Method Article

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

DOI:

10.3791/53362

⸱

November 19th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology, University of Maryland, 4College of Engineering, University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych. Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych. W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MscL, duży kanał mechanowrażliwy na przewodnictwo (MSC), to wszechobecny zawór uwalniający osmolit, który pomaga bakteriom przetrwać nagłe wstrząsy hipoosmotyczne. Został odkryty i rygorystycznie badany przy użyciu techniki patch-clamp przez prawie trzy dekady. Jego podstawowa rola polegająca na przekształcaniu napięcia przyłożonego do błony komórkowej na odpowiedź przepuszczalności sprawia, że jest silnym kandydatem do pełnienia funkcji przetwornika mechanoelektrycznego w urządzeniach biomolekularnych opartych na sztucznej membranie. Służąc jako elementy składowe takich urządzeń, dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB) mogą być używane jako nowa platforma do włączania i stymulacji kanałów MscL. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na mikropipetach do tworzenia DIB i pomiaru aktywności wbudowanych kanałów MscL. Metoda ta składa się z kropelek wodnych pokrytych lipidami zakotwiczonych na końcach dwóch przeciwległych (współosiowo ustawionych) mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Kiedy kropelki stykają się, tworzy się dwuwarstwowy interfejs lipidowy. Technika ta zapewnia kontrolę nad składem chemicznym i wielkością każdej kropli, a także wymiarami dwuwarstwowego interfejsu. Posiadanie jednej z mikropipet podłączonych do harmonicznego siłownika piezoelektrycznego zapewnia możliwość dostarczenia pożądanego bodźca oscylacyjnego. Poprzez analizę kształtów kropel podczas odkształcania można oszacować naprężenie powstające na granicy faz. Za pomocą tej techniki raportowana jest pierwsza aktywność kanałów MscL w systemie DIB. Oprócz kanałów MS, za pomocą tej metody można badać aktywność innych typów kanałów, co dowodzi wielofunkcyjności tej platformy. Przedstawiona tutaj metoda umożliwia pomiar podstawowych właściwości błony, zapewnia większą kontrolę nad powstawaniem błon symetrycznych i asymetrycznych oraz jest alternatywnym sposobem stymulacji i badania kanałów mechanowrażliwych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, montaż sztucznych dwuwarstw lipidowych został znacznie zaawansowany dzięki rozwojowi metody dwuwarstwowej interfejsu kropelkowego. Znane jako stabilne i wytrzymałe, DIBy narzuciły się jako alternatywne systemy modelowe dla klasycznych malowanych (Mueller) i składanych (Montal-Mueller) płaskich dwuwarstw1. Chociaż pomysł wykorzystania kropelek do tworzenia dwuwarstw lipidowych sięga lat 60. XX wieku2, do niedawna nie zyskał na popularności. Pierwsza udana próba została zgłoszonaprzez grupę Takeushi 3, po której nastąpiło kilka badań demonstrujących tworzenie się dwuwarstw przy użyciu sieci kropel przez grupę Bayleya4-6. Ostatnio techniki enkapsulacji zostały zaproponowane przez grupę7-9 Lwa, która zapoczątkowała koncepcję wykorzystania DIB jako elementów budulcowych nowych systemów materialnych reagujących na bodźce10. W poprzednich badaniach DIB udowodniły swoją zdolność do reagowania na bodźce elektryczne9,11, chemiczne10,12 i optyczne13. Różne biomolekuły o różnych funkcjach reagujących na bodźce zostały skutecznie stymulowane po rozpuszczeniu w DIB10,14. W świetle tych udanych prób nasuwa się ważne pytanie: czy DIB może reagować na bodziec mechaniczny, gdy włączy się odpowiednie biomolekuły? Siły międzyfazowe działające na DIB różnią się od tych występujących w innych układach dwuwarstwowych15,16. W związku z tym napięcie w dwuwarstwie utrzymywane przez kropelki można kontrolować poprzez regulację napięcia na granicy faz woda-lipid-olej; Koncepcja ta nie ma zastosowania w przypadku malowanych lub składanych systemów dwuwarstwowych.

Kanały MscL, powszechnie znane jako zawory spustowe osmolitu i podstawowe elementy bakteryjnej błony cytoplazmatycznej, reagują na zwiększone napięcie błony17,18. W przypadku wstrząsów hipoosmotycznych kilka kanałów znajdujących się w błonie małej komórki19 może wygenerować potężną odpowiedź przepuszczalności, aby szybko uwolnić jony i małe cząsteczki, ratując bakterie przed lizą20. Biofizycznie MscL jest dobrze zbadany i scharakteryzowany przede wszystkim za pomocą techniki wydatnego zacisku punktowego21-23. Wiarygodne modele strukturalne wyjaśniające mechanizm bramkowania MscL24,25 są proponowane na podstawie struktury krystalicznej jego homologu26,27, modelowania28 i wyników szeroko zakrojonych eksperymentów 24,29-31. Pod przyłożonym napięciem ~10 mN/m, zamknięty kanał, który składa się ze ciasnego wiązki helis transbłonowych, przekształca się w pierścień bardzo nachylonych helis, tworząc ~28 A wypełniony wodą przewodzący por21,24,32. Ustalono również, że hydrofobowość ciasnej bramki, umieszczonej na przecięciu wewnętrznych domen TM1, określa próg aktywacji kanału33. W związku z tym stwierdzono, że zmniejszając hydrofobowość bramy, można obniżyć próg naprężenia22. Ta właściwość MscL umożliwiła zaprojektowanie różnych zaworów sterowalnych34, głównie do celów dostarczania leków. Pomimo wszystkich wyżej wymienionych właściwości i w oparciu o swoją fundamentalną rolę polegającą na przekształcaniu nadmiernych napięć błony komórkowej w czynności elektrofizjologiczne, MscL doskonale nadaje się jako przetwornik mechanoelektryczny w DIB.

W tym artykule prezentujemy oryginalną metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach i mierzenia aktywności włączonych kanałów MscL pod wpływem stymulacji mechanicznej. Po raz pierwszy donosimy o odpowiedzi DIB na bodziec mechaniczny i funkcjonalnej rekonstytucji niskoprogowego mutanta V23T MscL w DIBs35.

System eksperymentalny składa się z zamkniętych w lipidach kropelek wodnych zakotwiczonych na końcach dwóch przeciwległych mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Kiedy kropelki stykają się z dwuwarstwowym interfejsem lipidowym. Technika ta zapewnia kontrolę nad składem chemicznym i wielkością każdej kropli (masy), a także nad wymiarami granicy faz dwuwarstwowych. Ponadto można łatwo utworzyć asymetryczne błony o różnym składzie lipidowym w każdej ulotce. Posiadanie jednej z mikropipet podłączonych do harmonicznego siłownika piezoelektrycznego zapewnia możliwość zastosowania zaprogramowanego bodźca jednocyklowego lub oscylacyjnego. Napięcie jest dostarczane do sztucznej membrany poprzez ściskanie obu podtrzymujących ją kropel. W wyniku deformacji kropel zwiększają się obszary granicy faz woda-lipid-olej, a jednocześnie zmniejsza się kąt między kropelkami, powodując wzrost napięcia błony i przejściową aktywację MscL. Poprzez analizę kształtów kropel podczas odkształcania można było oszacować naprężenie powstające na granicy faz. Chociaż w tym artykule skupiamy się na właściwościach mechano-transdukcji DIB, podkreślamy również, że inne rodzaje biomolekuł, takie jak alatetycyna, mogą być aktywowane przez tę wielofunkcyjną platformę. Poniżej krok po kroku przedstawiamy wszystkie aspekty techniczne przygotowania, montażu i wykonywania pomiarów tą nową metodą.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hydrożeli PEG-DMA

  1. Wybrać odpowiedni pojemnik do odmierzania/mieszania (kolba, zlewka itp.) do danego zastosowania. Wyczyść go dokładnie za pomocą detergentu i wody, a następnie przetrzyj niestrzępiącymi się wycieraczkami chusteczkowymi.
  2. Nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia szkła olejami z opuszków palców. Wypłucz pojemnik wystarczającą ilością wody dejonizowanej, aby usunąć pozostałości detergentu.
  3. Przetrzyj pojemnik niestrzępiącą się chusteczką, aby pozbyć się wody, a następnie spryskaj alkoholem izopropylowym (IPA, 99,5%) i wytrzyj do czysta. Umieść go w komorze próżniowej, aby cały IPA całkowicie odparował. Resztę sprzętu laboratoryjnego używanego w procesie formowania hydrożelu należy oczyścić wodą destylowaną.
  4. Aby przygotować 40% (w/v) roztwór hydrożelu PEG-DMA, należy odważyć 4 g dimetakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEG-DMA; MW = 1 000 g/mol) przy użyciu skali laboratoryjnej.
  5. Umieścić zważony PEG-DMA w kolbie i podgrzewać za pomocą kąpieli sonikołacyjnej w temperaturze 45-55 °C, aż do upłynnienia stałego PEG-DMA. Podczas tego procesu przykryj otwór kolby Parafilmem/papierem woskowanym, aby woda nie dostała się do środka.
  6. Po skropleniu PEG-DMA dodać roztwór buforowy (500 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,0), aż całkowita objętość osiągnie ~10 ml (wystarczająca na kilka eksperymentów w okresie sześciu miesięcy).
  7. Dodać utwardzacz o stężeniu 0,5% (w/v). W takim przypadku dodać 0,05 g utwardzacza do 10 ml mieszaniny. Umieścić kolbę z powrotem w kąpieli sonikatora i pozwolić składnikom rozpuścić się w roztworze (około 10 minut, 250 watów).

UWAGA: Po dodaniu utwardzacza do roztworu, hydrożele utwardzają się (zestalają), jeśli są wystawione na działanie jakiegokolwiek źródła światła przez wystarczająco długi czas. Aby temu zaradzić, owinąć fiolkę/pojemnik czarną taśmą i przechowywać w ciemnym miejscu. Roztwór ten można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej (22 °C).

2. Przygotowanie liposomów

  1. Przygotować 10 ml roztworu lipidów o stężeniu 2 mg/ml, dodając 10 ml buforu (500 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,0) do 20 mg syntetycznych lipidów 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC) zakupionych w postaci liofilizowanego proszku. Upewnij się, że zarówno pęcherzyki lipidowe, jak i roztwór buforowy są dokładnie wymieszane (mieszanina powinna wyglądać na jednorodną i mętną, gdy wszystko jest rozpuszczone).
  2. Zamrażać (-20 °C) i całkowicie rozmrozić nową mieszaninę lipidów, w sumie sześć razy. Pozostaw mieszaninę do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, nigdy w ogrzewanym otoczeniu.
  3. Za pomocą dostępnej na rynku wytłaczarki wytłaczaj lipidy, przetłaczając całą zawiesinę lipidową najpierw przez filtr membranowy z poliwęglanu 0,4 μm, a następnie sześciokrotnie przez filtr membranowy 0,1 μm. W wyniku tego procesu powstają cząstki o średnicy bliskiej 100 nm (równej wielkości porów filtra).

UWAGA: Inne lipidy i proporcje lipidów mogą być przygotowane za pomocą tej metody. Liposomy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.

3. Izolacja i rekonstytucja MscL

  1. Usuń płytkę agarozową o temperaturze zawierającej 100 μg / ml ampicyliny, komórki E. coli MJF465 z plazmidem pB10b przenoszącym gen MscL V23T wydłużony znacznikiem 6-His na końcu 3' (C-koniec). Pozostawić płytkę do hodowli przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 37 °C w stacjonarnym inkubatorze. Plazmid jest wybierany i zatrzymywany w komórkach z ampicyliną 100 μg/ml w standardowym pożywce LB. Następnego dnia umieścić 20 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny w pęcherzyku hodowlanym (kolba o pojemności 50 ml lub to, co jest dostępne do przechowywania kultury). Weź płytkę, na której hodowano przez noc i wybierz z niej kolonię, aby przenieść (zaszczepić) do przygotowanej pożywki o pojemności 20 ml LB za pomocą sterylnego patyczka do zaszczepiania. Pozostawić 20 ml kultury do wzrostu przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 37 °C przy 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
  2. Zdekantować 20 ml kultury przez noc do 2-4 l pożywki LB. Ampicylina nie jest już wymagana. Wytrząsać kolby w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C, aż OD600 osiągnie 0,5. Dodać β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 0,6 mM i pozostawić kulturę na kolejną godzinę (do OD600 = 0,8-1,0).
  3. Umieścić kolby na lodzie, aby schłodzić kultury, a następnie zebrać bakterie przez odwirowanie. Użyj sześciu stożkowych probówek o pojemności 400 ml (lub tyle, ile pozwala na to zastosowany wirnik) i wiruj przez 5-8 minut przy 7,438 x g, co wystarcza do osadzania bakterii. Zdekantować supernatant i powtarzać procedurę, aż wszystkie komórki z pożywki zostaną pobrane. Liczba wymaganych spinów różni się w zależności od ilości wyhodowanej kultury i użytego wirnika. W przypadku hodowli o pojemności 2 litrów wystarczy tylko raz odwirować komórki. Przenieś wszystkie zebrane komórki do jednej probówki wirówkowej.
  4. Zawiesić granulki komórkowe w ~20 ml buforu do prasy francuskiej (100 mM KPi i 5 mM MgCl2, pH 7,4). Zawiesina powinna być gęsta (jak śmietana lub mleko). Bezpośrednio przed tłoczeniem zawiesiny we frengu dodać inhibitor proteazy fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) do końcowego stężenia 2 mM i energicznie wymieszać.
  5. Wyciśnij kulturę we Francji, w 35 ml komorze ciśnieniowej, w temperaturze od 10 000 do 16 000 psi. Odwirować zawiesinę, aby oddzielić nieuszkodzone komórki w temperaturze 7 438 x g, 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Umieścić supernatant w osobnej probówce i dodać do niego lizozym i DNazę (po 0,2 mg/ml). Pozostaw supernatant na 10 minut w temperaturze pokojowej.

UWAGA: DNaza jest opcjonalna; zmniejsza lepkość podczas wirowania z dużą prędkością. Lizozym ma kluczowe znaczenie; Trawi resztki ściany komórkowej i pomaga zwiększyć wydajność ekstrakcji membranowej wykonanej za pomocą łagodnego, niedenaturującego detergentu.

  1. Mieszaninę supernatantu rozprowadzić do dwóch probówek ultrawirówek i wirować je w temperaturze 106,883-153,911 x g (w zależności od rotora) w temperaturze 4 °C przez 40 minut. Po odwirowaniu supernatant jest dekantowany, a brązowawy osad na dnie (całkowita frakcja membranowa) może zostać zamrożony w probówce do długotrwałego przechowywania (-80 °C) lub wykorzystany do natychmiastowego oczyszczenia białka.
  2. Przygotować 0,5-1 l buforu o wysokiej zawartości imidazolu: 100 mM NaCl + 500 mM imidazolu, miareczkować do pH 7,2-7,4 za pomocą stężonego HCl. Należy pamiętać, że imidazol sam w sobie jest dobrą substancją buforową.
  3. Przygotować 0,5-1 l buforu o niskiej zawartości imidazolu: 100 mM NaCl, + 15 mM imidazolu, odpowiednio rozcieńczając powyższy bufor 100 mM NaCl. Nie jest wymagana regulacja pH.
  4. Weź 100-150 ml każdego buforu w oddzielnych butelkach i dodaj 1% (w/v) glukopiranozydu b-oktylu (OG). Dobrze wymieszaj roztwór i przefiltruj go przez filtr 0,22 μm. Roztwory te są roztworami chromatograficznymi o niskiej i wysokiej zawartości imidazolu.
  5. Przygotować bufor ekstrakcyjny, pobrać 50 ml buforu o niskiej zawartości imidazolu, dodać 3% (w/v) OG i przefiltrować bufor.
  6. Do izolacji białek należy użyć granulek membranowych o masie 0,5-2 g mokrej masy. Dodać 5-7 ml buforu ekstrakcyjnego, ponownie zawiesić osad i homogenizować go w 30 ml ręcznie napędzanym homogenizatorze szklano-tłokowym. Za pomocą 5-10 delikatnych pociągnięć uzyskaj jednorodną zawiesinę bez grudek. Należy zachować ostrożność, wiadomo, że naprężenie ścinające powoduje denaturację białek.
  7. Odwirowywać nierozpuszczalne cząstki (wirówka średniej średnicy, wirnik o stałym kącie nachylenia, 38 478-68 405 x g, w temperaturze 4 °C przez 15 min). W międzyczasie wziąć 3 ml kulek Ni NTA (6 ml zawiesiny) i przemyć je raz buforem o niskiej zawartości imidazolu (bez OG), wstrząsając nimi w probówce z nakrętką o pojemności 15 ml. Pozwól koralikom osiąść na dnie (~ 5-7 min) lub wiruj je w temperaturze 129-201 x g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Po uformowaniu się osadu ostrożnie ręcznie zdekantować supernatant i powtórzyć procedurę. Zrównoważyć kulki z 2-3 ml 3% buforu ekstrakcyjnego OG.
  8. Zmieszać homogenizowaną mieszaninę (osadek membranowy i bufor ekstrakcyjny) z 3.12 z 3-3,5 ml kulek Ni NTA. Pozwól mieszance zanurzyć się w zakręcanej tubie przez 60 minut (ładowanie partiami). Odwirować kulki w tempie 201 x g (30 sekund), ręcznie zdekantować supernatant i raz umyć kulki 1% buforem OG o niskiej zawartości imidazolu. Ponownie otopić kulki jak w ppkt 3.13 i ponownie zawiesić je w 20-30 ml świeżego buforu o niskiej zawartości imidazolu.
  9. Zapakuj małą kolumnę (wyposażoną w górny adapter przepływu) z kulkami Ni NTA i pozwól kulkom osiąść, otwierając kurek, aby ekstrakt mógł przepłynąć (nie pozwól, aby kulki wyschły). Przemyć kulki jedną porcją 10 ml buforu o niskiej zawartości imidazolu (1% OG) przy otwartym kurku odcinającym.
  10. Obciążyć maszynę chromatograficzną czystymi o niskiej i wysokiej zawartości imidazolu po około 25 ml każdego z nich przy określonym przez maszynę natężeniu przepływu (w zależności od maszyny); odbywa się to poprzez uprzednie przepuszczenie buforu o niskiej zawartości imidazolu przez system. Wyzeruj rejestrator optyczny na OD260 (linia bazowa). Należy pamiętać, że bufor różni się znacznie od wody, ponieważ imidazol niskiej jakości zawiera zanieczyszczenia, które pochłaniają promieniowanie UV. Włóż adapter przepływu do kolumny i przymocuj go do maszyny.
  11. Ponownie przepłukać kolumnę buforem o niskiej zawartości imidazolu (o stężeniu 1 ml/min) do momentu, gdy OD przepływającego przepływu osiągnie linię podstawową (może to zająć 10-20 ml). Spowoduje to usunięcie niezwiązanych białek z kolumny.
  12. Stosować liniowy gradient imidazolu od 20 do 500 mM przez 30 minut w tempie 1 ml/min. Rozpocząć zbieranie 4 ml frakcji, gdy OD600 wykazuje wzrost. Pierwsze dwie frakcje są pełne luźno związanych białek, podczas gdy MscL-6His rozpoczyna elucję przy ~40% gradientu liniowego. Większość białka występuje we frakcjach od 3 do 8,
    UWAGA: zaobserwuje się liniowy wzrost OD ze względu na rosnący % imidazolu.
  13. Połącz ze sobą ułamki 3-4, 5-6 i 7-8. Opcjonalnie należy zagęścić frakcje pojedynczo. Zagęścić frakcje 6-10 krotnie za pomocą filtrów odśrodkowych. Po 20 minutach wirowania w temperaturze 804 x g i w temperaturze 4 °C, ostrożnie zawiesić skoncentrowane białko, białko ma tendencję do przyklejania się do filtra.
  14. Pobrać 50 μl podwielokrotności, wymieszać je z buforem próbki SDS i sprawdzić czystość białka za pomocą elektroforezy żelowej PAGE.
    UWAGA: MscL będzie migrować jako rozmyte pasmo około 17 kDa na dno żelu.
  15. Skoncentrowane frakcje należy wykorzystać do ilościowego oznaczenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Typowy uzysk z 0,8 g granulatu membranowego wynosi do 0,2 mg czystego białka w połączonych frakcjach.
  16. Rozpuść V23T MscL w liposomach DPhPC za pomocą dializy. Pobrać 10 mg/ml roztworu chloroformu DPhPC i podsycić 0,5 ml (tj. 5 mg lipidu) do trzech jednorazowych okrągłodennych (12 x 130 mm) szklanych probówek. Wysuszyć lipid pod strumieniem azotu i usunąć resztki chloroformu w próżni (4-6 godzin).
  17. Dodać 15 20 mg sproszkowanego OG do suchego lipidu w każdej probówce, rozpuścić go w 2 ml buforu do dializy (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2), odwirować i łagodnie sonicate. Rozpuszczone w OG lipidy powinny tworzyć klarowny roztwór.
  18. Dodaj skoncentrowane roztwory V23T MscL do każdej probówki, aby osiągnąć proporcje białka do lipidów 1:100, 1:300 i 1:1,000 i dobrze wirować. Wytnij i umyj trzy kawałki (~12 cm długości) rurki do dializy (MWCO 8000, średnica 7,5 mm, przygotuj trzy pary ponumerowanych klipsów).
  19. Rozpuszczone mieszaniny lipidowo-białkowe umieścić w przewodach, ostrożnie zamknąć końce klipsami i dializować na 2 l buforu (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2) przez 48 godzin w temperaturze 4 °C z czterema zmianami buforu co 12 godzin. Po dializie proteoliposomy są gotowe.

UWAGA: Roztwór liposomu może być uzupełniony o 2 mM NaN3 (azydek sodu) i przechowywany w temperaturze 4 °C. Unikaj zamrażania.

4. Produkcja zbiornika oleju

  1. Wywierć dwa przeciwległe otwory (o średnicy 1.0 mm) aż do ściany akrylowego cylindra o średnicy 2 cali i długości 1.5 cm w odległości 1 cm od dołu (Rysunek 1A).
  2. Wywierć dwa otwory 4 mm koncentrycznie do wcześniej wywierconych otworów 1 mm. Głębokość otworów powinna wynosić 1 mm każdy (należy uważać, aby nie wiercić do końca). Otwory te są wykonane tak, aby pasowały do gumowych uszczelek.
  3. Umieść i przyklej dwie gumowe uszczelki o średnicy wewnętrznej 1 mm w większych otworach, aby zapobiec wyciekaniu oleju.
  4. Przyklej obrabiany cylinder do cienkiego arkusza akrylowego o wymiarach 10 cm x 10 cm za pomocą dowolnej uniwersalnej żywicy epoksydowej (Rysunek 1).

W dniu eksperymentu:

5. Przygotowanie elektrod

  1. Wytnij dwa srebrne druty o długości 7 cm o średnicy 250 μm, a następnie zanurz ich końcówki w wybielaczu na dwie godziny, aby utworzyć powłokę chlorku srebra (AgCl). Szary kolor oznacza, że utworzyła się powłoka AgCl (rysunek 2E).
  2. Za pomocą noża do szkła podziel kapilarnę borokrzemianową o długości 10 cm i średnicy 1/0,58 OD/ID mm na dwie kapilary o średnicy 5 cm.
  3. Za pomocą igły microfil o rozmiarze 34 wypełnij kapilary hydrożelem PEG-DMA. Aby zapobiec pęcznieniu uwodnionego hydrożelu z kapilary, należy zachować 3 mm odstęp na końcach i upewnić się, że w naczyniach włosowatych nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Umieść elektrody Ag/AgCl w kapilarnach wypełnionych hydrożelem (rysunek 2E).
  5. Utwardzić hydrożel PEG-DMA poprzez fotopolimeryzację wolnorodnikową po wystawieniu na działanie światła UV przez 2 minuty przy 1 W za pomocą pistoletu punktowego UV.

6. Przygotowanie eksperymentu

UWAGA: Eksperyment jest ustawiony pod klatką Faradaya podłączoną do uziemienia na wzmacniaczu patchowym.

  1. Podłącz jedną z mikropipet do prostego uchwytu mikroelektrody z męskim złączem (Rysunek 2E).
  2. Podłącz uchwyt mikroelektrody do headstage patcha amplifier (Rysunek 2A). Aby podłączyć stację główną do masy, izolowany przewód miedziany o średnicy 18 do odpowiedniego złącza dla sceny czołowej.
  3. Zamontuj scenę górną na 3-osiowym ręcznym mikromanipulatorze. Przymocuj płytkę montażową headstage'a (powinna być zakupiona wraz z mikromanipulatorem lub wykonana na zamówienie w warsztacie mechanicznym) do mikromanipulatora, a następnie podłącz headstage do płyty montażowej za pomocą odpowiednich.
  4. Podłącz drugą mikropipetę do siłownika liniowego za pomocą złącza wyprodukowanego w laboratorium, a następnie zamontuj obie na drugim mikromanipulatorze (Rysunek 2B). Mikropipety powinny być ustawione naprzeciwko siebie, wyrównane i wypoziomowane. Uwaga: marka i styl manipulatorów nie mają znaczenia.
  5. W szklanej fiolce wymieszać 0,1 ml liposomów DPhPC z 0,01 ml roztworu proteoliposomu V23T MscL.

UWAGA: Ten krok jest potrzebny, aby zmniejszyć stosunek białka do lipidu (~0,0002), co jest kluczowe dla utworzenia stabilnej dwuwarstwy lipidowej.

  1. Za pomocą igły do mikropipet o rozmiarze 34 napełnij końcówki obu mikropipet roztworem proteoliposomów (ryc. 3A).
  2. Umieść zbiornik na mikroskopie pionowym i przeprowadź mikropipety przez przeciwległe otwory 1 mm (Rysunek 2B). UWAGA: można użyć dowolnego mikroskopu, o ile kropelki są wyraźnie widoczne.
  3. Napełnij zbiornik do powierzchni heksadekanem (99%). Heksadekan nie wymaga dalszego oczyszczania.
  4. Aby uformować kuliste kropelki na końcówce mikropipet, użyj trzeciej mikropipety ze szkła borokrzemianowego o średnicy 10 μm, zamontowanej na trzecim mikromanipulatorze, aby dozować rozcieńczony roztwór proteoliposomu V23T MscL (~0,00052 ml) na końcówki mikropipet i uformować kropelki (rysunek 3).
  5. Kontroluj wielkość kropel (zmniejszając lub zwiększając objętość) zgodnie z potrzebami i pozwól im odpoczywać przez 10 minut, aby monowarstwy całkowicie się uformowały (ryc. 3).
  6. Doprowadź kropelki do kontaktu, utworzenie dwuwarstwowe nastąpi w ciągu 1 do 2 minut.

7. Konfiguracja oprogramowania i sprzętu

  1. Przygotuj oprogramowanie, włączając komputery, mikroskop, sterownik oscylatora piezoelektrycznego, generatory funkcyjne, wzmacniacz krosowy i system akwizycji danych o niskim poziomie szumów.
    UWAGA: można użyć dowolnego wzmacniacza krosowego, a poniższe instrukcje dotyczą konkretnie tego, którego użyliśmy i który jest wymieniony na liście materiałów i sprzętu.
  2. Na przednim panelu patcha amplifier ustaw pokrętła "Mode" na VHOLD/IHOLD i V-CLAMP.
  3. Na panelu przednim ustaw filtr Bessela "Lowpass" na 1 kHz, a wzmocnienie wyjściowe na 2.
  4. Ustaw "Konfigurację" na CAŁA KOMÓRKA β = 1.
  5. Upewnij się, że pozostałe pokrętła są ustawione na zero lub w pozycji neutralnej.
  6. Próbkuj wszystkie pomiary prądu DIB przy 5 kHz za pomocą filtra antyaliasingowego Bessela 1 kHz.
  7. Uruchom oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę na pulpicie.
  8. Kliknij "Konfiguruj > Digitizer", aby otworzyć okno dialogowe "Digitizer", a następnie kliknij przycisk "Zmień".
  9. W oknie dialogowym "Change Digitizer" (Zmień digitizer) wybierz "Digidata 1440 Series" z listy "Digitizer Type".
  10. Kliknij przycisk Skanuj, aby wykryć digitizer.
  11. Kliknij "OK", aby wyjść z okna dialogowego "Zmień digitizer", a następnie kliknij "OK", aby wyjść z okna dialogowego "Digitizer".
  12. Kliknij "Konfiguruj > stoł laboratoryjny".
  13. Na karcie Input Signals (Sygnały wejściowe) na stanowisku laboratoryjnym wybierz opcję Analog In Å (Wejście analogowe) w obszarze Digitizer Channels (Kanały digitizera). Ustaw współczynnik skali na 0,002.

8. Tworzenie dwuwarstwy lipidowej

  1. Za pomocą BNC podłącz wyjście generatora przebiegów do zewnętrznego wejścia poleceń przełączanego z przodu (na tylnym panelu systemu akwizycji danych). Wyślij trójkątny przebieg 10 Hz, 500 mV pk-to-pk do sceny czołowej.
  2. Za pomocą mikromanipulatora przesuń szklane mikropipety poziomo, aby doprowadzić do kontaktu kropelek aż do lekkiego zetknięcia się i poczekaj, aż nastąpi rozrzedzenie dwuwarstwowe (zwykle około 1 do 2 minut) (rysunki 3C i 3D).

UWAGA: Postęp procesu tworzenia dwuwarstw można zobaczyć wizualnie przez mikroskop i można go monitorować za pomocą pomiaru prądu (Rysunek 4).

  1. Dostosuj rozmiar dwuwarstwy (średnica ~250 μm), kontrolując położenie kropli zamontowanej na siłowniku, za pomocą mikromanipulatora. Uwaga: rozmiar dwuwarstwy można oszacować wizualnie za pomocą mikroskopu. Metoda ta ułatwia badaczowi kontrolowanie wielkości dwuwarstwy poprzez łatwe przesuwanie kropel za pomocą mikromanipulatorów.

9. Wzbudzenie dynamiczne i bramkowanie MscL

  1. Gdy dwuwarstwa się uformuje i jest stabilna (tj. nie pęka ani nie przewodzi prądu), stymuluj kropelki, wysyłając sygnał sinusoidalny za pomocą generatora funkcyjnego.
  2. Aby stymulować białko MscL zawarte w dwuwarstwie, wyślij sinusoidalny przebieg o amplitudzie międzyszczytowej 175 μm, częstotliwości 0,2 Hz i 50% cyklu pracy do piezoelektrycznego serwosterownika. (Różne typy przebiegów mogą być wysyłane z różnymi amplitudami, częstotliwościami i cyklem pracy)

10. Przetwarzanie i interpretacja wyników

  1. Zapisz bieżące pomiary, zarejestrowane za pomocą systemu akwizycji danych, w . Format ABF. Importowanie danych (w formacie . ABF) do Matlaba za pomocą pliku funkcyjnego "abfload", a następnie przeanalizować i przetworzyć dane. Plik "abfload" jest dostępny za darmo w Internecie.
  2. Oszacuj naprężenie w dwuwarstwie i powierzchniowe rozszerzanie się kropel, korzystając z filmów przedstawiających kroplę podczas pełnych cykli aktywacji, które są rejestrowane za pomocą odpowiedniej kamery.
  3. Przetwarzaj filmy w Matlabie, przetwarzając poszczególne klatki za pomocą technik przetwarzania obrazu w celu oszacowania obszaru granicy faz woda/olej, a także kąta między kroplami. UWAGA: za pomocą klatki 2D zaczerpniętej z filmu wykryj granicę faz woda-olej (tj. krawędź kropli), a następnie oszacuj pole powierzchni przez obrót.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki 1 i 2 pokazują eksperymentalny układ i sprzęt używany do rejestrowania aktywności białka w trakcie mechanicznej stymulacji dwuwarstwowej błony lipidowej. Aby zminimalizować szumy elektryczne w naszych pomiarach, stacja robocza jest umieszczona w laboratoryjnej klatce Faradaya, uziemionej do uziemienia wzmacniacza AxoPatch 200 B.

Stworzenie stabilnej dwuwarstwy izolacyjnej lipidowej jest kluczowym krokiem w tym badaniu. W tym układzie monowarstwa lipidowa gromadzi się na granicy faz olej/woda kropelek wody zanurzonych w kąpieli rozpuszczalnika organicznego. Gdy kropelki stykają się ze sobą, nadmiar oleju jest eliminowany, a przeciwstawne monowarstwy lipidowe rozrzedzają się do dwuwarstwy lipidowej o grubości dwóch cząsteczek. Najpowszechniejszą techniką stosowaną w charakterystyce dwuwarstwowej jest napięcie cęgowe. W przypadku cęgów napięciowych napięcie na dwuwarstwie jest utrzymywane na stałym poziomie podczas pomiaru prądu. Rysunek 4 przedstawia typowy zapis prądu w czasie rzeczywistym początkowego formowania się dwuwarstwy. Znając pojemność właściwą (~0,6 μF/cm2)5 dwuwarstwy lipidowej DPhPC, można obliczyć powierzchnię utworzonej dwuwarstwy. Obszar dwuwarstwowy można kontrolować, zmieniając położenie kropel (ryc. 4A). Za pomocą siłownika piezoelektrycznego można zastosować różne rodzaje przebiegów (sinusoidalne, kwadratowe, trójkątne itp.) o różnych częstotliwościach, amplitudach i cyklach pracy, aby uzyskać ich oscylację poziomą i osiową, a tym samym zmienić napięcie i powierzchnię dwuwarstwową (rysunek 4B).

Gdy DIB jest stymulowany mechanicznie, przy jednoczesnym utrzymaniu stałego potencjału DC na membranie, niskoprogowy (wzmocnienie funkcji) mutant V23T MscL generuje niezawodne działania, w tym głównie stany podprzewodniczące i czasami pełne zdarzenia otwarcia (Rysunek 5). Zdarzenia te są identyczne z tymi zarejestrowanymi przy użyciu techniki patch-clamp z nienaruszonych wewnętrznych błon i liposomów E. coli odtworzonych za pomocą oczyszczonego V23T MscL. Wyniki przedstawione na rysunku 5 dowodzą, że bramkowanie występuje w odpowiedzi na wzrost napięcia, ponieważ wszystkie skoki prądu są obserwowane przy szczytowym ściskaniu. Przy ściskaniu szczytowym względna powierzchniowa ekspansja kropel jest maksymalna, a zatem naprężenie na granicy faz jest maksymalne.

Alametycyna, kanał jonowy bramkowany napięciem i jeden z najlepiej przebadanych peptydów, zwiększa przepuszczalność membrany, gdy napięcie DC jest przyłożone do membrany36. Zdolność interfejsu dwuwarstwowego lipidów do przenoszenia białek i peptydów transbłonowych jest również testowana poprzez wykonywanie zapisów prądu bramkującego napięciem przy użyciu peptydu alatetycyny. Alametycynę miesza się z roztworem fosfolipidów do końcowego stężenia 100 ng/ml. Rysunek 6 przedstawia pomiary prądu pod cęgami napięciowymi (+115 mV). Kropelki w tym eksperymencie są rozdzielane w celu uzyskania małego dwuwarstwowego interfejsu, a tym samym wyższej rezystancji i mniejszej pojemności. Zachowanie bramkowania peptydu almetycyny jest pokazane za pomocą dyskretnych kroków prądu (ryc. 6). Histogram po prawej stronie wykresu pokazuje zmiany przewodności od poziomu podstawowego (0,0962 nS), który jest w zasadzie pierwszym poziomem przewodności samego kanału.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat opisujący główne części i wymiary zbiornika oleju. Zbiornik oleju jest produkowany w warsztacie mechanicznym w Virginia Tech. Składa się z obrabianej maszynowo cylindrycznej rurki akrylowej przyklejonej do powierzchni arkusza akrylowego. Wymiary i konstrukcję można modyfikować w celu dostosowania do różnych zastosowań lub więcej niż dwóch mikropipet. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja doświadczalna i przygotowanie mikropipet. (A) Standardowa stacja robocza do formowania, mechanicznej stymulacji i charakteryzowania dwuwarstw interfejsu obejmuje mikroskop, manipulatory 3-osiowe, kamerę cyfrową, oscylator piezoelektryczny, stół do izolacji drgań i klatkę Faradaya (nie pokazano). (B) Układ doświadczalny składa się z dwóch przeciwległych mikropipet wypełnionych hydrożelem PEG-DMA ustawionych poziomo w kąpieli z olejem heksadekanowym. Każda z mikropipet zawiera elektrodę Ag/AgCl, która zapewnia połączenie elektryczne. Trzecia mikropipeta wypełniona roztworem proteoliposomu służy do formowania kropelek na końcach innych mikropipet. (C) Odpowiedź prądowa DIB może być mierzona za pomocą kombinacji wzmacniacza krosowego i niskoszumowego systemu akwizycji danych. (D) Zamknięty rysunek przedstawiający kropelki wody wodnej utworzone na końcach mikropipet. (E) Elektrody Ag/AgCl są wytwarzane przez zanurzenie końcówki dwóch srebrnych drutów o średnicy 250 μm w wybielaczu. Elektrody są następnie podawane przez dwie kapilary ze szkła borokrzemianowego wypełnione hydrożelem PEG-DMA, który jest utwardzany światłem UV w celu zestalenia. Prosty uchwyt mikroelektrody z męskim złączem służy do podłączenia jednej z mikropipet do stopnia czołowego wzmacniacza krosowego.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazy ilustrujące powstawanie dwuwarstw granicy faz kropel. (A) Mikropipetę o wielkości 10 μm wypełnioną proteoliposomami umieszcza się pod mikroskopem w pobliżu końcówek mikropipet. Za pomocą strzykawki podłączonej do mikropipety dozować małe objętości proteoliposomów, aby uformować kuliste kropelki do pożądanej objętości. Pozwól uformować się monowarstwie, pozwalając kropelkom siedzieć przez dziesięć minut. Doprowadź kropelki do kontaktu; Dwuwarstwa utworzy się po wyeliminowaniu całego oleju na granicy faz. (B) Podczas tworzenia dwuwarstwy, skład chemiczny po obu stronach granicy faz można kontrolować, wstrzykując pożądane substancje chemiczne za pomocą mikropipety o rozmiarze mikro. (C) Kropelki w momencie pierwszego kontaktu. (D) Kropelki, gdy tworzy się dwuwarstwa lipidowa.

figure-results-4
Ilustracja 4: pomiary w czasie rzeczywistym pokazują zarówno początkowe przerzedzenie, jak i późniejsze rozszerzanie interfejsu. (A) Prąd mierzony w trakcie tworzenia się dwuwarstw poprzez przyłożenie trójkątnego potencjału elektrycznego. Wielkość mierzonego prądu jest wprost proporcjonalna do pojemności, a co za tym idzie powierzchni granicy faz dwuwarstwowych. Im bardziej kropelki są do siebie zbliżone, tym większy obszar interfejsu i na odwrót. (B) Po zastosowaniu wzbudzenia mechanicznego obszar granicy faz dwuwarstwowych zwiększa się i zmniejsza z tą samą częstotliwością, co sygnał stymulujący.

figure-results-5
Rysunek 5: pomiary w czasie rzeczywistym pokazują reakcję dwuwarstwy na wzbudzenie mechaniczne, a także bramkowanie mutanta V23T MscL. Kształt odpowiedzi prądowej jest sinusoidalny, co odnosi się do sinusoidalnej zmiany pojemności dwuwarstwowej w wyniku zmiany obszaru dwuwarstwowego. Skoki prądu, występujące w szczycie każdego cyklu, wskazują na bramkowanie subprzewodnictwa mutanta V23T. Wykres biegunowy wskazuje ponadto, że bramkowanie występuje przy szczytowej kompresji, co odzwierciedla wzrost napięcia na granicy faz dwuwarstwowych.

figure-results-6
Rysunek 6: Pomiary prądu pod cęgami napięciowymi i odpowiadający im histogram poziomów przewodności dla aktywności bramkowania włączonych kanałów alamitycyny. Zachowanie bramkowania peptydu alamitycyny jest pokazane poprzez dyskretny stopniowy wzrost prądu. Poziomy przewodności bardzo dobrze pasują do poprzednich pomiarów wykonanych przez naszą grupę badawczą w Virginia Tech7.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanosensacja oznacza jedną z pierwszych ścieżek transdukcji sensorycznej, które wyewoluowały w organizmach żywych. Wykorzystanie tego zjawiska do badania i zrozumienia właściwości mechanoelektrycznych DIB jest kluczowym krokiem w kierunku funkcjonalnych materiałów reagujących na bodźce. Polega na włączeniu i aktywacji mechanowrażliwego kanału, MscL, w DIB jako przetwornika mechanoelektrycznego i tensometru do wykrywania wzrostu napięcia na granicy faz dwuwarstwowych lipidów. Z drugiej strony, funkcja kanałów MS może być regulowana przez podstawowe właściwości materiałowe dwuwarstw lipidowych, w tym grubość, wewnętrzną krzywiznę i ściśliwość. W związku z powyższym, technika oparta na mikropipetach stanowi cenne narzędzie pozwalające badaczowi na badanie kanałów SM w DIB i dostarcza informacji na temat struktury dwuwarstwy lipidowej, a także interakcji lipid-białko.

W ciągu ostatnich trzech dekad patch-clamp był podstawową metodą badania kanałów MS, ponieważ umożliwia zaciskanie zarówno napięcia, jak i napięcia. Jednak zacisk krosowy wymaga nieporęcznego sprzętu i nie nadaje się do miniaturyzacji, co jest właściwością wymaganą do inżynierii urządzeń sensorycznych i konwersyjnych. DIB ze względu na swoją prostotę, stabilność i kompaktowość stanowią odpowiednie środowisko do badania aktywności MscL. W tym miejscu rozszerzamy wcześniejsze postępy w technikach tworzenia DIB, proponując technikę opartą na mikropipetach, z możliwością kontrolowania wielkości kropelek i granicy faz dwuwarstwowych, składu chemicznego każdej kropli oraz napięcia na granicy faz poprzez dynamiczną stymulację. Technika ta polega na zakotwiczeniu kropelek wody wodnej, zawierających proteoliposomy, do końcówek współosiowo przeciwstawnych szklanych naczyń włosowatych. Kropelki umieszcza się w kąpieli z rozpuszczalnikiem organicznym, a po wejściu w kontakt na granicy faz tworzy się dwuwarstwa lipidowa.

Mikropipety są przymocowane do oscylatorów piezoelektrycznych, co umożliwia poziome przemieszczanie kropel. Dynamiczne ściskanie kropel powoduje wzrost napięcia międzyfazowego na granicy faz wodno-olejowych, a tym samym wzrost napięcia dwuwarstwowego. Dwa główne aspekty odróżniają tę metodę od podobnej i niedawno opublikowanej techniki dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych (CBB)37. Za pomocą przedstawionej tu techniki wielkość dwuwarstwy jest kontrolowana za pomocą mikromanipulatorów, dzięki czemu objętości kropel pozostają stałe, w przeciwieństwie do metody CBB. Ponadto technika CBB wymaga zastosowania pomp ciśnieniowych, które nie są potrzebne w metodzie przedstawionej w tym artykule, co upraszcza i ułatwia budowę.

Jesteśmy w stanie wprowadzić i stymulować bakteryjną MscL po raz pierwszy bez użycia pipety z plastrem lub modyfikacji chemicznych38. Ponieważ system ułatwia tworzenie wytrzymałych asymetrycznych dwuwarstwowych błon lipidowych, bardziej naśladuje asymetrię lipidów występującą w błonach biologicznych. Pozwala nam to na badanie wpływu kontrolowanego składu lub asymetrii błony na aktywność MscL. Dodatkowo, dzięki technikom przetwarzania obrazu, metoda ta pomaga oszacować napięcie na granicy faz dwuwarstwowych. Technika ta pomaga w zrozumieniu zasad wzajemnej konwersji między siłami masowymi i powierzchniowymi w DIB, ułatwia pomiary podstawowych właściwości membrany i poprawia zrozumienie odpowiedzi MscL na napięcie membrany.

Chociaż ta metoda przybliża nas o krok w kierunku biomolekularnego systemu materiałowego reagującego na bodźce i do innego środowiska fizjologicznego do badania MscL, istnieją ograniczenia systemu. Napięcie w tym układzie nie może być zaciśnięte ze względu na obecność rezerwuaru lipidów w postaci liposomów w każdej kropli, który ma tendencję do zmniejszania napięcia na granicy faz olej/woda. Dlatego obecnie kanały mechanowrażliwe mogą być stymulowane w DIB tylko w reżimie dynamicznym. Obecność pęcherzyków powietrza w systemie znacząco wpływa na precyzję i powtarzalność eksperymentów. Pęcherzyki powietrza obecne w hydrożelach mogą spowodować utratę połączenia elektrycznego.

Chociaż opisujemy zastosowanie metody opartej na mikropipetach do stymulacji MscL, technika ta może być wykorzystana do badania innych typów kanałów SM i ma potencjał, aby zostać wykorzystana przez naukowców do badania różnych biomolekuł. Na przykład, podobny układ został wykorzystany w naszym laboratorium do zbadania odpowiedzi mechanoelektrycznej dwuwarstwowej membrany z interfejsem kropelkowym bez kanałów. Różne białka mogą być odtwarzane i aktywowane przy użyciu tego wysoce kontrolowanego układu, biorąc pod uwagę, że środowiska rekonstytucji każdej biomolekuły są różne. Opisana w artykule metoda dotyka znacznie szerszego potencjału aplikacyjnego, który ogranicza się jedynie do wyobraźni badacza.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji są wspierane przez Grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-12-1-0464.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mikro; m filtrCorning430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC)Avanti Polar Lipids850356PZakupiony jako liofilizowany proszek
Microfil o grubości 34 WorldPrecision InstrumentsMF24G-5
400 mL Butelki wirówkiThermoFisher3141Generator funkcji Agilent Nalgene
/Generator przebiegów arbitralnych, 20 MHzKeysight Technologies33220A
AmpicillianThermoFisherBP1760ACS Klasa
Avanti® Mini-ekstruderAvanti Polar Lipids610000
Axio Scope.A1CarlZeiss-AxioCam
HSmCarl Zeiss-Axopatch
200B Urządzenia molekularne-Zestaw
do oznaczania białek BCAPierce 23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Generator przemiatania/funkcyjnyDigi-KeyBK4017B-ND
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B100F-4
Rurka do dializy7 Spectra/Por132113MWCO 8000, średnica 7,5 mm
System DigiData 1440AUrządzenia molekularne-DNAse
Serwosterownik Sigma-AldrichDN25
DPhPCAvanti850356C
E-625 PZT Physik InstrumenteE-526
FPLC SystemPharmacia Biotech-HCl
J.T. Baker9535-33
Hexadecane, 99%Sigma-Aldrich544-76-3
HomoginizatorWheaton357426 15 mL
ImidazolSigma-AldrichI5513
IPTGAffymetrix17886
IRGACURE® 2959IRGACURE®
Filtry membranowe izoporowe EMD MilliporeVCTP02500
Alkohol izopropylowyVWR InternationalBDH1133-4LP
KClSigma-AldrichP3911ACS Klasa
KH2PO4Mallinckrodt7100ACS Grade
Kimble-ChaseKontes420401-1515Flex-Column
LED-100 Utwardzanie punktowe UV SystemElectro-Lite, korporacja81170
LysozymeSigma-AldrichL6876
Ręczne mikromanipulatory z zaciskiem krosowymThorlabsPCS-520N
MgCl2ThermoFisherM33klasy ACS
 World Precision InstrumentsMEH1S
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-1000
MOPS, minimalna 99,5% miareczkowanieSigma-AldrichM1254-100G
N2 GasAirgas UN1066
NaClEMDSX0420-1ACS Grade
Ni NTA koraliki agarozoweQiagen
optycznie przezroczysta odlewana rura akrylowa, 2-1/2 "OD x 2" IDMcMaster-Carr8486K545
P-601 Siłownik liniowy sterowany flexure PiezoMovePhysik InstrumenteP-601
PAGE żelBio-Rad456-9033
Parafilm M® Uniwersalna folia laboratoryjnaParafilm®PM999
Fluorek fenylometylosulfonyluSigma-AldrichP7626
Poli(glikol etylenowy)1000 dimetakrylanPolysciences, Inc.15178-100
Filtry membranowe z poliwęglanu (PCTE), czarne, 0,4 mikrona, 25mm, 100/pkSterlitech CorporationPCTB0425100
Chlorek potasu Sigma-AldrichP5405-500G
Bezpudrowe miękkie nitrylowe rękawice diagnostyczne VWR InternationalCA89-38-272
Uszczelka zamienna 1,0 mmWorld Precision InstrumentsGO1-100
SDSSigma-AldrichL5750
Drut srebrnyGoodFellow147-346-94W zależności od zastosowania można zastosować różne średnice 
Probówki z azydkiem soduAffymetrix21610
ThermoFisher14-961-2712 x 130 mm
TryptonThermoFisherBP1421
Ultracal 30KMilliporeUFC803024Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Lekkie wycieraczki do tkanekVWR International82003-820
VWR Scientific 50D Ultradźwiękowe Środek czyszczącyVWR International13089
Oczyszczacz wodyBarnsteadD11931
DrożdżeThermoFisherBP1422
β-oktylglukopiranozydAnatraceO311S
Wzmacniacz 555047962 Uchwyt mikroelektrody 1000632

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
  2. Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
  3. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
  5. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).
  6. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
  7. Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
  8. Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
  9. Sarles, S. A. Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , Virginia Polytechnic Institute and State University. (2010).
  10. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. SMART MATER STRUCT. 20, 094018(2011).
  11. Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023(2013).
  12. Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626(2011).
  13. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).
  14. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).
  15. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432(1972).
  16. Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
  17. Perozo, E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).
  18. Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. Mechanosensitive channels in microbes. ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).
  19. Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077(2012).
  20. Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
  21. Chiang, C. -S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
  22. Anishkin, A., Chiang, C. -S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
  23. Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
  24. Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683(2012).
  25. Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. Kubalski, A., Martinac, B. , (2005).
  26. Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
  27. Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
  28. Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
  29. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  30. Betanzos, M., Chiang, C. -S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
  31. Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
  32. Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834(2014).
  33. Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120(2010).
  34. Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
  35. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
  36. Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
  37. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
  38. Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Droplet Interface BilayersMechanosensitive Ion ChannelsMicropipette based MethodMscL Channel ActivityHarmonic Mechanical StimulationLiposome PreparationBilayer FormationElectrode PreparationCurrent MeasurementMembrane Properties

Related Articles