Wzbogacenie błony Brucha z ludzkich oczu dawcy

Podsumowanie

Identyfikacja białek specyficznie związanych z błoną Brucha w ludzkich oczach jest ważnym krokiem w zrozumieniu biochemicznych mechanizmów stojących za chorobami oczu, takimi jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wzbogacić ten arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej do dalszej analizy biochemicznej.

Streszczenie

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną upośledzenia wzroku w krajach rozwiniętych. Choroba objawia się zniszczeniem środka siatkówki, zwanego plamką żółtą, co skutkuje utratą widzenia centralnego. Wczesna postać AMD charakteryzuje się obecnością małych, żółtawych zmian zwanych miękkimi druzami, które mogą przekształcić się w późne AMD, takich jak atrofia geograficzna (suche AMD) lub neowaskularyzacja (wysiękowe AMD). Chociaż zmiany kliniczne są dobrze opisane, a wiedza na temat wpływu genetyki na ryzyko AMD staje się coraz bardziej szczegółowa, jednym z obszarów, w którym brakuje znaczącego postępu, jest zrozumienie biochemicznych konsekwencji ryzyka genetycznego. Wynika to częściowo z trudności w zrozumieniu biochemii błony Brucha, bardzo cienkiej macierzy zewnątrzkomórkowej, która działa jak biologiczny filtr materiału z dopływu krwi i rusztowania, na którym znajduje się monowarstwa komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Druzy tworzą się w błonie Brucha, a ich obecność zaburza przepływ składników odżywczych do komórek RPE. Tylko badając skład białkowy błony Brucha, a także sposób, w jaki inne białka wchodzą z nią w interakcje, naukowcy mogą mieć nadzieję na rozwikłanie mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw powstawania druz, rozwoju AMD i późniejszej utraty wzroku. W tym artykule szczegółowo opisano metodologie wzbogacania całej błony Brucha lub tylko z obszaru plamki żółtej, tak aby można ją było wykorzystać do dalszej analizy biochemicznej, a także przedstawiono przykłady, w jaki sposób już zmienia to rozumienie biochemii błony Brucha.

Wprowadzenie

Wykorzystanie pośmiertnej tkanki ludzkiego oka w badaniach okulistycznych jest nieocenionym źródłem do zrozumienia patogenezy chorób oczu. Analiza ludzkich oczu dawców wniosła istotny wkład w rozpoznanie mechanizmów leżących u podstaw zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), które jest główną przyczyną ślepoty w świecie zachodnim¹. Na całym świecie AMD odpowiada za około 8,7% wszystkich ślepot, a wraz z coraz bardziej starzejącą się populacją przewiduje się, że do 2020 r. dotknie 196 milionów ludzi². AMD powoduje utratę widzenia centralnego i ma ogromny wpływ na niezależność i jakość życia pacjenta³. Wczesna postać AMD charakteryzuje się powstawaniem druz i może przejść w atrofię geograficzną (czasami określaną jako "suche" AMD) lub neowaskularyzację naczyniówkową (określaną również jako neowaskularne lub "mokre" AMD). Chociaż zastrzyki anty-VEGF mogą stabilizować lub poprawiać widzenie w neowaskularnym AMD, nie są one wyleczalne i obecnie nie istnieje leczenie atrofii geograficznej.

Chociaż wykazano, że niektóre warianty genetyczne modyfikują ryzyko AMD ^4-8, mniej wiadomo o tym, jak te warianty wpływają na plamkę żółtą na poziomie biochemicznym. Ważnym miejscem w patogenezie AMD jest błona Brucha. Druzy tworzą się w tej strukturze, a różne badania dostarczyły dowodów na aktywację dopełniacza w błonie Brucha i wokół niej w AMD⁹. Błona Brucha to arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej, który oddziela komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od naczyniówki i ma grubość około 4 μm. Błona Brucha łączy się z naczyniówką włosowatą, warstwą naczyniówki, która zawiera naczynia włosowate z okienkami, a na zewnątrz znajdują się warstwy zawierające większe naczynia krwionośne¹⁰ (ryc. 1A).

Błona Brucha to pentilaminowy arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a ta metodologia szczegółowo opisuje, jak wyizolować błonę Brucha wraz z ECM leżącej pod spodem błony kosmówkowo-naczyniowej (odtąd nazywanej wzbogaconą błoną Brucha), która jest w dużej mierze pozbawiona komórek i wolnych od czerwonych krwinek. Wzbogacona błona Brucha została następnie wykorzystana do eksperymentów western blotting i histologicznych. Ponadto opisano metodologię wzbogacania błony Brucha wyłącznie z obszaru plamki żółtej oka, co będzie szczególnie interesujące dla osób badających biochemiczne aspekty AMD.

Protokół

Ludzka tkanka oka, która została uznana za cel badawczy, została uzyskana z Banku Okulistycznego Królewskiego Szpitala Okulistycznego w Manchesterze po usunięciu rogówki do przeszczepu. Wykorzystanie tkanek ludzkich do badań było zgodne z wytycznymi Ustawy o tkankach ludzkich (2004) oraz z aprobatą Uniwersyteckiej Komisji Etyki Badań Naukowych (numer referencyjny 11305).

1. Wzbogacenie całej błony Brucha

1. Oczyść przestrzeń roboczą wokół i pod mikroskopem sekcyjnym 1% środkiem dezynfekującym (v/v), a następnie przetrzyj 70% (v/v) etanolem.
2. Upewnij się, że masz pod ręką: jeden nowy jednorazowy skalpel, dwa sterylne skrobaki do komórek (powszechnie stosowane w hodowlach tkankowych) i trzy pary pęset (wymienione tutaj jako A, B i C, patrz lista materiałów).
3. Umieść gałkę oczną w jednorazowej szalce Petriego, zachowując pokrywkę do późniejszego użycia. Za pomocą nowego jednorazowego skalpela usuń resztki nerwu wzrokowego, który może przeszkadzać w tworzeniu płaskiego mocowania tkanki. Następnie wykonaj cztery nacięcia w równych odstępach, aby utworzyć cztery ćwiartki, jeśli przechodzisz do części 3 (wzbogacenie błony plamki żółtej) nie przecinaj obszaru plamki żółtej.
   1. Upewnij się, że nacięcia rozciągają się na całej głębokości tkanki oka – od najbardziej wewnętrznej siatkówki neurosensorycznej (NSR), przez naczyniówkę i twardówkę (białko oka). Kontynuuj nacięcie dookoła oka od brzegu muszli ocznej do nerwu wzrokowego. Umożliwi to spłaszczenie muszli ocznej (patrz rysunek 1B).
4. Trzymając jedną ćwiartkę spłaszczonej muszli ocznej za pomocą pęsety A (aby zapobiec odwarstwieniu naczyniówki), użyj większej pęsety B, aby chwycić ciało szkliste i leżące pod spodem NSR i odciągnąć tę tkankę od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), zaczynając od obwodu, przesuwając się w kierunku środka otwartej muszli ocznej, a następnie po przeciwnej stronie. Zazwyczaj, ale nie zawsze, zarówno ciało szkliste, jak i NSR odłączają się jako jedno. Użyj skalpela, aby wyciąć wszelkie pozostałości NSR zakotwiczone na tarczy nerwu wzrokowego.
5. Ponownie, przytrzymując jedną ćwiartkę tkanki na miejscu za pomocą pęsety A, użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie usunąć monowarstwę RPE z całej wewnętrznej powierzchni muszli ocznej. Komórki te łatwo się odklejają i mogą być widoczne jako ciemnobrązowe grudki. Spłucz PBS, aby delikatnie zmyć usunięte komórki RPE z muszli ocznej.
6. Następnie użyj pęsety A, aby delikatnie oderwać leżącą nad nią ciemnoczerwoną tkankę (obejmującą zarówno błonę Brucha, jak i naczyniówkę) ze wszystkich 4 kwadrantów oka. Umieść wyciętą tkankę w czystym naczyniu.
7. Używając spłaszczonej krawędzi skrobaka do jednej komórki, aby przytrzymać wyciętą tkankę na miejscu, użyj drugiego skrobaka, aby delikatnie zeskrobać tkankę. Odwróć tkankę i powtórz, usuwając jak najwięcej nadmiaru materiału. W końcu pozostanie półprzezroczysta membrana: jest to prymitywnie wzbogacona membrana Brucha. Użycie mikroskopu preparacyjnego przy co najmniej 20-krotnym powiększeniu jest niezbędne do pomocy w usuwaniu naczyniówki i wzbogacaniu błony Brucha.
8. Za pomocą pipety Pasteura krótko przepłucz membranę Brucha ultraczystą wodą, aby usunąć resztki naczyniówki i krwi przed umieszczeniem membrany w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
9. Zawiesić wzbogaconą błonę Brucha w około 1 ml ultraczystej wody i krótko (około 15 sekund) wirować, aby pomóc w lizie zanieczyszczającej materii komórkowej (patrz rysunek 2). Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 30 sekund w celu osadzenia membrany i odessania supernatantu.
   Uwaga: Pozostała wzbogacona membrana Brucha jest teraz gotowa do rozpuszczania (jak opisano w sekcji 2 poniżej) lub przechowywania w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

2. Solubilizacja całej wzbogaconej błony Brucha i analiza Western Blot

1. Ekstrahuj białko ze wzbogaconej błony Brucha, zanurzając tkankę w 500 μl 8 M mocznika przez 6 godzin w temperaturze pokojowej w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek (ryc. 3A).
2. Odwirować rozpuszczone próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut, aby osadzać pozostałą materię zewnątrzkomórkową. Usunąć supernatant i przenieść go do membrany dializacyjnej MWCO o stężeniu 3 500 Da MWCO, a następnie umieścić próbkę w 1 l PBS w celu dializy przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
3. Do każdej próbki dodać 40 μl kulek izolujących białko i obracać próbkę z mieszanką kulek (20 obr./min na mieszalniku obrotowym) w temperaturze pokojowej przez 30 min.
4. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia kulek. Usunąć supernatant i rozpuścić białko związane z kulkami w 30 μl 2x bufor do ładowania próbki (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w/v) glicerol, 0,01% błękit bromofenolowy, 3% β-merkaptoetanol).
5. Inkubować próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut, a następnie odwirowywać przy 10 000 x g przez 5 minut, aby zagnieździć pozostałe kulki.
6. Załaduj supernatant zawierający uwolnione białka do wstępnie odlanego żelu gradientowego ze stroną SDS (patrz lista materiałów) w celu oddzielenia białek.
7. Wizualizuj oddzielone prążki białkowe przy użyciu wspólnego protokołu barwienia, np. Coomassie blue.
   1. Krótko mówiąc, dodać 20 ml barwnika brylantowego (0,1% błękitu brylantowego (w/v), 50% metanolu, 10% lodowatego kwasu octowego, 40% wody) do żelu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
   2. Wyrzuć roztwór barwiący i przemyj zabarwiony żel wodą dejonizowaną, aż barwienie tła zostanie wystarczająco zredukowane, aby umożliwić wizualizację barwionego pasma białkowego.
   3. Alternatywnie, przenieś oddzielone pasma białkowe do nitrocelulozy w celu analizy zachodniej, jak opisano poniżej.
8. Przenieść oddzielone pasma białkowe na membranę nitrocelulozową przy 80 mA przez 2,5 godziny za pomocą półsuchego aparatu transferowego w buforze transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 10% [v/v] metanolu).
9. Zablokować błonę w 10 ml PBS, 10% (w/v) mleka i 0,02% (w/v) BSA na 16 godzin w temperaturze 4 °C przed dodaniem pożądanych przeciwciał pierwszorzędowych do wykrywania białka.
   Uwaga: Jako przykład, rysunek 3C pokazuje reprezentatywną immunoplamę rozpuszczonej błony Brucha od trzech oddzielnych dawców sondowanych pod kątem regulatora kaskady dopełniacza, białka podobnego do czynnika H 1 (FHL-1).

3. Wzbogacenie błony plamki żółtej Brucha

1. Wykonaj kroki od 1.1 do 1.3 zgodnie z wcześniejszym opisem.
2. Podczas gdy NSR jest nadal na miejscu, zlokalizuj żółte zabarwienie dołka, które reprezentuje centralny obszar plamki żółtej (patrz ryc. 4). Za pomocą sterylnego stemple biopsyjnego o średnicy 6 mm umieść go nad obszarem dołka i mocno wciąć w plamkę żółtą.
   1. Trzymając stempel do biopsji na miejscu, wykonaj osobne nacięcie skalpelem od krawędzi muszli ocznej do krawędzi ostrza dziurkacza do biopsji, a następnie za pomocą pęsety B oderwij otaczający materiał oka, aby uzyskać czystą biopsję.
3. Za pomocą pęsety C wyjmij 6 mm krążek chusteczki z dziurkacza i umieść na czystej pokrywie szalki Petriego. Umieść pokrywkę szalki Petriego i stempel plamki żółtej pod mikroskopem preparacyjnym
.
4. Usuń cienki krążek NSR (sprawdź, czy nie ma żółtego zabarwienia dołka, aby wywnioskować dokładność biopsji). Użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie usunąć komórki RPE.
5. Zabezpiecz krążek plamki żółtej przez twardówkę za pomocą końcówek pęsety A i powoli oderwij naczyniówkę i kompleks błonowy Brucha za pomocą pęsety C. Ponownie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć niechciany naczyniówkę i materię krwi z błony Brucha.
6. Umieść błonę plamki żółtej Brucha w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zawiesić w 1 ml ultraczystej wody. Wiruj przez chwilę (około 15 sekund), aby pomóc w lizie zanieczyszczającej materii komórkowej. Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 30 sekund w celu osadzenia membrany i odessania supernatantu.
   Uwaga: Wzbogacona błona Brucha wyizolowana z plamki żółtej może być teraz wykorzystana do analizy proteomicznej przy użyciu preferowanych przez użytkownika protokołów trawienia.

Wyniki

Opisany powyżej protokół otrzymywania wzbogaconej błony Brucha prowadzi do izolacji błony Brucha, czyli macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) choriocapillaris, i usuwa większość komórek oraz szczątków komórkowych, w tym wszystkie komórki RPE (Rysunek 2). Płukanie wzbogaconej błony Brucha w wodzie jest kluczowym etapem w lizie wszelkich pozostałych komórek naczyniówki. Nacisk wywierany podczas skrobania naczyniówki wydaje się zagęszczać niektóre z nielicznych pozostałych jąder komórkowych w obszarze zdefiniowanym jako błona Brucha (Rysunek 2B).

Solubilizacja wzbogaconej błony Brucha umożliwia dalszą analizę zawartości białek. Rozdział prążków białkowych z solubilizowanej wzbogaconej błony Brucha z wykorzystaniem żelu SDS-PAGE z gradientem 4 - 12%, choć sam w sobie nie jest użyteczny do identyfikacji zawartości białek, wykazuje zdolność tej techniki do minimalizacji zanieczyszczeń białkami krwi, które wiążą się nieswoiście (Rycina 3B). W tym względzie zauważalnym brakiem w elektroforezie białek jest obszerny prążek albuminy surowicy ludzkiej (~66 kDa), który w przeciwnym razie mógłby utrudnić interpretację późniejszego western blottingu: potwierdza to również analiza histologiczna wzbogaconej błony Brucha przedstawiona na Rycynie 2. Rzeczywiście, w ramach prac opisanych wcześniej¹¹, solubilizowana błona Brucha od szeregu indywidualnych dawców była badana pod kątem liczby białek przy użyciu specyficznych przeciwciał via western blotting (Rycina 3C). W przedstawionym tutaj przypadku zastosowano przeciwciało (oznaczone jako OX23)¹² skierowane przeciwko 155 kDa regulatorowi odporności wrodzonej, zwanemu czynnikiem H dopełniacza (FH), co wykazało obecność prążka o niższej masie cząsteczkowej w próbkach błony Brucha od trzech oddzielnych dawców (Rycina 3C). Okazało się to później białkiem podobnym do czynnika H 1 (FHL-1), białkiem o masie 49 kDa spokrewnionym z FH i powstającym w wyniku wariacji splicingu tego samego genu¹³. FHL-1 wydaje się być głównym regulatorem dopełniacza obecnym w błonie Brucha¹¹.

Rysunek 1. Dysekcja ludzkiego oka i wzbogacanie błony Brucha. (A) Błona Brucha stanowi barierę z macierzy zewnątrzkomórkowej. Naczyniówka zawiera warstwę okienkowatych kapilar, które nieustannie zlewają się z błoną Brucha (tzw. choriocapillaris); oddzielają one resztę naczyniówki (zawierającą duże naczynia krwionośne) od jednowarstwowego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), który fizjologicznie wspiera fotoreceptory siatkówki nerwowo-czuciowej (NSR). (B) W gałce ocznej wykonuje się cztery nacięcia, co pozwala na jej otwarcie i przygotowanie preparatu płaskiego. Ciało szkliste można usunąć za pomocą pęsety. NSR może oddzielić się wraz z ciałem szklistym, ale można je również usunąć pęsetą. Do usunięcia warstwy komórek RPE z błony Brucha, podczas gdy jest ona wciąż zakotwiczona w naczyniówce i twardówce, używa się skrobaka do komórek. Kompleks błony Brucha i naczyniówki można oddzielić od twardówki, a następnie, używając nowego skrobaka, usunąć zewnętrzną część naczyniówki. Końcowe płukanie w wodzie ultrazczystej powoduje lizę pozostałych elementów komórkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Histologia błony Brucha i naczyniówki. Przekroje barwione H&E przed (A) i po (B) zeskrobaniu zewnętrznych struktur naczyniówki z błony Brucha i płukaniu w wodzie ultrapurej w celu uzyskania wzbogaconej błony Brucha. Paski skali reprezentują 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Solubilizacja wzbogaconej błony Brucha w celu analizy zawartości białek. (A) Białka można wyekstrahować z wzbogaconej błony Brucha poprzez inkubację w 8 M mocznika przez 6 hr w RT, a następnie poddać dializie przeciwko PBS. Do analizy Western białka z całego dialyzatu błony Brucha można wyizolować za pomocą kuleczek do izolacji białek i eluować poprzez gotowanie z redukującym buforem do ładowania próbek Laemmliego. (B) Reprezentatywny żel SDS-PAGE barwiony błękitem Coomassie, pokazujący zarówno nie programmerskie, jak i rozcieńczone solubilizowane białka błony Brucha (BM) z zastosowaniem metody opisanej w (A). (C) Reprezentatywny western blot solubilizowanej błony Brucha od 3 indywidualnych dawców (ścieżki 1 - 3) pod kątem białka podobnego do czynnika H-1 (FHL-1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Izolacja wzbogaconej błony Blocha z plamki. Obszar plamki siatkówki to obszar o średnicy 5 mm, który można łatwo zidentyfikować po żółtym zabarwieniu znajdującej się nad nią dołka centralnego oraz dzięki bliskości sąsiedniej tarczy nerwu wzrokowego. Kierując się dołkiem centralnym, należy przyłożyć 6 mm wycinak do biopsji do płasko zamocowanego ludzkiego oka, aby wyciąć 6 mm blok tkanki plamki. Należy usunąć znajdującą się powyżej NSR i zeskrobać komórki RPE z wyciętej plamki. Pozostały kompleks błony Blocha/naczyniówki można następnie oddzielić od twardówki i dokładnie zeskrobać w celu usunięcia naczyniówki, a następnie poddać pozostały materiał komórkowy lizie poprzez zanurzenie w wodzie ultrazczystej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu opisano wzbogacenie membrany Brucha do dalszej analizy, co pozwala na późniejsze analizy, w tym western blotting¹¹, spektrometrię mas i właściwości dyfuzyjne membrany Brucha z wykorzystaniem zmodyfikowanych komór Ussinga^11,14. Krytyczne kroki obejmują: a) dokładne skrobanie i umycie wewnętrznej powierzchni oka w celu usunięcia wszystkich komórek RPE, b) wielokrotne i staranne skrobanie leżącego pod spodem naczyniówki bez powodowania rozpadu zespołu Brucha oraz c) mycie wyciętego Brucha w ultraczystej wodzie, aby zapewnić lizę pozostałych komórek. Ponadto, jeśli wzbogacona błona Brucha ma być wykorzystana do analizy proteomicznej, ekstrakcja białek za pomocą mocznika jest najbardziej skuteczna w rozbijaniu tej sprężystej tkanki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak homogenizacja mechaniczna. Histologia wzbogaconej błony Brucha wskazuje, że ECM naczyniówki nie jest usuwana. Należy się tego spodziewać, ponieważ zewnętrzna warstwa błony Brucha pentilaminarnego jest utworzona przez błony podstawne komórek śródbłonka naczyniówki i naczynia włosowatego. Rzeczywiście, korzystne może być to, że ECM naczyniówki pozostaje, ponieważ zmiany zachodzą w tym w AMD, w tym odkładanie się końcowego kompleksu dopełniacza / kompleksu ataku błony (MAC)¹⁵. Należy zauważyć, że w przypadku szczegółowej analizy histologicznej błony Brucha, jej struktura byłaby lepiej zachowana, gdyby została przecięta w obecności twardówki, naczyniówki i błony Brucha. Rzeczywiście, histologia przedstawiona na rycinie 2 ma na celu wyłącznie ukazanie stopnia wzbogacenia wynikającego z techniki opisanej w tym manuskrypcie.

Wzbogacenie plamki żółtej Brucha wymaga starannego rozwarstwienia muszli ocznej, upewniając się, że NSR, a zwłaszcza dołek centralny, nie są uszkodzone; W przeciwnym razie identyfikacja, a tym samym izolacja plamki żółtej nie jest możliwa. Integralność tkanki jest również ważna dla tego procesu, dlatego zaleca się wykorzystanie próbek w czasie krótszym niż 48 godzin po uboju. Wymagany stopień wzbogacenia różni się w zależności od dawcy i może mieć na niego wpływ wiek dawcy, czas pośmiertny i obecność jakiejkolwiek patologii oka. Użycie terminu "wzbogacony" jest celowe w celu uznania ograniczenia techniki, a mianowicie, że "oczyszczenie" lub "izolacja" błony Brucha przy użyciu tej metody po prostu nie jest możliwa. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę, że ECM naczyniówki włosowatej łączy się z błoną Brucha, całkowite oddzielenie nie jest możliwe.

Zrozumienie zmian biochemicznych w odpowiednich tkankach oka jest niezbędne do zrozumienia postępu choroby oczu. To unikalne wzbogacenie błony Brucha ułatwia to zrozumienie; Trwające badania dotyczą proteomu wzbogaconej błony plamki żółtej Brucha przy użyciu spektrometrii mas w różnych stadiach AMD oraz w próbkach pochodzących od osób o różnych genotypach, aby lepiej zrozumieć patologię molekularną AMD. Opisana tutaj technika została już wykorzystana do pomyślnej identyfikacji FHL-1 jako dominującego regulatora dopełniacza w błonie Brucha ¹¹ , a dalsze badania nad wzbogaconą błoną Brucha prawdopodobnie przyniosą więcej nowych informacji na temat patologii molekularnej AMD.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw pomocniczy 0,5X	GT-Vision Ltd	3638	Przydatny (ale nie niezbędny) do obrazowania całego oka w mniejszym powiększeniu płaski
dziurkacz do biopsji 6 mm	Materiały medyczne na wezwanie	SCH-33-36	6mm Stemple do biopsji
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma - Aldrich	A3059
Bromofenol Blue	Sigma - Komórka Aldrich	B0126
skrobaki	Sarstedt	83.183	Do wzbogacania membrany
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Skalpele jednorazowe	Fisher Scientific	12387999	Sterylne, pojedynczo pakowane skalpele Swann-Morton.
Podwójne reflektory punktowe LED na gęsiej szyi na ramionach 30 cm	GT-Vision Ltd	0153	Elastyczne źródło światła niezbędne do preparacji i obrazowania
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma - Aldrich	D8537	Stosowany w celu zapobiegania wysychaniu plamki żółtej i podczas wzbogacania błony.
(A) Kleszcze	Materiały do laboratoriów naukowych	INS4280	(A) Cienkie (100 mm) i proste
(B) Kleszcze	Materiały do laboratoriów naukowych	INS4272	(B) Szerokie i (150 mm). Przydatny do podnoszenia dużych porcji próbki
(C) Kleszcze	Naukowe materiały laboratoryjne	INS4323	(C) Proste drobne punkty
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 cyfrowy kolorowy aparat fotograficzny i Oprogramowanie GT-Vision	GT-Vision Ltd	1122
Metanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Membrana nitrocelulozowa	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
szalka Petriego	Sterilin	101VR20	90 mm, używana jako naczynie na próbki
Kulki izolacyjne białek (żywica Strataclean)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Mikroskop stereozoom GXMXTL3T (zakres powiększenia 7X - 45X)	GT-Vision Ltd	5595	Mikroskop stereozoom przymocowany do statywu wysięgnika dla łatwości użycia podczas sekcji
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253