Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Streszczenie

Eksperymenty śledzenia linii określają pochodzenie, los i zachowanie komórek w określonej tkance lub organizmie. Technika ta jest z powodzeniem stosowana od wielu dziesięcioleci, ujawniając przełomowe odkrycia w biologii rozwoju. Niedawno został przyjęty przez biologów zajmujących się komórkami macierzystymi do identyfikacji i śledzenia różnych populacji komórek macierzystych przy minimalnej interwencji eksperymentalnej. Ostatnie osiągnięcia w genetyce myszy, dostępność dużej liczby szczepów myszy oraz postępy w mikroskopii fluorescencyjnej pozwalają na proste projektowanie potężnych systemów śledzenia linii dla różnych tkanek z podstawową wiedzą specjalistyczną, przy użyciu dostępnych na rynku narzędzi. Niedawno wykorzystaliśmy tę potężną metodologię do zbadania pochodzenia i losu komórek macierzystych na powierzchni oka za pomocą myszy R26R-Confetti. Model ten oferuje wielokolorowy system genetyczny do ekspresji 4 genów fluorescencyjnych w sposób losowy. W tym miejscu opisujemy zasady tej metodologii i przedstawiamy elastyczny protokół projektowania eksperymentów śledzenia pochodzenia; w szczególności dla nabłonka rogówki, a także dla innych tkanek.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju embrionalnego, morfogeneza tkanek i narządów odbywa się za pomocą precyzyjnego programu, który można opisać w kategoriach proliferacji komórek, migracji komórek i specyfikacji linii^1-4. Te procesy biologiczne biorą również udział w utrzymaniu homeostazy tkanek dorosłych, co wymaga regeneracji komórek macierzystych. Śledzenie linii, czyli identyfikacja i śledzenie potomstwa określonego typu populacji komórek, stanowi ważne narzędzie do badania embriogenezy i homeostazy komórek macierzystych. Rzeczywiście, jest coraz częściej wykorzystywany w wielu dziedzinach badań. W szczególności śledzenie linii stało się podstawowym narzędziem w identyfikacji pochodzenia i losu komórek macierzystych w homeostazie i rozwoju raka. Dzieje się tak, ponieważ może dostarczyć istotnych informacji o tym, jak komórka zachowuje się w kontekście nienaruszonej tkanki lub organizmu, przy minimalnej interwencji eksperymentalnej, w przeciwieństwie do izolacji komórek i hodowli in vitro lub przeszczepu, które mogą skutkować niepożądanym odchyleniem.

Tradycyjnie, barwniki takie jak rozpuszczalna w tłuszczach karbocyjanina, które włączają się do błony komórkowej komórek, były używane do śledzenia linii. Chociaż tego typu eksperymenty z powodzeniem doprowadziły do ważnych odkryć i ukształtowały przełomowe koncepcje w biologii rozwoju^5,6, mają one pewne ograniczenia, w tym trudność w kontrolowaniu specyficzności docelowych komórek, niepożądany wpływ barwnika na zachowanie komórek i rozcieńczenie etykiety w czasie. Metody znakowania analogami nukleotydów umożliwiły udokumentowanie istnienia "komórek zatrzymujących etykiety" o powolnym cyklu, które przypuszczalnie odpowiadają komórkom macierzystym w stanie spoczynku^7,8. Jednakże, chociaż technika ta może wykazać obecność komórek o powolnych cyklach w oparciu o kinetykę proliferacji w ograniczonym czasie, nie może dostarczyć istotnych informacji na temat funkcjonalności komórek macierzystych. Optymalna metodologia śledzenia linii rodowej powinna zminimalizować wpływ znakowania na właściwości znakowanej komórki, jej potomstwa lub sąsiadów. Ponadto korzystne byłoby posiadanie kontroli nad indukcją znakowania, a mianowicie posiadanie możliwości znakowania interesującej populacji komórek w sposób zależny od etapu i czasu, a także w sposób pojedynczy (klonalny). Stabilna i nieodwracalna metoda znakowania, która jest przekazywana całemu potomstwu komórki założycielskiej, jest ważna, aby etykieta została zachowana w czasie, a nie przeniesiona na sąsiednie komórki.

Niedawno opracowano genetyczne metody znakowania komórek. W tych systemach promotory specyficzne dla komórek mogą być używane do wyzwalania ekspresji rekombinazy Cre w celu usunięcia blokady drogowej otoczonej loxP i umożliwienia ekspresji genów reporterowych, takich jak białko zielonej fluorescencji lub geny reporterowe Β-galaktozydazy^9-13. Takie podejście umożliwia nie tylko śledzenie komórek i ich potomstwa, ale także izolację komórek i charakterystykę molekularną. Śledzenie komórek na poziomie pojedynczej komórki stało się możliwe dzięki indukcji ekspresji pojedynczego fluorescencyjnego genu reporterowego. Jednym z istotnych ograniczeń tego systemu jest fakt, że tylko wtedy, gdy znakowany jest bardzo niski procent komórek, możliwe jest oddzielenie i śledzenie poszczególnych klonów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można użyć wielokolorowych reporterów. W przypadku korzystania z wielokolorowego etykietowania można skutecznie osiągnąć śledzenie losów różnicowych sąsiednich komórek w tej samej niszy^14-17. Ostatnio opracowano różne allele Brainbow (Br) do eksperymentów ze śledzeniem linii, umożliwiając stochastyczną ekspresję wielu fluorescencyjnych genów reporterowych z wykorzystaniem systemu Cre/lox. Układ Cre / lox składa się z enzymu rekombinazy Cre, który rozpoznaje i wiąże się z określonymi sekwencjami DNA, takimi jak miejsca loxP. Po związaniu rekombinazy Cre zachodzi rekombinacja specyficzna dla miejsca, która powoduje usunięcie sekwencji otoczonych loxP, co skutkuje losową ekspresją różnych białek fluorescencyjnych (mechanizm opisano poniżej). Do użytku dostępne są różne linie Br (patrz recenzje^16,18,19). Główne różnice między szczepami Br obejmują (i) różnice w liczbie genów fluorescencyjnych zawartych w kasecie, w zakresie od 2 (Br 2,0), 3 (Br1,0) do 4 (Br1,1, Br2,1) genów fluorescencyjnych, (ii) obecność wzajemnie zorientowanych miejsc lox umożliwiających inwersję genów (Br2,0-2,1), (iii) rodzaj użytych miejsc lox oraz (iv) ekspresję lub wyciszenie ekspresji genów fluorescencyjnych przed aktywacją Cre. Niedawno opracowany Br3 oferuje ulepszoną metodę wielokolorowego obrazowania neuronów. Jedną z głównych cech tego transkryptu jest to, że zawiera on nowy zestaw fotostabilnych farnezylowanych białek fluorescencyjnych, które umożliwiają równomierne barwienie najdrobniejszych procesów neuronalnych²⁰.

Co ważne, różne wersje kaset Br mogą zawierać specyficzny dla neuronów promotor Thy1 lub promotor CAG (CMV) o wszechobecnej ekspresji. Wreszcie, podczas gdy niektóre transgeniczne myszy Br mogą zawierać pojedynczy transgen Br, inne mogą składać się z wielu kopii transgenu, co pozwala na wytworzenie ogromnej liczby możliwości ekspresji kombinacji kolorów w każdej komórce (na przykład patrz ¹⁶).

W naszym badaniu użyliśmy myszy R26R-Confetti, która zawiera kasetę Br^{2.1 21}. Br2.1 jest unikalnie zaprojektowany, aby umożliwić inwersje DNA za pośrednictwem Cre, a nie tylko wycięcia ze względu na wzajemną orientację miejsc loxP (Figura 1). Tak więc, te zdarzenia inwersji/wycięcia, które prowadzą do zmiany koloru, mogą trwać tak długo, jak długo Cre jest obecne¹⁶. Z tego powodu indukowalny czasowy system ekspresji Cre jest niezbędny do niezawodnego śledzenia komórek za pomocą Br2.1. Jak pokazano na rysunku 1, Br2.1 zawiera wszechobecny promotor CAG, po którym następuje kaseta Neo^R flankowana przez loxP, która działa jak transkrypcyjna blokada drogowa, po której następują 4 fluorescencyjne geny reporterowe, kodujące białka fluorescencyjne zielone (GFP), żółte (YFP), czerwone (RFP) i cyjan (CFP), umieszczone w dwóch tandemach. Przed aktywacją Cre nie ulega ekspresji fluorescencji. Indukcja rekombinazy Cre powoduje usunięcie kasety Neo-R umożliwiającej losową ekspresję jednego z 4 białek fluorescencyjnych w danej komórce. Pierwszy segment zawiera GFP z bokami loxP i odwrócony YFP, podczas gdy drugi segment zawiera zapytanie ofertowe z bokami loxP i odwrócony CFP. Te segmenty DNA mogą być w sposób ciągły odwracane (przy użyciu loxP, który jest w odwróconej orientacji) lub wycinane, o ile obecna jest rekombinaza Cre. Dlatego należy stosować przejściowy i kontrolowany transgen Cre. Kaseta Br2.1 zapewnia doskonały system rozróżniania nakładających się emisji w lokalizacji sygnału: ekspresja YFP i RFP jest cytoplazmatyczna, GFP jest jądrowa, a CFP jest związany z błoną komórkową. Emisje GFP i RFP można łatwo oddzielić za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W celu oddzielenia emisji YFP/GFP/CFP potrzebny jest spektralny system obrazowania konfokalnego. Ogólnie rzecz biorąc, kaseta Br2.1 umożliwia losową, indukowalną i specyficzną tkankowo ekspresję jednego z czterech odrębnych genów fluorescencyjnych w każdej docelowej komórce. W rzeczywistości, gdy potrzebna jest większa liczba kombinacji kolorów, można wygenerować myszy homozygotyczne, które zawierają 2 allele Br2.1, co skutkuje ekspresją 2 znaczników kolorów dla każdej komórki i zwiększeniem liczby możliwych kombinacji kolorów do 10 ²². Niektóre szczepy myszy Br umożliwiają ekspresję znacznie większej liczby możliwych kombinacji kolorów, ponieważ wiele kopii kasety zostało zintegrowanych z ich genomem¹⁶. Jednak w większości przypadków cztery kombinacje kolorów zapewniane przez pojedynczy allel Br2.1 są wystarczające. Postępując zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem, można ustalić tę metodę przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji mikroskopii spektralnej z niewielką, jeśli w ogóle, potrzebą kalibracji.

Tutaj udostępniamy adaptowalny protokół do użycia myszy R26R-Confetti, które zawierają pojedynczy allel Br2.1, do eksperymentów śledzenia linii nabłonka rogówki. Ten transgeniczny szczep myszy został wykorzystany do badania pochodzenia i losów okrężnicy ^21,23 i komórek macierzystych nabłonka rogówki^22,24, obecności aktywności komórek macierzystych w raku jelita²⁵ oraz do scharakteryzowania podocytów nerkowych w ogniskowym segmentalnym stwardnieniu kłębuszków nerkowych (FSGS)¹⁷.

Protokół

Oświadczenie etyczne: W tym badaniu opieka nad zwierzętami i ich użytkowanie były zgodne z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną.

1. Wybierz odpowiedni szczep myszy z ekspresją rekombinazy Cre

1. Spośród szerokiej gamy linii transgenicznych Cre dostępnych do zakupu²⁶ i w zależności od tkanki docelowej, która ma być badana, wybierz transgeniczny szczep myszy Cre, w którym gen rekombinazy Cre jest kontrolowany przez promotor specyficzny dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku, gdy potrzebna jest kontrola czasowa, wybierz indukowalną linię Cre.
   Uwaga: Wybraliśmy indukowany tamoksyfenem transgen K14-Cre^ERT, aby specyficznie oznaczyć komórki macierzyste / progenitorowe nabłonka rąbka i rogówki²⁴. Należy pamiętać, że mogą istnieć różnice między szczepami, ponieważ Di Girolamo i współpracownicy zgłosili swoistość rąbkową bez ekspresji rogówki dla ich K14-Cre^ERT22. Zaletą stosowania indukowalnych transgenicznych myszy Cre jest to, że umożliwia to indukcję śledzenia linii w różnych ramach czasowych.

2. Wybierz odpowiednią odmianę myszy Br

1. Wybierz odpowiednią kasetę Br w zależności od pytania badawczego i dostępnej linii Cre^16,18,20.
   1. Jeśli stosuje się nieindukowalny szczep myszy Cre, należy wybrać kasetę Br, która nie pozwala na ciągłe inwersje/wycinanie DNA, a tym samym powoduje powstawanie ślepych zaułków (na przykład Br1.0 lub Br1.1)¹⁶.

3. Skrzyżowanie transgenicznych linii zainteresowania

1. W przypadku przedstawionego tutaj protokołu należy skrzyżować homozygotyczny szczep R26R-Confetti (Br2.1/Br2.1) z homozygotycznym szczepem Cre^ERT (Cre^ERT/Cre^ERT), aby uzyskać hemizygotyczne potomstwo (Br2.1/+; Cre/+), które są gotowe do śledzenia linii monoallelicznej, ponieważ wszystkie zawierają pojedynczy allel Br2.1 i pojedynczy allel Cre.
   Uwaga: Aby zwiększyć skuteczność znakowania, można wygenerować myszy zawierające dwa allele Cre (Br2.1/+; Cre/Cre), natomiast dwa allele Br2.1 (Br2.1/Br2.1; Cre/+) zwiększyłoby kombinacje kolorów (jak opisano w ²²).

4. Indukcja rekombinazy Cre

Uwaga: Podawanie tamoksyfenu w tych eksperymentach odbywało się poprzez codzienne wstrzyknięcie dootrzewnowe, przez okres 3-4 dni, w celu wywołania translokacji rekombinazy Cre^ERT do jądra rąbka i rogówki K14-dodatnich komórek macierzystych/progenitorowych komórek macierzystych/progenitorowych. Do wstrzyknięcia czterem myszom można zastosować następujący protokół. Alternatywnie, miejscowe stosowanie tamoksyfenu na powierzchnię oka daje wyższą skuteczność. Roztwór tamoksyfenu można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Podgrzej roztwór przed użyciem.

1. Odważyć 100 mg tamoksyfenu i rozpuścić go w 5 ml oleju kukurydzianego do uzyskania roztworu tamoksyfenu o stężeniu 20 mg/ml.
2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 200 μl roztworu tamoksyfenu (4 mg) 8-tygodniowym myszom przez 3-4 kolejne dni.
   Uwaga: Roztwór tamoksyfenu można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Podgrzej roztwór przed użyciem.
3. Do stosowania miejscowego: zważyć 60 mg tamoksyfenu i rozpuścić go w 1 ml oleju kukurydzianego, aby utworzyć roztwór tamoksyfenu o stężeniu 60 mg/ml. Odwirować roztwór i umieścić go w wstrząsającej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 65 °C, aż stanie się klarowny, pozostawić w łaźni do czasu użycia.
   1. Ostrożnie nanieść 100 μl roztworu tamoksyfenu na każdą powierzchnię oka myszy.

5. Przygotowanie tkanek do obrazowania

1. Uśmiercać zwierzęta za pomocą znieczulenia izofluranem (2% odparowywanego tlenu) (potwierdzić prawidłowe znieczulenie przez brak odruchów), a następnie wdychać CO₂ w odpowiednich punktach czasowych po wstrzyknięciu tamoksyfenu i pobrać odpowiednią tkankę.
   1. W tych eksperymentach należy wyłuszczyć oczy w następujących punktach czasowych: 1, 4, 8, 12 i 16 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Osiągnij enukleację za pomocą zakrzywionych kleszczy. Naciśnij powieki, powodując wyskoczenie gałki ocznej z oczodołu. Umieść kleszcze za gałką oczną, trzymając nerw wzrokowy. Delikatnie pociągnij gałkę oczną i odłącz ją.
      Uwaga: Na tym etapie, jak opisano poniżej, tkanki można przygotować do całościowej analizy znakowanych komórek. Można również przygotować regularne zamrożone skrawki tkanek, utrwalić je w PFA i zobrazować w sposób opisany poniżej (patrz punkty 6 i ²²).
2. Umieść każde oko w naczyniu o średnicy 60 mm wypełnionym PBS.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy przytrzymaj oko w pobliżu nerwu wzrokowego rogówką skierowaną w dół i użyj skalpela w celu usunięcia nerwu wzrokowego, mięśni i tkanki łącznej oraz wykonania małego nacięcia w tylnej części oka.
4. Za pomocą nożyczek sprężynowych ostrożnie powiększ nacięcie, pozwalając obiektywowi wyskoczyć i usuń tęczówkę za pomocą kleszczy.
5. Spłaszcz rogówkę, wykonując 4-5 promienistych nacięć, zaczynając od środka w kierunku obwodu za pomocą skalpela.
6. Użyj skalpela, aby wyciąć nadmiar tkanki obwodowej poza rąbkiem.
7. Utrwal rogówki w PFA 4% przez 10 minut, a następnie krótko umyj je PBS.
8. Inkubować próbki z DAPI przez 10 minut i krótko przemyć PBS.
9. Zamontuj rogówki na szkiełkach szkiełkowych stroną nabłonkową skierowaną do góry. Umieść kroplę podłoża montażowego na rogówce i przykryj szkłem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N w RT. Utrzymuj szkiełka w temperaturze 4 °C.

6. Mikroskopia konfokalna i analiza obrazowa

1. Stosować spektralny system konfokalny, który umożliwia separację emisji YFP/GFP/CFP. Ustaw długości fal wzbudzenia i emisji fluorescencji w zależności od białek fluorescencyjnych kasety Br. Wybierz najbardziej odpowiednią długość fali wzbudzenia dla każdego białka, dążąc do zminimalizowania wzbudzenia krzyżowego. Wybierz wąskie zakresy emisji, aby zminimalizować wyciek sygnałów z różnych białek.
   1. W przypadku kasety Br2.1 jako punkt wyjścia należy przyjąć następujący układ wzbudzenia fluorescencyjnego (ex) i emisji (em): DAPI — ex 405 nm/em 420–480 nm, CFP — ex 458 nm/em 470–500 nm, GFP — ex 488 nm/em 497–508 nm, YFP — ex 514 nm/em 529–540 nm, oraz RFP — ex 561 nm/em 575–615 nm.
2. Aby uwidocznić duże obszary tkanek w wysokiej rozdzielczości, uzyskaj obrazowanie płytek. Aby uzyskać wyniki pokazane na rysunku 2A-B, zobrazuj całą rogówkę, uzyskując tablicę obrazów 12 x 12, tj. uzyskaj 144 pola (512 x 512) przy użyciu 4 kanałów fluorescencyjnych w każdym polu. W sumie zbierz 576 obrazów, a następnie połącz.
3. Aby zbadać lokalizację oznakowanych komórek na różnych głębokościach i strukturach tkanki, uzyskaj obrazy stosu Z różnych regionów zainteresowania. Aby zobrazować pełną głębokość rogówki, należy pobrać 8 odcinków optycznych w odstępach co 3 μm. Ortogonalne widoki pobranych odcinków, jak również projekcje obrazów w oparciu o maksymalne intensywności mogą być konstruowane za pomocą konwencjonalnych programów do obrazowania ²⁴.

7. Uraz rogówki połączony z indukcją tamoksyfenu

1. Znieczulić myszy izofluranem (2% odparowane w tlenie) i podać leki przeciwbólowe (10 mg/kg karpofenu, wstrzykiwany podskórnie). Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak reakcji na szczypanie palców u stóp.
2. Odważyć 1 g tamoksyfenu w proszku i rozpuścić go w 5 ml sterylnego DMSO do uzyskania roztworu o stężeniu 200 mg/ml.
3. Ogrzać roztwór tamoksyfenu do temperatury 65 °C w łaźni wodnej do momentu, aż roztwór stanie się klarowny. Roztwór należy przechowywać w kąpieli do czasu użycia.
4. Nałóż maść do oczu na nieleczone oko po przeciwnej stronie, aby zapobiec odwodnieniu podczas znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie zwracaj myszy, które zostały zranione w oczy, do towarzystwa innych myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Myszy powinny być ściśle monitorowane po urazie. W przypadku, gdy tracą więcej niż 10% masy ciała, cierpią na erozję rogówki lub dyskomfort, eksperyment należy przerwać. Powtarzaj podawanie leków przeciwbólowych co 24 godziny przez cały czas trwania eksperymentu.
5. Za pomocą sterylnej strzykawki, bez dołączonej do niej igły, nanieść miejscowo 200 μl roztworu tamoksyfenu na całą powierzchnię rogówki jednego oka każdej myszy.
   Uwaga: Płynny roztwór szybko krzepnie na powierzchni oka w temperaturze pokojowej. Efekt uszkodzenia rogówki zależy od ciężkości rany. Po jednym zastosowaniu tamoksyfenu/roztworu DMSO nie obserwuje się żadnych działań niepożądanych u myszy. W przypadku wielokrotnego stosowania można zaobserwować zmętnienie rogówki.
6. Kontynuować przygotowanie tkanek i obrazowanie (patrz punkty 5 i 6) w odpowiednich punktach czasowych. Aby uzyskać pokazane tutaj wyniki, poświęć myszy (jak opisano w etapie 5.1) tydzień po zranieniu (ryc. 2 i ²⁴).

Wyniki

Ostatnio skupiliśmy się na zidentyfikowaniu pochodzenia, przetrwania i migracji komórek macierzystych i komórek progenitorowych nabłonka rogówki²⁴. Coraz więcej dowodów potwierdza dogmat, że nabłonek rogówki jest regenerowany przez komórki macierzyste zlokalizowane wyłącznie w niszy rąbka, strefie w kształcie pierścienia na obrzeżach rogówki. Teoria ta jest poparta danymi in vitro i in vivo oraz dowodami klinicznymi, które stanowiły podstawę do udanej pionierskiej terapii rąbkowymi komórkami macierzystymi^27-29. Jednak temat ten pozostawał szeroko dyskutowany w ostatnich latach ze względu na badanie oparte na eksperymentach z przeszczepem rąbka, które sugerowało, że rąbek myszy nie uczestniczy w odnowie rogówki³⁰. Aby przetestować tę interesującą hipotezę, przeprowadzono eksperymenty śledzenia linii genetycznych na myszach R26R-Confetti, aby śledzić los komórek macierzystych/progenitorowych nabłonka rąbka i rogówki w warunkach stabilnych przez okres do 120 dni²⁴. Oczy wyłuszczono, a rogówki płasko zamontowane analizowano za pomocą spektralnej konfokalnej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej 10 i 120 dni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Zgodnie z oczekiwaniami, małe sporadyczne skupiska komórek fluorescencyjnych zaobserwowano na całej powierzchni oka 10 dni po wstrzyknięciu, podczas gdy 1-4 miesiące później (ryc. 2B i ²⁴) powoli rozwijały się wydłużone smugi, które rozciągają się od rąbka w kierunku środka rogówki. Wynik ten sugeruje, że rogówka jest regenerowana przez komórki, które migrują z rąbka w kierunku środka rogówki. Następnie zbadano regenerację rogówki w warunkach zranienia. W celu przetestowania losu komórek rąbka / rogówki K14-dodatnich w warunkach zranienia, jednocześnie indukując skuteczne śledzenie komórek, rozpuściliśmy tamoksyfen w dimetylosulfotlenku (DMSO), który powoduje uszkodzenie rogówki po miejscowym zastosowaniu. W ten sposób udało nam się wywołać łagodne zranienie, jeśli zastosowano pojedynczą aplikację miejscową (ryc. 2C), umiarkowane zranienie, jeśli dodatkowe leczenie samym DMSO zastosowano w dniu poprzedzającym indukcję tamoksyfenu lub ciężką ranę, gdy sam DMSO zastosowano miejscowo w ciągu 2 kolejnych dni przed indukcją tamoksyfenu.

W przeciwieństwie do cienkich pasków rąbka, które powoli rozwijały się i docierały do środka rogówki w ciągu 4 miesięcy w warunkach stabilnego stanu, migracja komórek po urazie była szybka. Co ciekawe, długie i grube paski rąbkowe rozwinęły się już w tych warunkach w ciągu 7 dni. Co ciekawe, różnorodność kolorystyczna była czasami minimalna (ryc. 2D). W naszych dłoniach od czasu do czasu identyfikowano głównie czerwone krwinki w całej rogówce, co wskazuje, że różnorodność kolorów może być stronnicza w kierunku określonych fluoroforów. To niepożądane odchylenie można skalibrować za pomocą testów dawka-odpowiedź, jak opisano wcześniej w Br1.0L³¹ i Br2.1²¹.

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja konstrukcji R26R-Confetti. oraz Konstrukt konfetti R26R zawiera promotor CAG dla wysokich poziomów ekspresji, blok drogowy Neo^R otoczony loxP (czarnym trójkątem) i kasetę Brainbow2.1 w locus^16,21 Rosa26. Kaseta Brainbow2.1 zawiera dwa dimery loxP od głowy do ogona. Jeden dimer składa się z zlokalizowanego jądrowo białka zielonej fluorescencji (GFP) i odwrotnie zorientowanego cytoplazmatycznego białka żółtej fluorescencji (YFP, orientacja odwrócona jest oznaczona jako PFY). Drugi dimer zawiera cytoplazmatyczny RFP i odwrotnie zorientowane cyjanowe białko fluorescencyjne na uwięzi błonowej (CFP, orientacja odwrócona jest oznaczona jako PFC)¹⁶. (B-E) Po aktywacji Cre-rekombinazy mogą wystąpić różne zdarzenia wycinania i inwersji; możliwe wyniki są zilustrowane w B-E. Aktywność Cre indukuje stochastyczne przegrupowanie kasety prowadzące do usunięcia genów i/lub inwersji, a tym samym powoduje losową ekspresję jednego z czterech białek fluorescencyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Śledzenie linii rogówki w homeostazie i urazie. Myszom R26R-confetti/K14-Cre wstrzyknięto 4 mg tamoksyfenu, jak opisano w protokole. We wskazanych punktach czasowych zobrazowano spłaszczone rogówki po indukcji (A-B). Zranienie rogówki w połączeniu z indukcją Cre osiągnięto poprzez miejscowe stosowanie tamoksyfenu rozpuszczonego w DMSO (C-D). Przedstawiono obrazy mozaikowe uzyskane za pomocą wielokanałowej spektralnej mikroskopii konfokalnej (A-D). W homeostazie promieniste paski rąbkowe wolno migrujących komórek rozciągały się między rąbkiem a środkiem rogówki. Paski te rozwijały się powoli, docierając do środka rogówki w ciągu 4-5 miesięcy (B). Widoczne były również skupiska komórek rogówki (białe strzałki, B). Natomiast duże smugi rąbkowe pojawiały się w ciągu jednego tygodnia w warunkach zranienia (C). Przykład odchylenia różnorodności kolorów w kierunku czerwonych krwinek (D). Granica rąbkowo-rogówkowa jest oznaczona linią przerywaną. Podziałka wynosi 500 μm. Skróty: CFP, cyjan fluorescencyjne białko; GFP, białko zielonej fluorescencji; RFP, czerwone białko fluorescencyjne; YFP, żółte białko fluorescencyjne. Liczba ta została zmodyfikowana z ²⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Eksperymenty ze śledzeniem linii są prowadzone od wielu lat. Ostatnie ulepszenia technologiczne i pojawienie się szczepów myszy Confetti otworzyły nowe możliwości badań. Obecnie naukowcy mogą korzystać z dużej liczby dostępnych na rynku linii Cre specyficznych dla tkanki, myszy z nokautem i myszy transgenicznych. Daje to możliwość zaprojektowania wszechstronnych systemów eksperymentalnych do rozwiązywania problemów naukowych z podstawową wiedzą specjalistyczną, unikając pracochłonnej praktyki, a jednocześnie dostarczając solidnych i wiarygodnych danych.

Myszy R26R-Confetti to eleganckie narzędzie do skutecznego śledzenia i badania natury i zachowania komórek w żywym organizmie. System jest łatwy do stworzenia i umożliwia nieinwazyjne śledzenie linii pojedynczych komórek podczas embriogenezy, regeneracji komórek macierzystych w homeostazie lub w różnych okolicznościach, takich jak uraz, stan zapalny i rak. Uzyskane dane dostarczają solidnego opisu przeżywalności komórek docelowych, ekspansji komórek klonalnych i migracji komórek w wymierny sposób. Kluczowym krokiem byłby wybór odpowiedniego genetycznego szczepu myszy, który może niezawodnie umożliwić skuteczne znakowanie specyficzne dla tkanek na precyzyjnym etapie rozwoju. Jednym z ograniczeń tego systemu jest to, że do monitorowania żywego organizmu tkanka musi być dostępna i przezroczysta. Podobnie, śledzenie grubej tkanki w żywym zwierzęciu może być ułatwione tylko przez mikroskopię dwufotonową lub wielofotonową. Możliwe jest jednak śledzenie komórek na pośmiertnych skrawkach tkanek i być może nienaruszona tkanka może być badana po przekształceniu w przezroczystość za pomocą metody CLARITY^32,33. Innym ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest to, że chociaż sąsiednie komórki, które wyrażają ten sam fluorofor, prawdopodobnie należą do tej samej linii klonalnej, możliwe jest również, że mogą one pochodzić z niezależnego pochodzenia komórek, które losowo wyrażały ten sam gen fluorescencyjny. Ta możliwość staje się bardzo mało prawdopodobna w przypadku stosowania wielu alleli Br, aby umożliwić liczne kombinacje kolorów.

W przyszłości połączenie systemu Confetti z dostępnymi narzędziami genetycznymi (tj. modelami myszy knockout, knockin i transgenicznych) pozwoli na badanie genów i ich mutacji w zdrowiu i patologii. Podobnie, śledzenie linii genetycznych w warunkach różnych zaburzeń systemowych (tj. niszczenie nisz komórek macierzystych, ablacja komórek za pośrednictwem lasera, leczenie farmakologiczne) przyniesie nowe informacje na temat udziału szlaków sygnałowych w decyzjach dotyczących losu komórki. Ostatecznie, kombinatoryczne zastosowanie znakowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego, genetyczne reportery szlaków sygnałowych i najnowocześniejsza mikroskopia zapewnią naukowcom solidny system do uczenia się, jak pojedyncze komórki reagują na otoczenie w ich naturalnym środowisku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
R26R-Confetti transgeniczne myszy homozygotyczne dla kasety Brainbow 2.1	Jackson	#013731
K14-CreERT myszy	Jackson	szczep #005107
tamoksyfen	Sigma	T5648
izofluran USP Terrell	Piramal Critical Care
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	stosowany w stężeniu 4  &mikro; g/ml
Immu Mount	Thermo Scientific	9990402
LSM 510 Meta laserowy skaningowy skaningowy system konfokalny podłączony do odwróconego mikroskopu zmotoryzowanego (Axiovert 200M) wyposażonego w zmotoryzowany stolik	Zeiss		Nakładanie się widm między GFP, YFP i CFG wymaga zastosowania obrazowania spektralnego, które pozwala na rozdzielenie widm emisyjnych białek fluorescencyjnych. Tutaj używamy mikroskopu konfokalnego spektralnego Zeiss LSM 510 Meta. Detektor Meta wchodzący w skład tego systemu składa się z 32 elementów detekcyjnych, z których każdy zbiera emisję z 10-nanometrowego pasma fal. Ta technika zwana "spektralnym odciskiem palca" umożliwia użytkownikowi ustawienie najbardziej odpowiednich limitów filtrowania pasma fal. Istnieje wiele spektralnych systemów konfokalnych, które można zastosować, w tym Leica SP5 (ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Oprogramowanie do obrazowania	Zeiss
Duratears-maść do oczu	Alcon