Artykuł metodologiczny

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

DOI:

10.3791/53364

⸱

1 października 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku braku wyspecjalizowanych mobilnych komórek odpornościowych, rośliny wykorzystują swoją zlokalizowaną zaprogramowaną śmierć komórki i ogólnoustrojową odporność do obrony przed atakiem patogenów. Udział określonego genu Arabidopsis w ogólnej odpowiedzi immunologicznej roślin można specyficznie i ilościowo ocenić, badając wzrost patogenu w zakażonej tkance. Od ponad trzech dekad hemibiotroficzna bakteria Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: ES4326 (Psm ES4326) jest szeroko stosowany jako modelowy patogen do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi immunologicznej rzodkiewnika. Aby dostarczyć patogeny do tkanki liścia, opracowano wiele metod inokulacji, np. infiltracja strzykawką, inokulacja zanurzeniowa, opryskiwanie, infiltracja próżniowa i inokulacja powodziowa. Poniższy protokół opisuje zoptymalizowaną metodę infiltracji strzykawki w celu dostarczenia zjadliwego Psm ES4326 do liści dorosłych roślin rzodkiewnika uprawianego w glebie i dokładnego badania przesiewowego pod kątem zwiększonej podatności na chorobę (EDS) na ten patogen. Ponadto protokół ten może być uzupełniony wieloma zabiegami wstępnymi w celu dalszej analizy określonych defektów immunologicznych w różnych warstwach obrony roślin, w tym odporności wyzwalanej kwasem salicylowym (SA) (STI) i odporności wyzwalanej MAMP (MTI).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na swoją siedzącą naturę, rośliny są stale zagrożone przez mnóstwo patogenów o różnym stylu życia i strategiach żywieniowych1. W pierwszym przybliżeniu patogeny biotroficzne utrzymują swojego gospodarza przy życiu w celu odzyskania składników odżywczych, podczas gdy patogeny nekrotroficzne aktywnie wydzielają toksyny i enzymy, aby zabić tkankę gospodarza i żywić się martwymi komórkami1. Inna grupa patogenów, zwana hemibiotrofami, rozpoczyna swój przebieg infekcji od stadium biotroficznego i przechodzi w stadium nekrotroficzne po osiągnięciu określonego progu akumulacji patogenu2. Aby skutecznie bronić się przed tymi mikroorganizmami, rośliny wykształciły skomplikowany wrodzony układ odpornościowy wyposażony w wiele mechanizmów nadzoru w celu wykrycia ataku patogenu i wywołania zlokalizowanej zaprogramowanej śmierci komórki3, a także ogólnoustrojowej odporności nabytej (SAR)4. Obecne badania koncentrują się na scharakteryzowaniu podstawowych składników sygnalizacyjnych i wzajemnych oddziaływań w układzie odpornościowym roślin5.

Jak zaproponowano w modelu5 "Zig-Zag", pierwsza warstwa wrodzonej odpowiedzi immunologicznej rośliny wymaga obecności zlokalizowanych w błonie plazmatycznej receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) w celu wykrycia inwazji drobnoustroju. PRR są w stanie rozpoznawać wzorce molekularne związane z drobnoustrojami (MAMP) i ustanawiać odporność wyzwalaną przez MAMP (MTI)6. Oprócz indukowania transkrypcyjnej regulacji w górę genów kodujących przeciwdrobnoustrojowe białka PR7, MTI prowadzi do różnych zdarzeń, które hamują wzrost patogenu, w tym do produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNS), odkładania kalozy w ścianie komórkowej, a także aktywacji wielu szlaków sygnałowych kinazy8.

Do tej pory zidentyfikowano kilka MAMP, które wywołują MTI u Arabidopsis, w tym bakteryjny flg229 (fragment 22 aminokwasów pochodzący z flageliny), elf1810 (18 aminokwasów z bakteryjnego czynnika wydłużania translacji Tu) i peptydoglikany, składnik strukturalnej ściany komórkowej11. Aby ustalić udaną infekcję, niektóre wyspecjalizowane patogeny wyewoluowały zdolność do wydzielania białek efektorowych wirulencji do przestrzeni wewnątrzkomórkowych lub międzykomórkowych, a w konsekwencji tłumienia MTI i wyzwalania podatności wyzwalanej efektorem (ETS)12,13. Na przykład efektory wirulencji mogą dezaktywować kaskady fosforylacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) MTI, aby indukować rozwój choroby w zakażonej tkance14-16. Podczas dynamicznej koewolucji między gospodarzami a patogenami rośliny opracowały również strategię przeciwdziałania atakom, aby rozpoznać białka efektorowe i osłabić cząsteczki wirulencji patogenów17. To bezpośrednie lub pośrednie rozpoznawanie efektorów odbywa się za pośrednictwem białek oporności na choroby (R)18. Większość z nich należy do rodziny NB-LRR (Nucleotide Binding and Leucine-Rich Repeats)19. Postrzeganie efektora awirulentnego przez białko R wywołuje silniejszą i szerszą odpowiedź immunologiczną scharakteryzowaną jako odporność wyzwalana efektorowo (ETI)20. Oprócz indukowania ekspresji genów obronnych21 i produkcji metabolitów obronnych22, ETI często prowadzi do szybkiej zlokalizowanej zaprogramowanej śmierci komórki znanej jako reakcja nadwrażliwa (HR) w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się patogenu do sąsiedniej tkanki3.

Oprócz zlokalizowanej zaprogramowanej śmierci komórki23, rośliny są zdolne do zainicjowania długoterminowej i ogólnosystemowej odpowiedzi immunologicznej zwanej Ogólnoustrojową Odpornością Nabytą (SAR)4. Po zmierzeniu się z biotroficznym patogenem komórki roślinne uruchamiają biosyntezę i akumulację endogennego fitohormonu kwasu salicylowego (SA) i białek PR zarówno w tkankach miejscowych, jak i ogólnoustrojowych24. Dzięki temu procesowi w niezakażonych liściach osiąga się podwyższony stan gotowości, który pozwala na szybsze reakcje obronne podczas kolejnej infekcji przez szerokie spektrum patogenów24. SA i jego syntetyczne analogi, takie jak ester S-metylowy kwasu benzo-(1,2,3)-tiadiazolo-7-karbothiowego (BTH) i kwas 2,6-dichloroisonicotynowy (INA), są zdolne do chemicznego indukowania odporności wyzwalanej kwasem salicylowym (SA) (STI) po zastosowaniu zewnętrznym24. Proponuje się, że Nonexpressor of Pathogenesis-Related Genes 1 (NPR1) jest jednym z receptorów SA i pełni funkcję głównego regulatora transkrypcji podczas odpowiedzi obronnej za pośrednictwem SA zarówno w tkankach lokalnych, jak i ogólnoustrojowych21,25,26. Wykazano jednoznacznie, że NPR1 jest wymagany do powstania SAR, a utrata NPR1 prowadzi do dramatycznej podatności na Pseudomonas syringae25.

Aby dokładnie scharakteryzować molekularny wkład składników roślinnych w interakcje roślina-patogen, opracowano wiele testów biologicznych do pomiaru określonych zdarzeń obronnych, w tym wybuchu ROS27, depozycji kalozy28, ekspresji genów obronnych i akumulacji ich produktów białkowych21. Chociaż te indywidualne testy mogą dostarczyć wglądu w specyficzną formę odpowiedzi immunologicznej rośliny, żadna z nich nie jest jednak w stanie przedstawić pełnej odpowiedzi obronnej na poziomie całej rośliny. I odwrotnie, kwantyfikacja wzrostu patogenu po zakażeniu zapewnia ogólne oszacowanie odpowiedzi immunologicznej na poziomie organizmu. Dlatego opracowanie i optymalizacja precyzyjnego i wysoce ustandaryzowanego testu inokulacji patogenów ma kluczowe znaczenie dla napędzania badań i odkryć dotyczących odpowiedzi immunologicznej Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, bakteria Gram-ujemna, została zidentyfikowana jako fitopatogen zdolny do wywoływania chorób u różnych gospodarzy roślin, w tym Arabidopsis29. Jako modelowy system roślina-patogen, interakcja Arabidopsis - P. syringae jest szeroko stosowana w celu zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw reakcji obronnych roślin29. Do tej pory zidentyfikowano ponad 50 patowarów P. syringae na podstawie ich zdolności do infekowania różnych gatunków roślin30 . P. syringae pv. pomidor DC3000(Pst DC3000)31oraz P. syringae pv. Maculicola powiedział:ES4326 (Psm ES4326)32 to dwa najczęściej stosowane i szeroko scharakteryzowane zjadliwe szczepy. Oprócz tego, że są rozpoznawane przez roślinę i wyzwalają odpowiedź MTI, Pst DC3000 i Psm ES4326 są zdolne do wydzielania zjadliwych białek efektorowych w celu tłumienia MTI i wyzwalania ETS w celu sprzyjania wzrostowi patogenu31,33.

Aby funkcjonalnie przeanalizować interakcję między Arabidopsis a P. syringae, opracowano metody infekcji wieloma patogenami w oparciu o podejście dostarczania patogenów. W przypadku roślin uprawianych w glebie patogen może być dostarczany przez infiltrację strzykawkową, infiltrację próżniową, inokulację zanurzeniową i inokulację opryskową29,34. Niedawno opracowano test inokulacji zalewowej sadzonek w celu przeprowadzenia badań przesiewowych na dużą skalę na młodych roślinach rzodkiewnika wyhodowanych na płytkach kultur tkankowych35. Naciek strzykawkowy, jako jedno z najczęściej stosowanych metod, polega na ręcznym dostarczaniu patogenu do apoplastu przez naturalne otwory liściowe zwane aparatami szparkowymi29. Dzięki takiemu podejściu równe ilości P. syringae mogą przeniknąć do zakażonego liścia, a siła odpowiedzi immunologicznej roślin jest odwrotnie skorelowana z poziomem wzrostu patogenu. Dlatego kwantyfikacja wzrostu patogenów służy jako optymalne podejście do oceny funkcji immunologicznej na poziomie całej rośliny. Ponadto infiltracja strzykawki może rozróżnić tkankę miejscową i ogólnoustrojową, co może mieć zastosowanie w charakterystyce mechanizmów molekularnych leżących u podstaw SAR36.

W poniższym protokole opisujemy zoptymalizowany test infiltracji strzykawki za pomocą Psm ES4326 do badania mutantów Arabidopsis w celu zwiększenia podatności na choroby (EDS). W protokole tym wykorzystane zostaną dwa genotypy Arabidopsis: rośliny ekotypu dzikiego Columbia-0 (Col-0) (kontrola) i mutanty NPR1-1 z utratą funkcji (hiperpodatne), które zostaną zakażone zjadliwym szczepem bakteryjnym Psm ES432637. Mutant npr1-1 przenosi mutację punktową w sekwencji konsensusu ankyryny-powtórzeń cząsteczki NPR1, która zmienia wysoce konserwatywną histydynę na tyrozynę i sprawia, że białko staje się niefunkcjonalne25. Ponadto opisano szereg modyfikacji testu infiltracji strzykawki, które umożliwiają ilościowe określenie defektów w określonych warstwach odpowiedzi immunologicznej, w tym MTI i STI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy tekst opisuje krok po kroku do przeprowadzenia zoptymalizowanego testu infiltracji strzykawki Psm ES4326 u Arabidopsis. Główne procedury tego testu są przedstawione na uproszczonym schemacie blokowym (rysunek 1).

1. Warunki wzrostu roślin

  1. Wysiewać nasiona
    1. Przygotuj 2 doniczki (4 o średnicy, 3,75 cala wysokości) luźno wypełnione ziemią i doniczkami z wodą, mocząc je od dna O/N przed spuszczeniem nadmiaru wody.
    2. Zasiej 50-100 nasion rzodkiewnika, mutanta Col-0 lub NPR1-1 typu dzikiego, na każdej doniczce ze złożonym arkuszem wagowym 70 mm lub innym papierem.
    3. Przykryj doniczkę przezroczystą kopułą spryskaną wodą, aby zwiększyć wilgotność względną do 80-90% (Rysunek 2A).
  2. Inkubować doniczkę w temperaturze 4 °C przez 72 godziny, aby umożliwić pełną stratyfikację i synchroniczne kiełkowanie.
  3. Przenieś doniczkę do standardowych warunków wzrostu (12 godzin światła/12 godzin ciemności, 21 °C, natężenie światła 100 μmol/m2/s, wilgotność względna 40%), aby nasiona mogły wykiełkować. Rozbij kopułę, aby wygenerować otwór 2-3 cali natychmiast po przeniesieniu do pomieszczenia wzrostu, co pomoże uniknąć kondensacji wody.
  4. Gdy pierwszy prawdziwy liść osiągnie wielkość 2-3 mm długości, przeszczep sadzonki z doniczki do 72-dołkowego płaskiego wypełnionego ziemią.
    1. Użyj palca lub końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby utworzyć głębokie na 1 cal wgłębienie na środku powierzchni gleby na płaskim terenie.
    2. Delikatnie oddziel pojedyncze sadzonki z jak najmniejszym uszkodzeniem korzeni. Ostrożnie podnieś sadzonki, które mają nienaruszone korzenie za pomocą kleszczy.
    3. Umieść pojedynczą oddzieloną sadzonkę razem z przylegającą grudką gleby, aby zminimalizować szok związany z przesadzaniem do zagłębienia i delikatnie wklep otaczającą glebę, aby wypełnić zagłębienie. Wyrzuć dodatkowe sadzonki i ziemię do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i zutylizuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi usuwania odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.
    4. Woda przeniosła sadzonki od góry i całkowicie przykryj mieszkanie przezroczystą kopułą spryskaną wodą, aby utrzymać wilgotność 80-90%. Trzymaj kopułę założoną przez 3 dni, a następnie rozbij kopułę rano 4 dnia i całkowicie ją zdejmij do końca tego dnia.
      Uwaga: Wysiew nasion można alternatywnie przeprowadzić przez rozwarstwienie nasion w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml 0,1% agaru przez 48 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie przeniesienie 2-3 nasion szklaną pipetą na 72-dołkowe płasko wypełnione ziemią. Mieszkania należy przykryć przezroczystą kopułą, którą można zdjąć tydzień po wykiełkowaniu. Dodatkowe sadzonki można usunąć, aby pozostawić tylko jedną sadzonkę na studzienkę.
  5. Podlewaj rośliny co dwa dni, mocząc mieszkania w wodzie 1 w wodzie przez 20 minut, a następnie spuść nadmiar wody.
    Uwaga: Przedział czasowy podlewania roślin zależy od wilgotności w pomieszczeniu i należy go określić na podstawie ciągłej obserwacji obiektu wzrostu roślin użytkownika. Codziennie sprawdzaj rośliny, aby upewnić się, że są dobrze podlewane. Jeśli wysycha tylko kilka miejsc, podlej je od góry butelką ze spryskiwaczem.
  6. Wykonaj testy infekcji patogenami (Krok 3-5) na roślinach, które są w fazie rozwojowej lub blisko niej # 3.50 (gdy rozmiar rozety wynosi 50% ostatecznego rozmiaru), co odpowiada 3-5 tygodniom w zależności od warunków wzrostu (fotoperiod, temperatura). Nie infekować roślin po wschodzie kwiatostanu (etap # 5) ze względu na pojawienie się odporności związanej z wiekiem38,39.

2. Przygotowanie pożywek i płytek hodowlanych

  1. Przygotuj 1 l płynnego podłoża King's B (KB). Delikatnie wymieszać 20 g peptonu proteozy i 2 g dwuzasadowego trójwodnego fosforanu potasu za pomocą mieszadła magnetycznego z 1 000 ml dejonizowanegoH2O, aż nie będzie widocznych osadów. Porcję 100 ml rozlać do szklanych butelek o pojemności 150 ml i umieścić w autoklawie w 20-minutowym cyklu cieczowym.
  2. Przygotować płytki hodowlane z pożywką KB w postaci stałej.
    1. Delikatnie wymieszaj 20 g peptonu Proteoza, 2 g dwuwodnego trójwodnego fosforanu potasu i 15 g agaru z 1 000 ml dejonizowanegoH2O. Autoklawu.
    2. Schłodzić pożywkę na magnetycznej płytce mieszającej, aż będzie chłodna w dotyku, aby zminimalizować przyszłą kondensację i uniknąć degradacji antybiotyków. Do pożywki dodać 18 ml sterylnego 80% glicerolu i 5 ml sterylnego 1 MMgSO4 . Biorąc pod uwagę, że Psm ES4326 jest odporny na streptomycynę, dodaj streptomycynę do schłodzonego podłoża do końcowego stężenia 50 μg ml-1.
    3. Wlej talerze. Przygotuj dwa różne rozmiary płytek KB: 100 mm x 15 mm i 150 mm x 15 mm szalki Petriego. Mniejsza szalka Petriego zawierająca pożywkę służy jako podstawowa płytka do hodowli bakterii, a większa szalka Petriego służy jako płytka do liczenia bakterii.
      Uwaga: W przypadku płytek do liczenia bakterii można użyć płytek o kształcie prostokątnym, aby obniżyć koszty materiałów eksploatacyjnych, ponieważ na jednej płytce można nanieść dwa razy więcej zabiegów w porównaniu z tradycyjnymi okrągłymi płytkami.
      1. Wlej płytki przed eksperymentem z infekcją. Płytki KB należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2-3 miesięcy, ponieważ siarczan streptomycyny stopniowo traci aktywność antybiotyczną40.

3. Zwiększona podatność na choroby (EDS)

  1. Dzień 1 - Smugi bakterii na talerzu
    1. Dwa dni przed testem EDS należy rozprowadzić Psm ES4326 z zapasu glicerolu w temperaturze -80 °C na płytce z kulturą bakteryjną KB-Strep i inkubować w temperaturze 28 °C przez 24-48 godzin.
  2. Dzień 2 - zainicjuj płynną uprawę i podlewaj rośliny
    1. Rozpocząć płynną hodowlę w sterylnej probówce z 4 ml płynnej pożywki KB zawierającej 50 μg ml−1 streptomycyny i wstrząsnąć z prędkością 250 obr./min, 28 °C O/N.
      Uwaga: W przypadku testu infekcji EDS zaleca się użycie 6 roślin na genotyp. W przypadku testów STI i MTI zaleca się 6 roślin na genotyp na zabieg. W przypadku inokulum bakteryjnego zaleca się stosowanie świeżej płynnej kultury o gęstości optycznej λ600 nm między 0,3 a 0,6.
    2. Oznacz ogonki liściowe liści numer 5 i 6 wodoodpornym markerem o końcu, aby ułatwić identyfikację zakażonej tkanki podczas pobierania próbek (ryc. 1). Aby zwiększyć otwieranie aparatów szparkowych i ułatwić wnikanie roztworu patogenu do liścia, dobrze podlej rośliny, mocząc mieszkanie od dołu przez 20 minut, a następnie spuść nadmiar wody.
      Uwaga: Alternatywnie przykryj mieszkanie przezroczystą kopułą i zanurz je w wodzie na 2-4 godziny, aby zwiększyć otwór szparkowy.
    3. Dzień 3 - Rozcieńczenie patogenu i infiltracja strzykawki
      Uwaga: Zakażenie patogenem w godzinach porannych jest optymalne dla namnażania się patogenu i rozwoju najbardziej wyraźnych objawów chorobowych na podatnych genotypach. Należy dołożyć wszelkich starań, aby czas infekcji był spójny, aby wyeliminować wpływ rytmów okołodobowych i dobowej regulacji genów41,42, co pomaga zmniejszyć zmienność między replikacjami eksperymentalnymi.
      1. Osadzać kulturę bakteryjną w mikrowirówce, probówce o pojemności 1,5 ml o pojemności 9 600 x g, przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad bakteryjny za pomocą 1 ml sterylnego 10 mM MgCl2,
        Uwaga: Kationy magnezu mogą zwiększać ruchliwość i adhezję P. syringae43. Alternatywnie należy użyćMgSO4 w tym samym stężeniu. Sterylna woda jest dopuszczalnym substytutem roztworów soli Mg.
      2. Rozcieńczyć zawiesinę bakterii 9 ml 10 mM MgCl2 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i zmierzyć gęstość optyczną (OD) bakterii za pomocą spektrofotometru przy λ=600 nm. Rozcieńczyć bakterie 10 mM MgCl2 do końcowego OD600nm = 0,0002 do testu infekcji EDS.
      3. Naciekać liść 1 ml strzykawki bezigłowej (powszechnie znanej jako strzykawka insulinowa), która zawiera rozcieńczony roztwór bakteryjny.
      4. Nie napełniać strzykawki do pełnej pojemności. Napełnij go 0,5-0,6 ml, aby umożliwić znacznie lepszą kontrolę podczas procesu infiltracji.
      5. Odsłoń dolną powierzchnię liścia na czubku palca wskazującego, a następnie delikatnie wyreguluj pozycję liścia za pomocą kciuka. Ustawić strzykawkę pionowo przy powierzchni liścia, aby zapewnić równomierne rozłożenie nacisku. Staraj się unikać obszaru nerwu środkowego podczas infiltracji, aby zmniejszyć uszkodzenia liści.
      6. Powoli naciskaj tłok, aby naciekać roztwór bakteryjny; wejście płynu do mezofilu liści zostanie uwidocznione, jak wskazuje ciemniejszy kolor liścia. Spróbuj przeniknąć do całej powierzchni liścia. Jeśli nie uda się tego zrobić za jednym razem, wybierz inne miejsce nacieku i powtarzaj czynności opisane powyżej, aż cała powierzchnia liścia zostanie pokryta.
      7. Po zakończeniu delikatnie osusz liść chłonną tkanką, aby usunąć dodatkowy roztwór patogenu. Sprawdź wzrokowo zainfekowaną tkankę liścia pod kątem uszkodzeń.
        Uwaga: Okrągły wycisk strzykawki nie powinien być widoczny po zakończeniu infiltracji.
      8. Pozostaw infiltrowane rośliny do wyschnięcia na 1-2 godziny przed przywróceniem ich do pierwotnych warunków wzrostu. Następnie spryskaj przezroczystą kopułę wodą i przykryj zainfekowane rośliny na 2 godziny, a następnie rozbij kopułę, aby wygenerować 2-3 otwory i pozostaw ją włączoną przez pozostałą część eksperymentu z infekcją.
        Uwaga: Ponieważ P. syringae nie jest patogenem przenoszonym drogą powietrzną, nie ma ryzyka rozprzestrzenienia się czynnika zakaźnego na inne rośliny uprawiane w tym samym obiekcie. Jednak jako dodatkowy środek ostrożności należy unikać kontaktu fizycznego między zakażonymi roślinami a innymi roślinami doświadczalnymi znajdującymi się w pobliżu. Przykrycie mieszkania przezroczystą kopułą zwiększy zjadliwość patogenu i przyspieszy postęp choroby. Potrzeba tego kroku i optymalna długość okresu przykrywania muszą być określone na podstawie warunków wilgotności w obiekcie uprawy roślin użytkownika.
    4. Dzień 5 - Wstępnie wysuszyć płytki z mediami
      1. Wyjmij płytki KB o wymiarach 150 mm x 15 mm z chłodni i wysusz istniejącą wcześniej kondensację wody na płycie. Wysuszyć płytki, trzymając je w temperaturze pokojowej przez około 24 godziny. Aby przyspieszyć ten proces, umieść je w okapie z przepływem laminarnym z pękniętymi pokrywkami na 30-60 min.
        Uwaga: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla tworzenia się okrągłej kropli na powierzchni płytki w następnym kroku.
    5. Dzień 6 - Kwantyfikacja wzrostu patogenu
      Uwaga: Poniższa procedura oznaczania ilościowego patogenu może być przeprowadzona we wcześniejszych punktach czasowych po zakażeniu, aby potwierdzić, że do liścia dostarczane są równe ilości bakterii, zwłaszcza gdy rośliny mają zmienioną morfologię liści.
      1. Przetwarzaj zakażoną tkankę po pojawieniu się chlorozy, na co wskazuje żółknięcie zakażonej tkanki w podatnych genotypach, ale przed rozwojem zmian martwiczych (ryc. 2B).
        Uwaga: Sugerowany czas pobierania próbek to trzy dni po inokulacji patogenu. Ponieważ jednak wzrost patogenu zależy od wielu czynników środowiskowych, długość inkubacji może się różnić w zakresie 2 1/2-3 1/2 dnia i musi być określona na podstawie dokładnych obserwacji postępu infekcji w zakładzie wzrostu roślin użytkownika.
        1. Przygotuj 6 probówek do mielenia dla każdego genotypu (ryc. 1). Umieść jedną kulę szlifierską ze stali nierdzewnej i dodaj 500 μl sterylnego 10 mM MgCl2 do każdej probówki.
        2. Odłącz zainfekowany liść od rośliny i przebij krążek liścia za pomocą 1-otworowego dziurkacza do papieru (Rysunek 1).
          Uwaga: Aby zminimalizować błąd pobierania próbek, spróbuj uderzyć każdy liść w tej samej pozycji. Zaleca się pobieranie próbek z tarczy liściowej od góry liścia.
        3. Losowo umieść 2 krążki liściowe (z dwóch różnych roślin) w każdej rurze mielącej za pomocą kleszczy.
        4. Uszczelnij probówkę i homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora o wysokiej przepustowości z maksymalną prędkością (1 600 ruchów na minutę) przez 10 minut. W razie potrzeby powtarzaj ten proces, aż tkanka będzie dobrze homogenizowana, a roztwory zmienią kolor na zielony z powodu uwalniania chlorofilu z zainfekowanych liści.
      2. Czekając na homogenizację, napełnij pierwsze 6 rzędów 96-dołkowej płytki hodowlanej 180 μl 10 mM MgCl2 za pomocą pipety wielokanałowej i zbiornika do pipetowania.
      3. Po zmieleniu przenieść 20 μl zmielonej zawiesiny tkankowej do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej i wymieszać, wielokrotnie pipetując płyn w górę i w dół. Jeśli małe fragmenty tkanki zatkają końcówkę, przytnij ją na 2-3 mm, aby uzyskać odpowiednią objętość roztworu.
        1. Aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na kroplę na górze płytki, umieść tkankę z różnych genotypów w alternatywnych rzędach (ryc. 1). Aby przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie seryjne, przenieś 20 μl cieczy do drugiego rzędu i powtarzaj tę procedurę do szóstego rozcieńczenia.
      4. Przenieść 20 μl roztworu z płytki 96-dołkowej na płytkę KB o wymiarach 150 mm x 15 mm za pomocą podzielonych końcówek pipet (Rysunek 1). Pracować od najcieńszej zawiesiny do najbardziej skoncentrowanej.
        Uwaga: Przejście od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej skoncentrowanego sprawia, że nie ma potrzeby wymiany końcówek pipet między rozcieńczeniami. Jeśli płytka jest dobrze wysuszona, przeniesiona kropla powinna pozostać nienaruszona na wierzchu pożywki aż do wchłonięcia (zwykle 15-30 min). Czas schnięcia różni się w zależności od RT i wilgotności.
      5. Wysuszyć talerz w temperaturze pokojowej z pękniętą pokrywką. Gdy na powierzchni płytki nie można już zaobserwować cieczy, zamknąć pokrywę, odwrócić i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze o temperaturze 28 °C.
      6. Inkubuj płytki przez 40-60 godzin, aż kolonie staną się widoczne. Upewnij się, że wzrost na płytkach odzwierciedla przewidywalny 10-krotny spadek jednostek tworzących kolonie (cfu) (ryc. 2C). Policz bakterie, zanim przerosną i kolonie się połączą. Określ liczbę bakterii w najniższym rozcieńczeniu, które nie ma nakładających się kolonii. Zazwyczaj preferowane rozcieńczenie do policzenia zawiera od 10 do 50 kolonii.
        Uwaga: Różnice mogą występować między powtórzeniami technicznymi; W związku z tym najmniejsze rozcieńczenie dla każdej kontrpróby należy oznaczyć oddzielnie.
      7. Aby obliczyć poziomy namnażania się bakterii, należy udokumentować na piśmie numer rzędu (R) oraz liczbę bakterii w każdej kontrpróbie technicznej (T). Określ liczbę jednostek tworzących kolonie – jtk/krążek liściowy za pomocą wzoru: jtk/krążek liściowy = (T × 10R / 20) × 500 / 2
      8. Wpisz dane w poniższym szablonie arkusza kalkulacyjnego, aby utworzyć wykres (Rysunek 1) (plik szablonu analizy danych arkusza kalkulacyjnego znajduje się w Tabeli 2). Każdy punkt danych jest reprezentowany jako średnia z sześciu powtórzeń technicznych w skali logarytmicznej. Słupki błędu reprezentują 95% przedział ufności średniej (n = 6).
        Uwaga: Obliczenie 95-procentowych przedziałów ufności należy dostosować w zależności od liczby powtórzeń technicznych.

4. Odporność wyzwalana przez SA (STI)

  1. Dzień 1: Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co opisano w kroku 3.1.
  2. Dzień 2: Oprócz podlewania roślin i inicjowania płynnej kultury bakteryjnej (krok 3.2), indukuj odporność poprzez zewnętrzne stosowanie pochodnej SA salicylanu sodu21,
    Uwaga: Pure SA ma słabą rozpuszczalność w wodzie i wymaga wcześniejszej regulacji pH, dlatego nie jest zalecany do tego testu.
    1. Aby wywołać obronę przed P. syringae za pośrednictwem SA i przygotować rośliny na przyszłą infekcję21,24, spryskaj rośliny drobną mgiełką 1 mM salicylanu sodu lubH2O(jako próba) 16-24 godziny przed infekcją patogenem.
  3. Dzień 3: Przygotuj rozcieńczenie patogenu do OD600nm = 0,001 i wepchnij bakterie na całą powierzchnię liścia poprzez infiltrację strzykawką (krok 3.3).
  4. Dzień 6: W przypadku procesu kwantyfikacji i liczenia patogenów należy postępować zgodnie z procedurą opisaną dla testu EDS (kroki 3.4 i 3.5). Tabliczkować i liczyć oddzielnie próbkiH2Oi salicylanu sodu – poddane wstępnej obróbce. W przypadku rzodkiewnika typu dzikiego oczekuje się zmniejszenia wzrostu patogenów o 1-2 log w roślinach poddanych działaniu salicylanu sodu.

5. Odporność na MAMP (MTI)

Uwaga: W tym teście używamy Arabidopsis Col-0 typu dzikiego oraz zmutowanych roślin fls2 i efr. FLS2 i EFR są receptorami rozpoznawania wzorców zlokalizowanymi w błonie plazmatycznej (PRR), które mogą rozpoznawać flg22 i elf18, odpowiednio9,10. Utrata każdego PRR powoduje niewrażliwość na określony typ MAMP, na co wskazuje niezmieniony wzrost patogenu w mutancie po zewnętrznym wstępnym leczeniu MAMP i infiltracji strzykawką Psm ES4326.

  1. Dzień 1 i 2: Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w krokach 3.1 i 3.2.
  2. Dzień 3: Wstępne leczenie MAMP i zakażenie patogenem
    1. Aby ustalić odporność wyzwalaną przez MAMP, należy przygotować 1 μM roztwór epitopu flageliny flg22 lub epitopu EF-Tu elf18 i naciekać go strzykawką na całą powierzchnię liścia na 4 godziny przed zakażeniem patogenem (kroki 3.3.3-3.3.6). Pozwoli to na indukcję obrony przed P. syringae za pośrednictwem MAMP i przygotuje rośliny na przyszłą infekcję6,37.
      Uwaga: Publicznie dostępne dane z mikromacierzy ujawniły, że maksymalne przeprogramowanie transkrypcji genów reagujących na MAMP następuje 4 godziny po leczeniu flg22 lub elf1837,44. Zatem 4 godziny to zalecany czas trwania wstępnej obróbki MAMP, który skutkuje uzyskaniem wyraźnej różnicy we wzroście patogenu między mutantami Col-0 i fls2 i efr potraktowanymi MAMP.
    2. Usuń nadmiar roztworu MAMP za pomocą tkanki chłonnej i pozostaw rośliny odkryte, aby przyspieszyć proces wchłaniania płynów w liściu. Aby uwzględnić efekt zranienia spowodowany infiltracją ciśnieniową strzykawki, należy naciekaćH2Odo liści roślin kontrolnych.
    3. Przygotować rozcieńczenie patogenu do OD600nm = 0,001 i wepchnąć bakterie na całą powierzchnię liścia wstępnie poddanego działaniu MAMP / H2O przez infiltrację strzykawką (krok 3.3).
  3. Dzień 6: W celu oceny ilościowej i liczenia patogenów postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 3.4 i 3.5. PróbkiH2Oi próbki poddane MAMP należy obrobić płytką i policzyć oddzielnie. U rzodkiewnika typu dzikiego oczekuje się zmniejszenia wzrostu patogenu o 1-2 log w roślinach poddanych działaniu MAMP, przy czym redukcja jest nieco silniejsza za pośrednictwem flg22 w porównaniu z elf18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół, który tutaj opisujemy, przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki P. syringae do ilościowej oceny odpowiedzi immunologicznej u roślin Arabidopsis. Jak pokazano na rysunku 1, po infiltracji Psm ES4326 przez strzykawkę następuje ekstrakcja patogenu i kwantyfikacja za pomocą seryjnych rozcieńczeń i liczenia kolonii.

Jak opisano w kroku 3 w tekście protokołu, zwiększona podatność na choroby (EDS) przeciwko Psm ES4326 może ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z kurczącymi się dostępnymi gruntami rolnymi i rosnącą populacją, naukowcy na całym świecie stają przed pilnymi potrzebami w zakresie poprawy upraw. Na plony mogą mieć duży wpływ różne stresy biotyczne i abiotyczne. Wśród nich infekcja patogenami jest jedną z głównych przyczyn zmniejszenia plonów, odpowiedzialną za około 12% strat w samych Stanach Zjednoczonych45. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadzono szeroko zakrojone badania w modelu patosystemu Arabidopsis - P. syringae , aby kompleksowo s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Shahidowi Mukhtarowi za krytykę manuskryptu i Dr. Xinnian Dong za plik z próbkami do analizy danych. Praca ta jest wspierana przez nagrodę NSF-CAREER (IOS-1350244) dla KPM i Wydziału Biologii UAB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MetroMix 360 GrosouthSNGMM360
Duże doniczkiGrosouthTEKUVCC10TC
12 x 6 WkładyGrosouthLM1206
11x 21 Mieszkania bez otworówGrosouthLM1020
11x 21 Mieszkania z otworamiGrosouthLM1020H
Kopuły propagacyjne z winyluGrosouthCW-221
Proteose PeptoneFisher ScientificDF0122-17-4
Fosforan potasu dwuzasadowy trójwodny MP Biomedicals151946
Agar Fisher ScientificA360-500
Siarczan streptomycynyBio Basic IncSB0494
100 x 15 mm szalki PetriegoFisher ScientificFB0875713
150 x 15 mm Szalki PetriegoFisher ScientificR80150
Płyta prostokątnaFisher Scientific12-565-450 
MgCl2 HexahydrateBio Basic IncMB0328
GlycerolBio Basic IncGB0232
MgSO4  Bio Basic IncMN1988
Strzykawka 1 mlFisher ScientificNC9992493 
KimwipeFisher Scientific06-666-A
Rury szlifierskie Denville ScientificB1257
Nasadki do rurek szlifierskichDenville ScientificB1254
Kula szlifierska ze stali nierdzewnejFisher Scientific2150
Płytka 96-dołkowa Fisher Scientific12-556-008
Salicylan soduSigma Aldrichs3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)GenescriptWykonany na zamówienie
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)GenescriptWykonany na zamówienie
DziurkaczZszywki146308
Biofotometr plusEppendorf
Wysokowydajny homogenizator PowerGenFisher Scientific02-215-503
Mikrowirówka wirowa AccuFisher Scientific13-100-675
Pipeta wielokanałowa (10-100 &mikro; l)Eppendorf3122 000.043
Pipeta wielokanałowa (30-300 &mikro; l)Eppendorf3122 000.060
Pipeta (20µ l)Eppendorf3120 000.038
Końcówki do pipetFisher Scientific3552-HR
SharpieZszywki507130
Tubka 1,5 mlEppendorf22363204
KleszczeFisher Scientific08-890
952000006 Marker permanentny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139(2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6(2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32(2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda infiltracji strzykawkzwi kszona podatno na chorobyodporno zale na od kwasu salicylowegoodporno indukowana przez MAMPkwantyfikacja wzrostu patogenuhomogenizacja tkanki li ciowej

Powiązane artykuły