Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Podsumowanie

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Streszczenie

Fibroblasty są głównym typem komórek odpowiedzialnym za wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej i są krytycznym składnikiem wielu narządów i tkanek. Fizjologia i patologia fibroblastów leżą u podstaw spektrum jednostek klinicznych, w tym zwłóknień w wielu narządach, blizn przerostowych po oparzeniach, utraty funkcji serca po niedokrwieniu i tworzeniu się zrębu nowotworowego. Jednak fibroblasty pozostają słabo scharakteryzowanym typem komórek, głównie ze względu na ich nieodłączną niejednorodność. Istniejące metody izolacji fibroblastów wymagają czasu spędzonego w hodowli komórkowej, co ma głęboki wpływ na fenotyp i zachowanie komórek. W związku z tym wiele badań nad biologią fibroblastów opiera się na manipulacji in vitro i nie rejestruje dokładnie zachowania fibroblastów in vivo. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów ze skóry grzbietowej dorosłych myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej, zachowując w ten sposób fizjologiczny profil transkrypcyjny i proteomiczny każdej komórki. Nasza strategia pozwala na wykluczenie linii niemezenchymalnych za pomocą bramki ujemnej linii (Lin^-), a nie strategii selekcji pozytywnej, aby uniknąć wstępnej selekcji lub wzbogacenia subpopulacji fibroblastów wyrażających określone markery powierzchniowe i być jak najbardziej inkluzywnym w tym heterogenicznym typie komórek.

Wprowadzenie

Fibroblasty są często definiowane morfologicznie jako wrzecionowate komórki, które przylegają do plastikowych substratów. Fibroblasty są głównym typem komórek odpowiedzialnych za syntezę i przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej w narządach embrionalnych i dorosłych¹. Fibroblasty mają zatem kluczowe znaczenie dla rozwoju ssaków i w znacznym stopniu przyczyniają się do rozwoju środowiska zewnątrzkomórkowego, które wpływa na zachowanie sąsiednich typów komórek obecnych w każdej tkance i narządzie.

Fibroblasty są również głównym typem komórek stojącym za różnorodnym zestawem schorzeń, które powodują ogromne obciążenie kliniczne. Patologiczna aktywność fibroblastów upośledza normalne funkcjonowanie tkanek i obejmuje zwłóknienie tkanek i narządów (takich jak płuca i wątroba), bliznowacenie po gojeniu się ran skóry, miażdżycę, twardzinę układową i tworzenie się blaszek miażdżycowych po uszkodzeniu naczyń krwionośnych^2-5. W szczególności gojenie się ran, zarówno ostre, jak i przewlekłe, polega na odkładaniu się tkanki bliznowatej, która ani nie przypomina normalnej tkanki, która ją otacza, ani nie funkcjonuje jak nią, i prowadzi do znacznej zachorowalności w różnych stanach patologicznych. Po urazie następuje przejście fibroblastów do miofibroblastów, które następnie wydzielają strukturalne składniki ECM, wywierają parakrynne działanie na sąsiednie typy komórek i przywracają stabilność mechaniczną poprzez odkładanie tkanki bliznowatej⁶.

W tkankach skórnych występują znaczne różnice w jakości gojenia ran w czasie rozwoju i między miejscami anatomicznymi. W pierwszych dwóch trymestrach życia płód goi się bez blizn; Jednak od trzeciego trymestru i przez cały okres dorosłości ludzie goją się z blizną. Istnieją różnice w gojeniu się ran w zależności od miejsca, a także wieku. Przebudowa ran w jamie ustnej z minimalnym tworzeniem się blizn^7,8, podczas gdy odkładanie się tkanki bliznowatej w obrębie ran skórnych jest znaczące⁹. Utrzymują się kontrowersje dotyczące względnego wpływu środowiska w porównaniu z wewnętrznymi właściwościami miejscowych fibroblastów na wynik gojenia się ran, zarówno w odniesieniu do wieku, jak i lokalizacji^10,11. Biorąc pod uwagę znaczące różnice w gojeniu się skóry właściwej jamy ustnej myszy i skóry właściwej oraz wcześniejszej embrionalnej (E15) i późniejszej embrionalnej (E18) skóry właściwej, prawdopodobne jest, że istnieją wewnętrzne różnice w populacjach fibroblastów w określonym wieku rozwojowym i między różnymi miejscami anatomicznymi.

W 1986 roku Harold F. Dvorak stwierdził, że nowotwory to rany, które się nie^goją. Dvorak doszedł do wniosku, że guzy zachowują się jak rany w ciele i indukują ich zrąb poprzez aktywację reakcji gospodarza na gojenie się ran. Od tego czasu w licznych badaniach analizowano udział fibroblastów w progresji nowotworów^13-15, ale podobnie jak w przypadku gojenia się ran, tożsamość i pochodzenie embrionalne fibroblastów, które przyczyniają się do powstawania przedziału zrębowego raków skóry, nie zostało odpowiednio określone. Odpowiedź na to pytanie ma znaczenie medyczne, biorąc pod uwagę ostatnie badania, które wykazały, że fibroblasty związane z nowotworem są potencjalnie skutecznym celem terapii przeciwnowotworowej¹⁶.

Identyfikacja i prospektywne wyizolowanie linii fibroblastów obdarzonych potencjałem fibrogennym in vivo jest niezbędnym krokiem w kierunku skutecznego manipulowania ich reakcją na uraz w szerokim zakresie ostrych i przewlekłych stanów chorobowych. W 1987 roku Cormack wykazał dwie subpopulacje fibroblastów, jedną znajdującą się w brodawkowatej, a drugą w siatkowatej skórze właściwej^17,18. Stwierdzono, że trzecia subpopulacja jest związana z mieszkami włosowymi w obszarze brodawki skórnej mieszka włosowego^19,20. Podczas hodowli te podtypy fibroblastów wykazują różnice w potencjale wzrostu, morfologii i profilach czynników wzrostu/cytokin^21-24.

Do tej pory, badania badające heterogeniczność fibroblastów w dużej mierze nie zdołały odpowiednio scharakteryzować rozwojowej i funkcjonalnej różnorodności wśród fibroblastów in vivo. Jest to częściowo wynikiem polegania na hodowanych populacjach fibroblastów i homogenizującym efekcie hodowli komórkowej lub selekcji pozytywnej na podstawie receptora na własnej powierzchni, który nie ulega ekspresji we wszystkich fibroblastach²⁵. Niedawne badanie przeprowadzone w naszym laboratorium wykazało głęboki marker powierzchniowy i przesunięcie transkrypcji w hodowanych i niehodowanych fibroblastach izolowanych za pomocą metodologii izolacji opartej na FACS przedstawionej w tym manuskrypcie²⁶.

Następnie zidentyfikowaliśmy specyficzną linię fibroblastów w obrębie mysiej grzbietowej skóry właściwej i ustaliliśmy, że ta linia, zdefiniowana przez embrionalną ekspresję Engrailed-1, jest przede wszystkim odpowiedzialna za odkładanie się tkanki łącznej w skórze grzbietowej. Linia funkcjonuje zarówno podczas ostrych, jak i przewlekłych form zwłóknienia, w tym gojenia się ran, tworzenia zrębu nowotworowego i zwłóknienia wywołanego promieniowaniem²⁷. Charakterystyka odrębnych linii fibroblastów ma kluczowe implikacje dla terapii mających na celu modulowanie zachowań fibrogennych.

Zamiast korzystać z istniejących protokołów, które opierają się na manipulacji in vitro w celu osiągnięcia izolacji komórek^28,29, protokół zbioru (Rysunek 1) opisany tutaj pomoże uzyskać pouczające analizy fibroblastów, które dokładniej ujmują fenotyp i zachowanie in vivo.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z metodami zatwierdzonymi przez Panel Administracyjny Uniwersytetu Stanforda ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.

1. Trawienie mysiej skóry właściwej

1. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy 100 mg/kg + ksylazyny 20 mg/kg + acepromazyny 3 mg/kg.
   Uwaga: Można używać różnych grup wiekowych i środowisk.
2. Ogol i wypiluj skórę grzbietową. Około 100 000 komórek można wyizolować z kawałka skóry grzbietowej o wymiarach 60 mm x 100 mm.
3. Zanurz mysz w 70% etanolu i umieść na czystej, sterylnej powierzchni do wyschnięcia.
4. Natychmiast zbierz grzbietową skórę myszy za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. U samic myszy należy unikać włączania tkanki sutkowej.
5. Zaczynając od podstawy ogona, użyj kleszczy, aby zwinąć skórę i wykonać poprzeczne cięcie przed rozcięciem wzdłuż płaszczyzny nado-powięziowej.
6. Ostrożnie unikaj dodawania tłuszczu podskórnego podczas pobierania skóry. Zbadaj zebraną skórę pod kątem podskórnego tłuszczu i ostrożnie zeskrob ją krawędzią skalpela.
7. Pobraną skórę opłukać w betadynie, a następnie przemyć 5 razy PBS na lodzie.
   Uwaga: Ważne jest, aby skóra była jak najbardziej sterylna, aby uniknąć zanieczyszczenia.
8. Zmielić skórę za pomocą żyletek i nożyczek do preparowania w sterylnym naczyniu, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy 2-3 mm.
9. Przygotować 50 ml stożkowych probówek zawierających 20 ml kolagenazy dożylnej o stężeniu 1 mg/ml w DMEM. Podziel skórę właściwą na probówki na podstawie pięciu myszy w probówce.
10. Próbki należy energicznie mieszać podczas inkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w łaźni wodnej lub w piecu.
11. Wyjąć próbki z inkubatora i przepuścić przez strzykawkę o pojemności 10 ml bez igły 3-5 razy w sterylnym kapturze.
12. Umieścić próbki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i energicznie wstrząsać przez kolejne 30 minut.
13. W sterylnym kapturze pipetować próbki w górę i w dół 3-5 razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pobrać pipetę próbki przez filtr 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
14. Przepuść 20 ml 10% FBS DMEM przez ten sam filtr, aby zmaksymalizować wydajność komórek i doprowadzić całkowitą objętość do 40 ml. Wirować przy 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
15. Usunąć supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety, zwracając szczególną uwagę, aby najpierw usunąć górną warstwę tłuszczu przed pozostawieniem supernatantu.
    Uwaga: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zanieczyszczenia adipocytów.
16. Ponownie zawiesić granulki w 20 ml 10% FBS DMEM.
17. Przepuść zawiesinę komórki/DMEM przez filtr 70 μm.
18. Przepłukać filtr 10 ml 10% FBS DMEM i odwirować przefiltrowaną zawiesinę o sile 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
19. Usunąć sklarowany osad za pomocą sterylnej szklanej pipety, ponownie uważając, aby najpierw usunąć pozostałą warstwę tłuszczu.
20. W przypadku znacznego zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi (osad jest widocznie czerwony), należy ponownie zawiesić granulki w 20 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie należy przejść do kroku 24.
21. Dodać równą objętość (20 ml) buforu FACS (PBS, 10% FBS, 0,1% azydku sodu), następnie wymieszać i odłożyć na bok 5 ml podwielokrotności jako niebarwioną kontrolę. Pozostałą próbkę odwirować w temperaturze 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
22. Usunąć supernatant i umieścić osad na lodzie. Komórki mogą zostać zamrożone w tym momencie, jeśli czas FACS nie jest dostępny.

2. Izolacja fibroblastów przez FACS

1. Przygotuj 500 μl mieszanki do inkubacji przeciwciał linii produkcyjnej dla każdej osadki. W tym celu należy najpierw dodać 475 μl buforu FACS zawierającego DNazę (10 μg / ml) do probówki, a następnie dodać sprzężone z fluoroforem CD31 (1:100), CD45 (1:200), Tie2 (1:50), Ter-119 (1:200) i EpCAM (1:100) przeciwciała, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie dla każdego przeciwciała.
2. Ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 μl mieszanki do inkubacji przeciwciał linii prostej i inkubować tę zawiesinę na lodzie przez 20 minut.
3. Dodać 5 ml buforu FACS zawierającego DNazę (10 μg/ml) do próbki i delikatnie wymieszać. Wirować przy 300 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy 5 ml buforu FACS zawierającego DNazę (10 μg/ml) i odwirować w takich samych warunkach, jak w kroku 26.
5. Zawiesić osad w 500 μl buforze FACS zawierającym DNazę (10 μg/ml) i odłożyć 50 μl podwielokrotności jako kontrolę żywotności barwnika.
6. Do pozostałej próbki dodać wybrany barwnik żywotności w stężeniu wskazanym dla wybranego barwnika.
7. Wykonaj analizę FACS³¹ i sortowanie pod kątem ogniw Viability Dye-/CD31-/CD45-/Tie2-/Ter-119-/EpCAM- (patrz rysunek 2A). Sortuj bezpośrednio do bufora FACS.

Wyniki

Poprawność tej metody (Rycyna 1) została zweryfikowana na kilka sposobów, które można szczegółowo przeanalizować w naszej niedawnej publikacji²⁷. Obejmują one immunocytochemię posortowanych komórek oraz analizę transkrypcyjną pojedynczych komórek i analizę masową świeżo posortowanych komórek. Sortowanie fibroblastów bezpośrednio, zamiast polegania na hodowli, dokładniej oddaje ich fenotyp in vivo. Zastosowanie metody ubytkowej dla linii negatywnych (Rycina 2A) zamiast metody selekcji pozy...

Dyskusja

Protokół opisany w tym manuskrypcie oferuje sposób izolacji fibroblastów za pomocą sortowania opartego na FACS, w porównaniu z istniejącymi metodami, które albo selekcjonują subpopulację, albo wymagają czasu w hodowli komórkowej przed kolejnymi analizami. Czas potrzebny od pobrania skóry do sortowania fibroblastów wynosi około 6 godzin; Jednak liczba myszy wykorzystanych w zbiorach będzie miała wpływ na te szacunki.

Kilka punktów w protokole wymaga szczególnej uwagi. Pierwszym z nich jest ogra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze chirurgiczne	Kent Scientific INS650916
Mikronożyczki	Kent Scientific	INS600127
Povidone Jodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (krem do depilacji)	Church i Dwight Co.
Kolagenaza IV	Gibco	17104-019
Elastaza	Abcam ab95133
DMEM	Life Technologies	A14430-01
Surowica bydlęca	płodu Gibco	16000-044
Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)	Gibco	A10492-01
40 μ m filtry	Fisher Scientific	08-771-1
70 μ m filtry	Fisher Scientific	08-771-2
100 μ m filtry	Fisher Scientific	08-771-19
CD31	BioLegend	102421
CD45	BioLegend	103125
Tie2	BioLegend	124005
Ter-119	BioLegend	116233
EpCAM (CD326)	eBioscience	48-5791
DAPI	Invitrogen	D3571
jodek propidyny (barwnik żywotności PI)	BioLegend	421301

22600267058