Artykuł metodologiczny

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

DOI:

10.3791/53411

⸱

21 stycznia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda wyodrębniania endospor bakteryjnych ze złożonych społeczności mikrobiologicznych została opracowana w celu przeprowadzenia dostosowanych kultur lub badań molekularnych tej grupy bakterii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie endospor to strategia przetrwania znaleziona wśród niektórych bakterii z typu Firmicutes. Podczas tworzenia przetrwalników bakterie te wchodzą w morfofizjologiczny stan spoczynku, który zwiększa przeżywalność w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Mimo że tworzące endospory Firmicutes są jedną z najczęściej wzbogacanych i izolowanych grup bakteryjnych w badaniach hodowlanych, często są one nieobecne w badaniach różnorodności opartych na metodach molekularnych. Odporność rdzenia zarodnika jest uważana za jeden z czynników ograniczających odzyskiwanie DNA z endospor. Opracowaliśmy metodę, która wykorzystuje wyższą odporność endospor do oddzielenia ich od innych komórek w złożonej społeczności mikrobiologicznej przy użyciu metod lizy fizycznej, enzymatycznej i chemicznej. Uzyskany w ten sposób preparat zawierający wyłącznie przetrwalniki może być wykorzystany do ponownej hodowli lub do przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak dostosowana ekstrakcja DNA zoptymalizowana pod kątem przetrwalników i późniejsze sekwencjonowanie DNA. Metoda ta, zastosowana do próbek osadów, pozwoliła na wzbogacenie endospor i po sekwencjonowaniu ujawniła dużą różnorodność substancji tworzących przetrwalniki w osadach jezior słodkowodnych. Spodziewamy się, że zastosowanie tej metody do innych próbek przyniesie podobny wynik.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej pracy jest dostarczenie protokołu do oddzielania endospor bakteryjnych od wegetatywnych komórek bakteryjnych w próbkach środowiskowych. Tworzenie się endospor bakteryjnych jest strategią przetrwania, zwykle wywoływaną przez głód, występującą w wielu grupach bakterii należących do gromady Firmicutes1. Bakterie tworzące endospory są dobrze zbadane, głównie dlatego, że wiele szczepów jest patogenami, a zatem ma znaczenie medyczne (np. Bacillus anthracis lub Clostridium difficile). Środowiskowe szczepy bakterii tworzących przetrwalniki zostały wyizolowane z praktycznie każdego środowiska (gleby, wody, osadów, powietrza, lodu, jelit ludzkich, jelit zwierząt i innych)1-3. Dlatego Firmicutes są drugą najliczniejszą gromadą w kolekcjach kultur4.

Ze względu na ich wytrzymałą zewnętrzną korę i ochronne białka rdzenia, przetrwalniki mogą przetrwać ekstremalne warunki środowiskowe, począwszy od wysuszenia, a skończywszy na wysokim promieniowaniu, ekstremalnych temperaturach i szkodliwych chemikaliach5. Ta niezwykła odporność sprawia, że ekstrakcja DNA z przetrwalników6-8 jest wyzwaniem. To prawdopodobnie wyjaśnia, dlaczego zostały one pominięte w badaniach sekwencjonowania środowiskowego9,10. Inne metody, takie jak celowanie w przetrwalniki w próbkach środowiskowych za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych11, oznaczanie ilościowe kwasu dipikolinowego (DPA) w glebie12 i osadzie13, cytometria przepływowa14 lub pasteryzacja, a następnie hodowla15,16 zostały wykorzystane do uzyskania lub ilościowego określenia endospor w próbkach środowiskowych. W ostatnich latach opracowano zoptymalizowane metody ekstrakcji DNA, a także specyficzne startery molekularne do celowania w sekwencje genów specyficzne dla endospor10,17-20. Przyczyniło się to do ujawnienia większej różnorodności biologicznej wśród tej grupy bakterii21, a także doprowadziło do zastosowań w przemyśle i medycynie do wykrywania endospor, na przykład w mleku w proszku19.

Przedstawiony tutaj protokół opiera się na różnicy w odporności na szkodliwe warunki fizykochemiczne (takie jak ciepło i detergenty) przetrwalników bakteryjnych w stosunku do komórek wegetatywnych. Aby zniszczyć komórki wegetatywne w próbce, stosujemy kolejno ciepło, lizozym i niskie stężenia detergentów. Czas i siła tych zabiegów zostały zoptymalizowane tak, aby nie niszczyć zarodników, ale lizować wszystkie komórki wegetatywne. Niektóre komórki w środowiskowej puli komórkowej są bardziej odporne niż inne, dlatego aby zwiększyć prawdopodobieństwo zniszczenia wszystkich komórek wegetatywnych, stosujemy trzy różne zabiegi. Zaletą i nowością tej metody jest to, że przetrwalniki po zabiegu są nadal nienaruszone i mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Obejmują one ekstrakcję DNA, ilościowy PCR (qPCR) oraz sekwencjonowanie amplikonowe lub metagenomiczne (ukierunkowane konkretnie na grupę endospor, a tym samym zmniejszające różnorodność, przy jednoczesnym zwiększeniu zasięgu). Przetrwalniki mogą być również wykorzystywane do dalszej hodowli lub kwantyfikacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub wykrywania DPA. Ważną cechą tej metody jest to, że porównując próbkę niepoddaną działaniu substancji z próbką poddaną działaniu środka, można wywnioskować ilość i różnorodność przetrwalników w próbce środowiskowej oprócz składnika odpowiadającego komórkom wegetatywnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie chemikaliów i sprzętu

  1. Przygotować 500 ml 1% roztworu heksametafosforanu sodu (SHMP) (NaPO3)n i sterylizować w autoklawie.
  2. Sterylizuj filtry nitrocelulozowe (NC) (wielkość porów 0,22 μm, średnica 47 mm) przez autoklawowanie w zamkniętych szklanych szalkach Petriego.
  3. Sterylizuj filtry NC (wielkość porów 0,22 μm, średnica 25 mm) przez autoklawowanie w zamkniętych szklanych szalkach Petriego.
  4. Zważyć i zanotować masę pustą sterylnych probówek o pojemności 50 ml (z założoną nakrętką) (jedna probówka na próbkę).
  5. Przygotować bufor Tris-EDTA (bufor TE) 1x: przygotować roztwór 10 mM Tris (tris(hydroksymetylo)aminometan) i 1 mM buforu EDTA. Dostosuj pH do 8 i sterylizuj w autoklawie.
  6. Przygotować roztwór lizozymu (20 mg/ml), rozpuszczając 0,02 g lizozymu w 1 ml buforu TE. Idealnie, za każdym razem rób świeże. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 tydzień.
  7. Przygotować roztwór fizjologiczny, rozpuszczając 8 g/l chlorku sodu (NaCl) w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie.

2. Oddzielanie biomasy od osadu

  1. Dodać 3 g próbki osadu do wstępnie zważonych sterylnych probówek o pojemności 50 ml za pomocą metalowych czerpaków płomieniowanych etanolem. Zrób to w czystej, sterylizowanej promieniami UV komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Dodać 15 ml 1% sterylnego (autoklawowanego) roztworu SHMP do próbki za pomocą sterylnej biurety z podziałką. Roztwór SHMP można również filtrować, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  3. Homogenizować osad i roztwór SHMP za pomocą płynnego dyspergatora/homogenizatora (np. homogenizatora Ultra-Turrax). 70% etanolu - sterylizuj lub autoklawuj rotor dyspersyjny przed użyciem. Uruchomić homogenizację na 1 minutę przy 17 500 obr./min. Pozostawić próbkę na 2 minuty i powtórzyć homogenizację przez 1 minutę przy tej samej prędkości wirnika.
  4. Odstawić próbkę na 10 minut. Na tym etapie najcięższe cząstki (minerały) osiądą. Komórki i wszelkie organiczne składniki próbki pozostaną jednak w roztworze. Następnie przenieść roztwór supernatantu (zawierający biomasę komórkową) do czystej probówki o pojemności 50 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  5. Do osadu dodać ponownie 15 ml 1% sterylnego (autoklawowanego) roztworu SHMP za pomocą sterylnej biurety z podziałką. Następnie powtórz kroki 2.3 i 2.4. To powtórzenie zapewnia oddzielenie maksymalnej ilości komórek i cząstek organicznych od składnika mineralnego osadu. Supernatant tego drugiego rozdziału może być połączony z supernatantem z pierwszego rozdziału.
    Uwaga: Poniższe kroki są wykonywane na supernatancie (zawierającym biomasę komórkową). Składnik mineralny (osad) można wyrzucić.
  6. Odwirować próbkę o masie 20 g przez 1 minutę. Ten krok zwiększa siłę g na tyle, aby osadzić małe cząstki mineralne, podczas gdy biologiczny materiał komórkowy nadal pozostaje w roztworze. Po odwirowaniu przenieść roztwór sklarowanego osadu (zawierający biomasę komórkową) do czystej probówki o pojemności 50 ml. Wyrzuć granulat mineralny.
  7. Oznaczyć końcową objętość roztworu zawierającego biomasę przez zważenie próbki. Oznaczanie masy pozwala uniknąć konieczności przenoszenia próbki do cylindra z podziałką i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia.

3. Zbieranie biomasy na membranie filtracyjnej

  1. Przygotuj jednostkę filtracyjną (do membran o średnicy 47 mm) i pompę próżniową. Wysterylizuj jednostkę filtracyjną albo przez autoklawowanie, albo (w przypadku szkła Pyrex) przez spryskanie jej 70% etanolem i spalenie palnikiem Bunsena. Poczekaj, aż ostygnie, zanim przejdziesz do protokołu.
  2. Dodaj sterylną membranę NC do jednostki filtracyjnej za pomocą sterylizowanych kleszczy płomieniowanych etanolem.
  3. Dodać połowę próbki sklarowanej nad osadem (z kroku 2.6) do urządzenia do filtracji membranowej i zebrać komórki na membranie za pomocą pompy próżniowej.
  4. Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową i ostrożnie zdejmij membranę za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem etanolu. Umieść membranę na sterylnej szalce Petriego.
    1. Przetnij membranę na pół za pomocą wysterylizowanych nożyczek płomieniowanych etanolem. Dodać każdą połówkę błony do oddzielnej probówki o pojemności 2 ml. Jedna połowa błony zostanie wykorzystana do ekstrakcji DNA i analizy całej społeczności bakteryjnej. Druga połowa filtra będzie przechowywana w temperaturze -80 °C i służy jako kopia zapasowa.
  5. Umieścić nową membranę NC na jednostce filtrującej i zebrać biomasę z drugiej połowy objętości próbki (z kroku 2.6) za pomocą pompy próżniowej.
  6. Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową i ostrożnie zdejmij membranę za pomocą sterylizowanych kleszczyków płomieniowanych etanolem. Umieść całą membranę w osobnej probówce o pojemności 2 ml. Próbka ta zostanie wykorzystana do leczenia w celu oddzielenia endospor od komórek wegetatywnych. Próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

4. Liza komórek wegetatywnych

  1. Przeprowadzić zabieg w celu oddzielenia przetrwalników od komórek wegetatywnych na biomasie uprzednio zebranej na membranie NC (krok 3.6).
    1. Jeśli membrana została zamrożona, pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 10 minut do rozmrożenia. Następnie umieść membranę na sterylnej szalce Petriego i pokrój ją (około 4 razy) na mniejsze kawałki za pomocą sterylizowanych nożyczek płomieniowanych etanolem. Następnie umieść wszystkie kawałki filtra membranowego w sterylnej probówce o pojemności 2 ml.
  2. Dodać 900 μl 1x buforu TE (Tris-EDTA) (patrz 1.5) do probówki zawierającej membranę próbki i dokładnie wymieszać za pomocą wiru. Na tym etapie biomasa jest usuwana z membrany do roztworu buforowego TE.
  3. Umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 65 °C na 10 minut i 80 obr./min. Następnie wyjmij probówkę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć przez 15 minut.
  4. Dodać 100 μl świeżo przygotowanego lizozymu (patrz 1.5) do uzyskania końcowego stężenia 2 mg/ml. Nie dodawać lizozymu, zanim próbka nie ostygnie do 37 °C, ponieważ może to spowodować degradację enzymu.
  5. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 60 minut i 80 obr./min, w optymalnych warunkach dla lizozymu do lizy komórek wegetatywnych.
  6. Po zakończeniu lizy dodać do próbki 250 μl 3 N wodorotlenku sodu (NaOH) i 250 μl 6% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS). Po dodaniu tego objętość próbki osiąga 1,5 ml i uzyskuje się końcowe stężenie 0,5 N NaOH i końcowe stężenie 1% SDS.
  7. Inkubować tę mieszankę w temperaturze pokojowej przez 60 minut i 80 obr./min. Dodanie bazy i detergentów pomoże w końcowej lizie komórek. Stężenie tych detergentów zostało zoptymalizowane tak, aby nie szkodzić przetrwalnikom podczas lizy komórek wegetatywnych.
  8. Przygotuj sterylną jednostkę filtracyjną, która utrzymuje membrany o średnicy 25 mm przez autoklawowanie lub (w przypadku szkła Pyrex) spryskanie jej 70% etanolem i spalenie palnikiem Bunsena. Niech ostygnie.
  9. Umieść membranę NC 0,2 μm (średnica 25 mm) na jednostce filtracyjnej za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem etanolu.
  10. Dodać próbkę z kroku 4.7 na membranę i przefiltrować ciecz za pomocą pompy próżniowej. Gdy płyn przepłynie, wyłącz pompę próżniową. Na tym etapie lizowany wegetatywny materiał komórkowy jest usuwany, ponieważ nie jest zatrzymywany na błonie. Na błonie pozostaną tylko przetrwalniki.
  11. Dodać 2 ml sterylnego roztworu fizjologicznego, aby zmyć resztki detergentów i przefiltrować płyn za pomocą pompy próżniowej.
  12. Gdy ciecz zostanie całkowicie przefiltrowana, wyłącz pompę próżniową. Pozostaw membranę na jednostce filtrującej.

5. Leczenie DNazy

Uwaga: Zabieg DNazy należy przeprowadzić bezpośrednio na membranie filtracyjnej. Ważne jest, aby jednostka filtrująca nie przeciekała, a pompa próżniowa była wyłączona.

  1. Dodać 450 μl sterylnej wody, 50 μl buforu reakcyjnego DNazy (1x) i 0,5 μl enzymu DNazy bezpośrednio na membranę filtracyjną i odstawić na 15 minut. Jeśli to możliwe, przeprowadź trawienie w pomieszczeniu, które jest nieco cieplejsze niż przeciętne RT, ponieważ enzym działa lepiej w temperaturach 25 °C i wyższych.
    Uwaga: Odłożenie palnika Bunsena na bok jednostki filtrującej również zwiększa temperaturę i ma dodatkową zaletę w postaci utrzymania sterylności otoczenia, a tym samym zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia próbek.
  2. Po zakończeniu mineralizacji DNazy włącz pompę próżniową, aby usunąć enzym z próbki.
  3. Zmyć resztki enzymu, dodając i filtrując 1 ml roztworu fizjologicznego.
  4. Jeśli ciecz całkowicie przeszła, wyłącz pompę próżniową i usuń membranę filtracyjną zawierającą przetrwalniki za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść ją na sterylnej szalce Petriego.
    Uwaga: Próbka oddzielonych endospor jest teraz gotowa do dalszej analizy. Przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli jest używany do ekstrakcji DNA lub alternatywnie w temperaturze 4°C, jeśli jest używany do kiełkowania i hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj wyniki zostały opublikowane wcześniej10,21. Prosimy o zapoznanie się z tymi artykułami w celu interpretacji środowiskowej i omówienia danych.

Cała procedura jest podsumowana na rysunku 1 i odpowiada trzem głównym krokom: po pierwsze, oddzielenie biomasy od osadu lub jakiejkolwiek innej matrycy środowiskowej; po drugie, zniszczenie komórek wegetatywnych; i po trzecie, dalsza analiza oddzielonych endospor. Dalsza analiza może polegać na przykład na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odporność endospor na zewnętrzne agresywne czynniki fizykochemiczne (np. temperaturę czy detergenty) wykorzystano do opracowania metody oddzielania endospor bakteryjnych od komórek wegetatywnych w próbkach środowiskowych. Jest to pierwsza kompleksowa metoda izolowania endospor z próbek środowiskowych w sposób nieniszczący. Poprzednie metody ilościowego określania, wykrywania lub analizowania endospor w próbkach opierały się na pomiarze określonych wskaźników zastępczych dla endospor, takich jak kwas dipikolinowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki za grant nr 31003A-132358/1, 31003A_152972 i nr 151948, oraz Fundacji Pierre Mercier pour la Science.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry membranowe nitrocelulozowe Whatman, 0,2 μ m wielkość porów, średnica 47 mmSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich 
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma-Aldrich252859 Sigma-AldrichCAS 77-86-1
EDTASigma-AldrichE9884 Sigma-AldrichCAS  60-00-4 
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma-Aldrich62971 Flukaw proszku, CAS  12650-88-3 
Homogenizator Ultra-Turrax T18 basicIKA3720000
Szklane uchwyty filtrów do 47  mm membrany, szkło PyrexEMD MilliporeXX10 047 00
Pompa próżniowa do pracy chemicznejMilliporeWP6122050220 V/50 Hz
Filtracja do pobierania próbek w kolektorze dla 25  mm membranyMillipore1225 Kolektor do pobierania próbekpolipropylen
DnaseNew England BiolabsM0303SBez Rnazy
NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
Dodecylosulfan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Filtry membranowe nitrocelulozowe Whatman, 0,2 μ m wielkość porów, średnica 25 mmSigma-AldrichWHA7182002 Aldrich

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281(2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja endosporliza kom rek wegetatywnychoczyszczanie endosporprzetwarzanie pr bek osad wfiltracja membranowaobr bka lizozymemwodorotlenek sodu SDSobr bka nukleaz DNazwzbogacanie endospordetekcja Firmicutes

Powiązane artykuły