który jest oporny na określony antybiotyk, dodaj ten konkretny antybiotyk, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.
    3. Przygotować stół roboczy do mikroiniekcji. W przypadku pracy na różnych poziomach bezpieczeństwa biologicznego może być konieczne umieszczenie mikroskopu stereoskopowego w sterylnym laboratorium. W tym protokole należy wstrzyknąć H. pylori w warunkach bezpieczeństwa biologicznego 2 pod mikroskopem stereoskopowym w sterylnej ławce.
    4. Hoduj bakterie zgodnie ze standardowymi protokołami13,23.
    5. Aby oszacować liczbę infekcji (MOI), oszacuj dwa parametry: liczbę bakterii i liczbę komórek w organoidzie, jak opisano poniżej. MOI może korelować z wynikami, na przykład z ekspresją mRNA IL-8 gospodarzy13.
      1. Aby obliczyć gęstość bakterii w roztworze infekcyjnym, należy najpierw ustalić standardową krzywą gęstości optycznej i jednostek tworzących kolonie (CFU) zgodnie ze standardowymi protokołami24. Gęstość optyczna 0,1 przy 550 nm powinna dawać około 10-7 jtk/ml.
      2. Aby oszacować liczbę komórek na organoid, policz liczbę organoidów w 1 dołku. Rozbić organoidy zgodnie z opisem w krokach 2.2.1-2.2.4. Po odwirowaniu przez 5 minut w temperaturze 200 x g i w temperaturze 4 °C, dodać 1 ml enzymatycznego roztworu dysocjacyjnego i zawiesić.
        1. Inkubować w temperaturze 37 °C z wielokrotnym wytrząsaniem przez 5-10 minut. Określić, czy komórki dysocjowały na pojedyncze komórki pod mikroskopem (mikroskop odwrócony, taki jak Leica DMIL przy 10-krotnym powiększeniu). W razie potrzeby przedłużyć inkubację.
        2. Policz komórki na organoid za pomocą hemocytometru i oblicz liczbę komórek na organoid. Ludzkie organoidy żołądkowe o średnicy około 200 μm mają około 4 000 komórek. Wstrzyknięcie 0,2 μl roztworu bakteryjnego z 1 x 109 bakterii na ml daje przybliżony MOI wynoszący 50.
  2. Iniekcja organoidów.
    Uwaga: W przypadku mikroiniekcji szklana igła jest stabilizowana w uchwycie, którym można manewrować w 3 wymiarach za pomocą mikromanipulatora. Organoidy pozostają w macierzy piwnicznej w studni. Ze względu na rozmiar i umiejscowienie w studni nie wszystkie organoidy są jednakowo podatne na wstrzykiwanie. Zazwyczaj 30 największych organoidów w jednym dołku można namierzyć w ciągu 5 minut.
    1. Zbierz bakterie i umyj je w podłożu podstawowym zgodnie ze standardowymi protokołami24.
    2. Obliczyć liczbę bakterii w ml zgodnie z gęstością optyczną (patrz krok 3.1.5.1). Rozcieńczyć bakterie do 1 x 109 bakterii na ml w podłożu podstawowym.
    3. Weź szklaną igłę. Za pomocą kleszczy rozbij końcówkę tak, aby otwór miał szerokość około 10 μm.
    4. Włożyć igłę do uchwytu do wstrzykiwań i przymocować ją do mikromanipulatora.
    5. Pobrać około 10 μl roztworu bakteryjnego do igły.
    6. Umieścić 4-dołkową płytkę z niskimi krawędziami zawierającą kultury organoidów pod mikroskopem stereoskopowym.
    7. Poruszając się za pomocą mikromanipulatora, namierz igłą pojedynczy organoid. Umieść igłę blisko organoidu, a następnie włóż igłę do organoidu jednym szybkim ruchem. Wstrzyknąć około 0,2 μl roztworu bakteryjnego do każdego organoidu za pomocą mikroiniektora.
  3. Zbieraj organoidy do dowolnej analizy.
    1. Na przykład, utrwalić organoidy po 4 godzinach. Usunąć supernatant i dodać 1 ml 2% formaldehydu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Organoidy można przetworzyć do celów immunohistochemicznych zgodnie ze standardowymi procedurami25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia izolację gruczołów żołądkowych (Rycina 2). Gruczoły są osadzane w macierzy podstawowej, która krzepnie w postaci kropelki wewnątrz dołka, zapewniając trójwymiarową strukturę bogatą w lamininę i kolagen, co pozwala gruczołom na wzrost w organoidy (Rycina 3). Organoidy zazwyczaj zaczynają jako małe cysty, a w ciągu 12-16 dni przekształcają się w sfery o średnicy 50-300 µm (Rycina 4). Niektóre organoidy pozostaną w formie cystycznej, inne rozwin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje wykorzystanie stale rozrastających się, nieprzekształconych pierwotnych organoidów z dorosłych komórek macierzystych do biologii infekcji. Kluczowymi etapami są: i) izolacja żywotnych gruczołów, ii) ekspansja organoidów oraz iii) mikroiniekcja. Poniżej znajduje się kilka sugestii dotyczących modyfikacji, rozwiązywania problemów i rozważań technicznych.

W porównaniu z innymi metodami izolacji, które wykorzystują energiczne wytrząsanie lub pipetowanie w celu uwolnienia gruc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Hans Clevers jest wynalazcą kilku patentów na hodowlę organoidów. Poza tym autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) dla S.B. oraz nagrodę badawczą od United European Gastroenterology Foundation dla H.C. Chcielibyśmy podziękować Harry'emu Begthelowi, Jeroenowi Korvingowi i Hubrecht Imaging Center za pomoc techniczną, Meritxell Huch za pomoc we wstępnej hodowli organoidów oraz Yanie Zavros za dyskusję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Medium
HEPESInvitrogen15630-056
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
Matrigel, GFR, bez fenoluBD356231
GlutaMAXInvitrogen35050-079Stężenie magazynowe 200 mM, stężenie końcowe 2 mM
B27Invitrogen17504-044Stężenie magazynowe 50 x, stężenie końcowe 1x
N-AcetylocysteinaSigma-AldrichA9165-5GStężenie zapasowe 500 mM, stężenie końcowe 1 mM
Rekombinant mysi EGFInvitrogenPMG8043Stężenie magazynowe 500 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 50 ng/ml
Ludzki rekombinant FGF10Peprotech100-26Stężenie podstawowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 200 ng/ml
TGFβ i A-83-01Tocris2939Stężenie w magazynie 500 &mikro; M, stężenie końcowe 2 i mikro; M 
NikotynamidSigma-AldrichN0636Stężenie magazynowe 1 M, stężenie końcowe 10 mM 
[Leu15]-GastrinSigma-AldrichG9145Stężenie zapasów 100 &mikro; M, stężenie końcowe 1 nM
RHOKi Y-27632Sigma-AldrichY0503Stężenie wyjściowe 10 mM, stężenie końcowe 10 &mikro;
kondycjonowana M Wnt3AStabilna linia komórkowa wytworzona w laboratorium Clevers. Stężenie końcowe 50%. Ogniwa można uzyskać od Hansa Cleversa.
kondycjonowana R-spondyną1Stabilna linia komórkowa wytworzona w laboratorium Kuo. Stężenie końcowe 10%. Linię komórkową można uzyskać od Calvina Kuo ze Stanforda.
kondycjonowana NogginStabilna linia komórkowa wygenerowana w Clevers Lab. Stężenie końcowe 10%. Ogniwa można uzyskać od Hansa Cleversa.
R-spondyna3R& D3500-RS/CFAlternatywne źródło R-spondyny. Zostało to przetestowane na organoidach jelit ludzkich (1 &mikro; g/ml), ale jeszcze nie na organoidach żołądka.
NogginPeprotech120-10Alternatywne źródło dla noggin. Zostało to przetestowane na organoidach jelita ludzkiego (100 ng/ml), ale jeszcze nie na organoidach żołądkowych.
TrypLE expressLife Technologies12605036Enzymatyczne rozwiązanie dysocjacyjne 
CoolCell® Bezalkoholowe pojemniki do zamrażania komórekbiocyzjaBCS-405
Recovery Cell Culture Freezing MediumInvitrogen12648-010
Antybiotyki
PrimocinInvivogenant-pm-1Kompozycja antybiotykowa przeciwko bakteriom i grzybom. Jest pomocny po zainicjowaniu kultury. W przypadku długotrwałej hodowli można przejść na inne antybiotyki lub nie stosować ich wcale.
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-122Stężenie podstawowe 10 000/10 000 U/ml, stężenie końcowe 100/100 U/ml. Może być stosowany alternatywnie do Primocin w długotrwałej hodowli.
Pęseta Other
TweezersNeolabs2-1033Pęseta z cienkimi końcówkami jest pomocna w usuwaniu warstwy mięśniowej z tkanki.
4 WellesMultidish Thermo Scientific144444Możesz użyć innych Multidish. Były one szczególnie pomocne w przypadku mikroiniekcji, ponieważ mają niską zewnętrzną krawędź i pozwalają manipulatorowi na większą mobilność.
MikromanipulatorNarishigeM-152
MikrowtryskiwaczNarishigeIM-5B
StereoskopLeicaMZ75
Stół warsztatowyCzyste powietrzeWykonane na zamówienie, aby pasowało do mikroskopu stereoskopowego w stanie ML2
KapilaryAparat HarvardGC100T-10Średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,78 mm.
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsPłonący brązowy ściągacz
anty Cag A przeciwciało SantaCruzsc-25766
Pożywka Pożywka Pożywka do mikropipet

Bibliografia

  1. Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).
  2. Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13(2013).
  3. Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
  4. Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
  5. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  6. Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617(2012).
  7. Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
  8. Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
  9. Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
  10. Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
  11. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  12. McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  13. Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
  14. Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
  15. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663(2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  19. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  20. Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  23. Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21(2010).
  24. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
  25. Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
  26. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
  27. Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
  28. Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
  29. Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  30. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871(2013).
  31. Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
  32. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  33. Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
  34. Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Organoidy żołądkahodowla organoidówtechnika mikroiniekcjigruczoły żołądkowemacierz podstawowaczynniki wzrostuhodowla komórkowabarwienie immunohistochemicznemodyfikacje genetyczne
Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.