Method Article

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

DOI:

10.3791/53447

⸱

March 1st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa ludzkiego serca może fundamentalnie wpłynąć na odkrycia terapeutyczne poprzez rozwój nowych systemów badań przesiewowych specyficznych dla gatunku, które replikują biowierność trójwymiarowego rodzimego ludzkiego mięśnia sercowego, jednocześnie umożliwiając kontrolowany poziom złożoności biologicznej i umożliwiając nieniszczące monitorowanie podłużne funkcji skurczu tkanek. Początkowo ludzkie zmodyfikowane tkanki serca (hECT) zostały stworzone przy użyciu całej populacji komórek uzyskanych z ukierunkowanego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które zwykle dawały mniej niż 50% kardiomiocytów. Jednak, aby stworzyć wiarygodne modele predykcyjne ludzkiego mięśnia sercowego i wyjaśnić mechanizmy interakcji heterokomórkowych, niezbędna jest dokładna kontrola składu biologicznego w zmodyfikowanych tkankach.

Aby rozwiązać ten problem, wykorzystujemy sortowanie żywych komórek dla markera powierzchni serca SIRPα i markera fibroblastów CD90, aby stworzyć tkanki zawierające odpowiednio stosunek 3:1 tych typów komórek, które są następnie mieszane ze sobą i dodawane do roztworu macierzy na bazie kolagenu. Powstałe w ten sposób hECT są w pełni zdefiniowane zarówno pod względem składu macierzy komórkowej, jak i zewnątrzkomórkowej.

Tutaj opisujemy konstrukcję zdefiniowanych hECT jako modelowego systemu do zrozumienia mechanizmów interakcji komórka-komórka w terapiach komórkowych, na przykładzie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego (hMSC), które są obecnie używane w badaniach klinicznych na ludziach. Zdefiniowany skład tkankowy jest niezbędny, aby zrozumieć, w jaki sposób hMSC mogą wchodzić w interakcje z endogennymi typami komórek serca w celu poprawy funkcji tkanek. Opisano również system bioreaktorów, który jednocześnie hoduje sześć hECT równolegle, co pozwala na bardziej efektywne wykorzystanie komórek po sortowaniu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa serca znacznie się rozwinęła w ostatnim dziesięcioleciu, a wiele grup publikuje wyniki w pełni funkcjonalnych, pokonanych tkanek wykonanych zarówno z mysich kardiomiocytów1-6, jak i, ostatnio, ludzkich miocytów serca pochodzących z komórek macierzystych7-12. Dziedzina inżynierii tkankowej serca opiera się na dwóch podstawowych i zasadniczo niezależnych celach: 1) opracowanie egzogennych przeszczepów, które można przeszczepić do niewydolnych serc w celu poprawy funkcji4-6; oraz 2) opracowanie modeli in vitro do badania fizjologii i chorób lub jako narzędzi przesiewowych do rozwoju terapeutycznego2,7.

Trójwymiarowa (3-D) hodowla komórek jest uważana za niezbędną do rozwoju narzędzi przesiewowych nowej generacji, ponieważ matryca 3D odzwierciedla bardziej naturalne mikrośrodowisko serca niż tradycyjna jednowarstwowa hodowla komórkowa 2D; w rzeczywistości niektóre aspekty biologii komórki są zasadniczo różne w kulturach 2-D vs. 3-D13,14. Dodatkowo, zmodyfikowane tkanki serca są zbudowane z całkowicie zdefiniowanych komponentów: macierzy zewnątrzkomórkowej i populacji komórek. W przypadku tradycyjnie modyfikowanych tkanek ludzkiego serca, podczas gdy skład macierzy zewnątrzkomórkowej (zwykle fibryna9 lub kolagen7,8,10) jest ściśle kontrolowany, skład komórek wejściowych jest mniej dobrze zdefiniowany, z całą mieszaniną komórek pochodzących z ukierunkowanego różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych (ESC7,9) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC10,12) dodawane do tkanek. W zależności od konkretnej linii komórkowej i skuteczności zastosowanego protokołu różnicowania, uzyskany odsetek kardiomiocytów może wynosić od mniej niż 25% do ponad 90%, określony fenotyp kardiomiocytów (tj. podobny do komorowego, przedsionkowego lub rozrusznika serca) może się również różnić, nawet frakcja niekardiomiocytów może być wysoce niejednorodna15,16 i zmieniać dojrzałość zróżnicowanych miocytów serca17.

Ostatnie prace inżynierii tkankowej serca próbowały kontrolować wejściową populację komórek, przy użyciu albo reportera sercowego ludzkiej embrionalnej komórki macierzystejlinii 8, albo markerów powierzchni komórki18 do izolacji składnika różnicowania miocytów sercowych. Chociaż początkowo tkanka złożona tylko z miocytów serca wydawałaby się idealna, w rzeczywistości tak nie jest; hECT złożone wyłącznie z miocytów serca nie ulegają zagęszczeniu w funkcjonalne tkanki, przy czym niektóre grupy stwierdzają stosunek miocytów serca do fibroblastów wynoszący 3:1 wytwarzających największą siłę skurczu8. Dzięki zastosowaniu różnych metod selekcji komórek, w tym markerów powierzchniowych do sortowania żywych komórek, możliwe jest tworzenie hECT ze zdefiniowanymi populacjami komórek. Chociaż markery komórek zrębu niesercowego są dostępne od pewnego czasu, takie jak domniemany marker fibroblastów CD9019,20, markery powierzchniowe miocytów serca są trudniejsze do zidentyfikowania. SIRPα był jednym z pierwszych markerów powierzchni serca zidentyfikowanych dla ludzkich miocytów serca18 i wykazano, że jest wysoce selektywny dla linii serca. Niedawno odkryliśmy, że podwójne sortowanie komórek SIRPα + i CD90 daje prawie czyste kardiomiocyty, przy czym populacja CD90 + wykazuje fenotyp podobny do fibroblastów (Josowitz, niepublikowane obserwacje). Opierając się na tych zebranych wynikach, w niniejszym artykule opisano tworzenie hECT przy użyciu kombinacji 3:1 kardiomiocytów SIRPα+/CD90- i fibroblastów CD90+.

Zdolność do stworzenia całkowicie zdefiniowanej tkanki serca ludzkiego jest niezbędna nie tylko do tworzenia solidnych narzędzi przesiewowych, ale także do rozwijania systemów modelowych do badania pojawiających się terapii kardiologicznych opartych na komórkach i genach. W szczególności w badaniach klinicznych przetestowano liczne terapie komórkowe stosowane w leczeniu niewydolności serca, wykorzystujące typy komórek, w tym mezenchymalne komórki macierzyste (MSC)21, komórki macierzyste serca22 i komórki jednojądrzaste szpiku kostnego23-25. Podczas gdy wiele początkowych wyników było obiecujących21,23,25, początkowe korzyści często maleją z czasem26-29. Podobny trend zaobserwowano w mysich tkankach serca, które wykazują znaczące korzyści funkcjonalne dzięki suplementacji MSC, ale korzyść ta nie utrzymuje się podczas długotrwałej hodowli1. U podstaw nieoptymalnej wydajności leży nasza ograniczona wiedza na temat mechanizmów rządzących terapiami komórkowymi. Głębsze zrozumienie, w jaki sposób komórki terapeutyczne wywierają korzystny wpływ, a także potencjalne negatywne konsekwencje interakcji miocyty-niemiocyty, umożliwiłoby opracowanie ulepszonych terapii przynoszących klinicznie istotne i trwałe korzyści, przy minimalnych skutkach ubocznych, dla pacjentów z niewydolnością serca.

Tutaj opisujemy użycie zdefiniowanych hECT do badania mechanizmów terapii opartej na komórkach. Kontrolowany skład tkanek jest niezbędny do identyfikacji określonych czynników wpływających na wydajność kardiomiocytów. Bezpośrednie uzupełnienie hECT o terapeutyczny typ komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. MSCs) może ujawnić wpływ na wydajność miocytów serca, jak wykazaliśmy w przypadku ECTu szczurów 1.

Następujący wieloetapowy protokół rozpoczyna się od ukierunkowanego różnicowania komórek macierzystych serca, następnie produkcji wielotkankowego bioreaktora, a kończy na opisie budowy tkanki i analizie funkcjonalnej. Nasze eksperymenty są przeprowadzane przy użyciu zatwierdzonej przez NIH linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H7 (hESC). Jednak poniższe protokoły zostały również przetestowane przy użyciu dodatkowej linii hESC i trzech linii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) z podobnymi wynikami. Odkryliśmy, że skuteczność różnicowania kardiomiocytów i sukces w wytwarzaniu hECT może być zależny od linii komórkowej, szczególnie w przypadku linii hiPSC pochodzących od indywidualnych pacjentów. Postępując zgodnie z tym protokołem, dwie 6-dołkowe szalki są platerowane łącznie 1,68 miliona hESC (140 000 komórek na dołek), co daje około 2,5 miliona miocytów po różnicowaniu przez 20 dni i sortowaniu, co wystarcza do wytworzenia sześciu zdefiniowanych tkanek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Wykonuj wszystkie manipulacje komórkami w warunkach aseptycznych, korzystając z filtrowanej przez HEPA komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II i sterylizuj wszystkie roztwory, filtrując je przez filtr 0,2 μm. Przeprowadzić badania budowy i działania tkanek w tych samych warunkach aseptycznych lub w kapturze z przepływem laminarnym.

1. Wysiewanie hESC H7 w ramach przygotowań do różnicowania serca

  1. (Dzień 1) Przygotowanie matrycy błony podstawnej
    1. Rozmrozić 150 μl podwielokrotności matrycy błony podstawnej zakwalifikowanej do hESC na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. (Dzień 0-4) Posiew komórek macierzystych na płytkach powlekanych
    1. Rozcieńczyć rozmrożoną matrycę w 12 ml lodowatego DMEM/F12 i dobrze wymieszać.
    2. Przenieść 1 ml roztworu DMEM/F12-matrix do każdej studzienki naczynia poddanego 6-dołkowej hodowli tkankowej. Każda podwielokrotność matrycy może pokryć dwie płytki 6-dołkowe.
    3. Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godz.
      Uwaga: Z naszego doświadczenia wynika, że naczynia powlekane uszczelnione parafiną można przechowywać w roztworze matrycowym w temperaturze 4 °C do 10 dni przed użyciem.
    4. Przy około 75% zbiegu należy oddzielić hESC H7 od 10-centymetrowej szalki za pomocą 6 ml nieenzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego. Po 5 minutach delikatnie zeskrobać komórki z powierzchni hodowli za pomocą jednorazowego skrobaka do komórek i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    5. Usunąć 0,5 ml roztworu dysocjacyjnego z komórkami z probówki o pojemności 15 ml i przenieść do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml (pozostawiając 5,5 ml odczynnika dysocjacyjnego w celu dalszej dysocjacji hESC) w celu namnażania linii komórek macierzystych.
    6. Osad 0,5 ml komórek o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić ponownie w 8 ml pluripotencjalnego podłoża z komórek macierzystych zawierających 1% penicyliny-streptomycyny, a następnie przenieść do nowego, pokrytego 10 cm naczynia do hodowli tkankowej i utrzymywać temperaturę 37 °C i 5% CO2 w celu utrzymania linii komórek macierzystych.
      Uwaga: Utrzymuj pluripotencjalne podłoża z komórek macierzystych na lodzie podczas zmiany pożywki.
    7. W międzyczasie dodać 5,5 μl 10 mM inhibitora ROCK Y-27632 do pozostałych 5,5 ml roztworu dysocjacyjnego i kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez kolejne 5-10 minut. Delikatnie wymieszać komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Kontynuować inkubację aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie osadzać komórki w granulkach 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Zawiesić komórki w 5 ml pluripotencjalnej pożywki z komórek macierzystych i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
    9. Wysiew każdą studzienkę z 6-dołkowej płytki o gęstości 140 000 komórek na dołek. Wysiewaj dwie 6-dołkowe płytki, aby utworzyć w sumie sześć zdefiniowanych tkanek. Usuń wszelkie pozostałe komórki po posianiu.
    10. Napełnić studzienkę do objętości 1 ml pluripotencjalną pożywką z komórek macierzystych i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Dwadzieścia cztery godziny później usuń pożywkę i dodaj 2 ml świeżej pożywki z pluripotencjalnych komórek macierzystych do każdego dołka (ryc. 1A).
    11. Sprawdzaj konfluencję płytek każdego dnia i rozpocznij różnicowanie, gdy komórki osiągną około 75% zbiegu (ryc. 1B-D).

2. (Dzień 4-24) Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów30,31

  1. (Dzień 4-7, Różnicowanie Dzień 0-3) Indukcja mezodermy
    1. Przygotować pożywkę różnicującą RPMI I (Tabela 1), łącząc 500 ml RPMI 1640 z 10 ml suplementu B27 (bez insuliny) i 5 ml roztworu podstawowego penicyliny-streptomycyny (10 000 j.m./ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny). Podwielokrotność, na lodzie, do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. (Dzień 4, Różnicowanie Dzień 0) Przygotować pożywkę indukcyjną mezodermy, dodając 2,4 μl małocząsteczkowego inhibitora GSK3 CHIR99021 (10 mM zapas, 6 μM stężenie końcowe) do 12 ml pożywki różnicującej RPMI I. Usunąć pluripotencjalne pożywki z komórek macierzystych z każdej studzienki i zastąpić 2 ml pożywki indukcyjnej mezodermy na studzienkę. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
      Uwaga: Znaczna śmierć komórki zwykle następuje po dodaniu CHIR99021 (ryc. 1E). Monowarstwa zregeneruje się, ale ważne jest, aby wypłukać martwe komórki za pomocą płukania DMEM/F12.
    3. (Dzień 5, Różnicowanie Dzień 1) Przygotuj świeżą pożywkę do indukcji mezodermy, jak opisano powyżej. Usuń stare podłoże z każdej studzienki i spłucz raz 1 ml DMEM/F12 na studzienkę. Dodać 2 ml świeżej pożywki indukcyjnej mezodermy do każdego dołka.
      Uwaga: Płukanie każdego dnia od 0 do 10 dnia znacznie zwiększa wydajność i czystość miocytów serca.
    4. (Dzień 6, Różnicowanie Dzień 2) Usunąć pożywkę indukcyjną serca i spłukać raz 1 ml DMEM/F12 na studzienkę. Zastąp płukanie 2 ml pożywki różnicującej RPMI I (bez dodatku małych cząsteczek, ale nadal z suplementem B27 (bez insuliny)) i wróć do inkubatora.
  2. (Dzień 7-13, Różnicowanie Dzień 3-10) Indukcja mezodermy serca
    1. (Dzień 7, Różnicowanie Dzień 3) Przygotować pożywkę do indukcji mezodermy serca, dodając 6 μl małocząsteczkowego inhibitora Wnt IWR-1 (10 mM zapas, 5 μM końcowy) do 12 ml pożywki różnicującej RPMI I.
    2. Usunąć pożywkę z każdej studzienki, przepłukać raz 1 ml DMEM/F12 na studzienkę i zastąpić 2 ml pożywki do indukcji mezodermy serca na studzienkę.
    3. (Dzień 8, Różnicowanie Dzień 4) Przygotować dodatkowe 12 ml pożywki do indukcji mezodermy serca, jak opisano powyżej. Usunąć pożywkę dodaną dzień wcześniej, spłukać raz 1 ml DMEM/F12 na studzienkę i zastąpić 2 ml świeżej pożywki do różnicowania mezodermy serca na dołek i powrócić do inkubatora.
    4. (Dzień 9-10, Różnicowanie Dzień 5-6) W oba dni należy usunąć pożywkę indukcyjną mezodermy serca i przepłukać każdą studzienkę 1 ml DMEM/F12.
    5. Dodać 2 ml świeżej pożywki różnicującej RPMI I (bez dodawania małych cząsteczek, ale nadal z suplementem B27 (bez insuliny)) do każdego dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
  3. (Dzień 11-24, Różnicowanie Dzień 7-20) Organizacja/dojrzewanie miocytów serca pochodzących z hES
    1. Przygotować pożywkę różnicującą RPMI II (Tabela 1), łącząc 500 ml RPMI 1640 z 10 ml suplementu B27 (z insuliną) i 5 ml roztworu podstawowego penicyliny i streptomycyny. Podwielokrotność, na lodzie, do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. (Dzień 11, Dzień Różnicowania 7) Usuń pożywkę różnicującą RPMI (bez insuliny) z każdej studzienki i spłucz 1 ml DMEM/F12. Zastąp 2 ml nowej pożywki różnicującej RPMI II (z insuliną) do każdej studzienki i wróć do inkubatora.
      Uwaga: Spontaniczne bicie należy najpierw zaobserwować między 7 a 10 dniem. Jeśli w tym czasie nie obserwuje się bicia, zazwyczaj wskazuje to na słabą skuteczność różnicowania. Protokół może być kontynuowany do 15 dnia w celu zaobserwowania bicia, ale jeśli do 15 dnia nie zostanie zaobserwowane żadne pobicie, najlepiej jest rozpocząć nowe różnicowanie.
    3. (Dzień 12-24, Dzień Różnicowania 8-20) Każdego dnia usuwaj stare podłoża różnicujące i zastąp je 2 ml świeżej pożywki różnicującej RPMI II na dołek, aby umożliwić dojrzewanie komórek i organizację bijącej monowarstwy (Rysunek 1F, Rysunek wideo 1).
      Uwaga: W zależności od resztkowej śmierci komórek może być konieczne przepłukanie 1 ml DMEM/F12 do 10 dnia różnicowania.

3. (Dzień 24, Dzień Różnicowania 20) Izolacja miocytów serca i komórek podobnych do fibroblastów

  1. Oddziel komórki od monowarstwy
    1. Usunąć pożywkę różnicującą i przepłukać raz 1 ml PBS.
    2. Odciąć monowarstwy za pomocą 1 ml enzymatycznego roztworu dysocjacyjnego (0,04% trypsyny/0,03% EDTA) do każdej studzienki.
    3. Przenieść płytkę do inkubatora na 10 minut. W międzyczasie dodać 12 μl inhibitora ROCK do 6 ml roztworu neutralizującego trypsynę.
    4. Delikatnie dodaj 1 ml roztworu neutralizującego trypsynę zawierającego inhibitor ROCK do każdego dołka płytki, aby zneutralizować roztwór trypsyny.
    5. Używając sterylnej pipety transferowej, delikatnie wymieszaj każdą studzienkę, aby rozdzielić skupiska komórek.
    6. Przenieść całe 12 ml z płytki 6-dołkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      Uwaga: Ponieważ w tym protokole używane są dwie płytki 6-dołkowe, potrzebne będą dwie probówki o pojemności 15 ml.
    7. Przenieść 3 ml PBS do jednego dołka płytki, a następnie kolejno przenieść te same 3 ml do każdego kolejnego dołka, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki na szalce. Pozostałe 3 ml z ostatniej studzienki przenieść do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej komórki.
    8. Osad w ilości 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie komórek do sortowania żywych komórek za pomocą FACS
    1. Przygotować bufor barwiący, dodając 5 ml płodowej surowicy bydlęcej do 45 ml PBS na lodzie z 50 μl inhibitora ROCK.
    2. Usunąć supernatant z osadu komórkowego (w ppkt 3.1.8) i ponownie zawiesić w 1,2 ml buforu barwiącego.
    3. Przenieść 200 μl zawiesiny komórek do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie. Będzie to negatywna kontrola barwienia.
    4. Przenieść pozostały 1 ml zawiesiny komórkowej do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i dodać 2 μl SIRPα-PE/Cy7 (rozcieńczenie 1:500) i 4 μl CD90-FITC (rozcieńczenie 1:250). Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety transferowej i powrócić do lodu.
    5. Inkubować zarówno kontrolę ujemną, jak i próbkę, na wytrząsarce kołyskowej, na lodzie, w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    6. Przygotować probówki do pobierania próbek, dodając 3 ml pożywki RPMI (z insuliną) do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Dodać 3 μl inhibitora ROCK do każdej probówki i przechowywać na lodzie.
    7. Zabarwione komórki osadzać w sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i dwukrotnie przepłukać co najmniej 10 ml lodowatego PBS na jedno płukanie.
    8. Dodać 1 μl DAPI (1 μg/ml) do 5 ml buforu barwiącego. Delikatnie zawiesić osad próbki z 1-3 ml buforu barwiącego zawierającego DAPI za pomocą pipety transferowej.
    9. Dodać 500 μl buforu barwiącego (bez dodatku DAPI) do kontroli ujemnej.
    10. Delikatnie przefiltrować zarówno kontrolę ujemną, jak i próbkę przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć grudki komórek i przenieść do probówek polistyrenowych FACS na lodzie. Natychmiast przynieś próbki do sortownika komórek.
    11. Podobnie jak w przypadku ustalonych metod sortowania żywych komórek18, użyj kontroli ujemnej, aby ustawić bramki, wybierz żywe komórki (DAPI ujemne) i zbierz zarówno populacje FITC+ (tj. fibroblasty CD90+), jak i PE/Cy7+ (tj. kardiomiocyty SIRPα+) niezależnie przy 20 psi (Figura 2).
      Uwaga: Po ustawieniu bramek, kontrolę ujemną można utrwalić w 4% PFA, aby określić skuteczność różnicowania poprzez barwienie na obecność troponiny sercowej T.
      Uwaga: Niektórzy badacze wolą używać kontroli izotypu niż kontroli niebarwionej do ustawiania bramek w celu skompensowania niespecyficznego wiązania przeciwciał. Inną możliwością jest tak zwana kontrola fluorescencji minus jeden (FMO). Ze względu na wyraźny rozkład bimodalny sygnałów FITC, DAPI i PE-Cy7, bramkowaliśmy z populacji pozytywnej, konserwatywnie celując daleko w bramkę dodatnią, co prawdopodobnie wyklucza niektóre prawdziwie dodatnie, ale pomaga zminimalizować wszelkie fałszywie dodatnie wyniki.
  3. Reagregacja komórek w ramach przygotowań do inżynierii tkankowej
    1. Po posortowaniu komórek należy zatopić obie probówki i ponownie zawiesić w 1 ml DMEM zawierającym 10% surowicy bydlęcej noworodków, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,2% amfoterycyny B ("pożywka NBS").
    2. Rekombinacja komórek SIRPα+ i CD90+ w stosunku 3:1 i umieszczenie połączonych komórek na szalce Petriego poddanej działaniu kultury nietkankowej o gęstości 2 milionów komórek na 60 cm2 (szalka 10 cm). Dodać 10 ml pożywki NBS i 10 μl inhibitora ROCK Y-27632.
    3. Zawiesinę komórkową należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych na 48 godzin, aby umożliwić ponowną agregację komórek w małe skupiska.

4. Inżynieria tkanek ludzkiego serca

  1. Wyprodukuj bioreaktor wielotkankowy
    Uwaga: W celu uzupełnienia ilustracji na rysunku 3A, pliki CAD ze szczegółowymi schematami projektów bioreaktorów są dostępne na życzenie autorów.
    1. Formę wzorcową PDMS należy obrabiać, wiercąc sześć równomiernie rozmieszczonych otworów o średnicy 0,5 mm w prostopadłościanie z politetrafluoroetylenu o wymiarach 9 x 33 x 3,25 mm.
    2. Za pomocą frezu palcowego obrabiać ramę z polisulfonu o wymiarach 25 x 35 x 11 mm3. Zadaniem ramy jest utrzymanie słupków PDMS (zbudowanych z odlewu wykonanego powyżej) w jednej linii z dołkami w płycie podstawy.
    3. Za pomocą frezu walcowo-czołowego 1 mm obrabiać 6 dołków (6 x 1 x 1 mm3), w odstępach 4 mm na kawałek czarnego politetrafluoroetylenu o wymiarach 20 x 40 x 5 mm, aby utworzyć płytę podstawy.
    4. Wymieszać bazę elastomerową i utwardzacz polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku 10:1 w/w i dodać do niestandardowej formy z politetrafluoroetylenu (krok 4.1.1), aby utworzyć dwa rzędy po sześć słupków wykrywających siłę, a następnie inkubować przez noc w próżni w temperaturze 80 °C. Po utwardzeniu delikatnie wyjmij PDMS z formy głównej i ostrożnie oznacz wierzchołki każdego słupka czarnym trwałym markerem, aby zwiększyć kontrast i automatyczne śledzenie ugięcia słupka w czasie rzeczywistym.
      Uwaga: Politetrafluoretylen jest dość miękki i można go łatwo uszkodzić. Zachowaj ostrożność podczas czyszczenia formy głównej przed odlewaniem PDMS, aby zapewnić długowieczność systemu i stałą geometrię słupka PDMS. Do czyszczenia otworów na słupki po każdym użyciu można użyć drutu 0,5 mm, ale należy uważać, aby nie zeskrobać wnętrza otworów.
      Uwaga: Alternatywą jest odgazowanie PDMS w próżni przez kilka godzin w temperaturze pokojowej, a następnie pozostawienie mieszaniny do utwardzenia pod ciśnieniem otoczenia. Może to prowadzić do mniejszej ilości pęcherzyków gazu resztkowego tworzących się w PDMS podczas procesu utwardzania.
    5. Wysterylizuj wszystkie elementy w autoklawie parowym.
      Uwaga: Forma główna PDMS (krok 4.1.1) i rama polisulfonowa (krok 4.1.2) są wielokrotnego użytku. Posty PDMS utworzone z odlewu (krok 4.1.4) są również wielokrotnego użytku, ale tylko do około 10 zastosowań. Jednak w razie potrzeby można utworzyć więcej słupków PDMS za pomocą formy głównej.
  2. Zbierz ponownie zagregowane komórki serca
    1. Wyjąć ponownie zagregowane komórki z inkubatora i przenieść wszystkie 10 ml pożywki do reagregacji do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Przepłukać płytkę 3 ml PBS i przenieść płukanie do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, która zawiera pożywkę do reagregacji.
    3. Dodać 3 ml 0,04% trypsyny/0,03% EDTA do 10 cm naczynia i wrócić do inkubatora na 5 minut.
    4. Po 5 minutach zbadaj płytkę za pomocą odwróconego mikroskopu złożonego przy 10-krotnym powiększeniu, aby zapewnić całkowitą dysocjację komórek z naczynia. Jeśli niektóre resztki skupisk są nadal przyczepione, delikatnie porusz płytką, aby oderwać grudki. Jeśli klastry pozostaną połączone, wróć do inkubatora na kolejne 2-3 minuty. Nie inkubuj dłużej niż dziesięć minut, ponieważ może to spowodować znaczną śmierć komórki.
    5. Po odłączeniu wszystkich komórek dodaj 3 ml roztworu neutralizującego trypsynę. Delikatnie wymieszać roztwór neutralizacyjny z roztworem trypsyny komórkowej i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę do reagregacji i raz przepłukać PBS.
    6. Przepłukać całe naczynie 5 ml PBS i przenieść do tej samej probówki o pojemności 50 ml zawierającej komórki.
    7. Granulować komórki w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki NBS, a następnie przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    9. Osad o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Komórki serca (komórki zrębu CD90+ i miocyty SIRPα+) są teraz gotowe do budowy tkanek.
  3. (Opcjonalnie) Zbierz dodatkowe komórki zainteresowania
    Uwaga: Oprócz zdefiniowanych tkanek zawierających tylko kardiomiocyty SIRPα+ i komórki fibroblastopodobne CD90+, możliwe jest dodanie dodatkowych komórek będących przedmiotem zainteresowania w celu zbadania ich wpływu na funkcję tkanki. Na przykład wykazano, że MSC szczurów poprawiają funkcję tkanek serca modyfikowanych przez szczury1. Poniższy opcjonalny krok opisuje kolekcję dodatkowych komórek dla zdefiniowanego systemu.
    1. Zbierz dodatkowy typ komórek (np. mezenchymalne komórki macierzyste) za pomocą 0,25% trypsyny/0,1% EDTA.
    2. Osadzać komórki w granulkach o gramaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml pożywki do hodowli komórkowej odpowiedniej dla danego typu komórki. Na przykład w przypadku MSCs należy użyć DMEM uzupełnionego 20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,2% amfoterycyny-B do hodowli komórek.
    3. Przeprowadzić liczenie komórek za pomocą hemocytometru, a następnie ponownie zagnieździć komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć supernatant, zawiesić ponownie w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    5. Granulować komórki w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć supernatant. Komórki uzupełniające są teraz gotowe do budowy tkanki.
      Uwaga: jeśli komórki uzupełniające zostaną dodane w stężeniu 10% całkowitej liczby komórek w tkance, to dla zdefiniowanych tkanek będzie to wymagało 50 000 dodatkowych komórek na tkankę, ponieważ każda tkanka zawiera 500 000 komórek serca (zarówno komórki zrębu CD90+, jak i miocyty SIRPα+).
  4. Stwórz ludzkie zmodyfikowane tkanki serca
    Uwaga: Wszystkie roztwory należy przechowywać na lodzie i komórkach w temperaturze pokojowej. Wszystkie podane poniżej objętości dotyczą każdej tkanki. Zazwyczaj około sześciu tkanek można zbudować z dwóch 6-dołkowych płytek różnicowania serca.
    1. Rozcieńczyć 60,0 μl kolagenu 5 mg/ml do 3,125 mg/ml z 1,5 μl 1 M NaOH, 9,6 μl 10x PBS i 24,9 μl sterylnej ultraczystej wody dejonizowanej.
      Krytyczny krok: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do każdego roztworu podczas przygotowania, ponieważ pęcherzyki powietrza zakłócą prawidłowe tworzenie tkanek.
    2. Dodaj 12,0 μl zarówno 10x MEM, jak i 0,2 N HEPES pH 9 do rozcieńczonej mieszaniny kolagenu, aby utworzyć mieszankę kolagenu. Dodaj oba roztwory po boku probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do mieszanki kolagenowej.
    3. Dodaj matrycę błony podstawnej do końcowego stężenia 0,9 mg/ml do mieszanki kolagenu i przechowuj na lodzie, aby utworzyć końcową mieszankę tkankową. Końcowe stężenie kolagenu powinno wynosić 2 mg/ml.
    4. Dodać 500 000 zreagregowanych komórek do mieszanki tkankowej (stężenie miocytów + fibroblastów wynosi 20 milionów/ml) i wypełnić do końcowej objętości 25 μl na tkankę bezkomórkowymi pożywkami NBS lub 50 000 komórek uzupełniającego typu komórek (np. hMSC) i dobrze wymieszać, aby utworzyć równomierną zawiesinę komórek.
      Uwaga: Liczba uzupełnionych komórek będzie się różnić w zależności od zastosowania. Tutaj stosuje się 10% suplementację.
    5. Ostrożnie odpipetować 25 μl zawiesiny komórek do każdej z sześciu studzienek w płycie podstawy bioreaktora, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do studzienki.
    6. Wepchnij dwa rzędy czujników siły PDMS po obu stronach ramy polisulfonowej, tworząc 6 par przeciwległych słupków, a następnie odwróć ramkę na górze płyty podstawy, tak aby jedna para słupków weszła do każdej studzienki zawierającej zawieszenie ogniwa.
      Uwaga: Ramka polisulfonowa zawiera wypustki pomagające w wyrównaniu PDMS.
    7. Ostrożnie umieść bioreaktor płytką podstawy w naczyniu o średnicy 60 mm, a następnie umieść naczynie bez pokrywy w naczyniu o średnicy 10 cm, umieść 10-centymetrową pokrywę na górze i przenieś cały zespół bioreaktora do inkubatora do hodowli tkankowych, czekając dwie godziny, aż tkanka się zżeluje.
    8. Po 2 godzinach wyjmij bioreaktor z inkubatora i dodaj 14 ml pożywki NBS do całego zestawu, tyle tyle, aby pokryć płytkę podstawy. Wróć do inkubatora i codziennie zmieniaj połowę pożywki.
    9. Czterdzieści osiem godzin później ostrożnie zdejmij płytkę podstawową, delikatnie odsuwając każdą stronę płytki bazowej od ramy o kilka milimetrów na raz, zmień pożywkę, a następnie włóż bioreaktor z tkankami skierowanymi w dół do podłoża.
    10. Kontynuuj codzienną wymianę połowy pożywek hodowlanych NBS.
      Uwaga: Spontaniczne skurcze tkanki można zaobserwować już po 3 dniach od budowy tkanki, generując mierzalne siły skurczowe już w 5 do 7 dniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać miocyty serca, stosuje się nieco zmodyfikowaną wersję metod różnicowania Bohelera i Liana30,31. Konieczne jest, aby różnicowanie rozpoczęło się w fazie logarytmicznej wzrostu komórki, ale także, aby populacja wyjściowa była wystarczająco zlewna, aby uzyskać użyteczną liczbę komórek po sortowaniu (około 75% jest optymalne). Zazwyczaj w przypadku hESC H7 posiewanie z gęstością 140 000 hESC na studzienkę 6-dołkowej płytki w inkubatorze z 8 pożywkami zasadniczymi i 5% CO2 utrzymywanym w temp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa zdefiniowanych ludzkich zmodyfikowanych tkanek serca (hECT) może zapewnić bardziej spójny i wiarygodny model funkcji ludzkich miocytów sercowych. Co najważniejsze, wszystkie komponenty komórkowe i zewnątrzkomórkowe w systemie są znane i można nimi manipulować zgodnie z potrzebami, usuwając w ten sposób zakłócający wpływ innych nieznanych typów komórek wynikający z procesu różnicowania. Aby zrównoważyć szybki wzrost komórek i wysoką wydajność, zaleca się, aby różnicowanie rozpoczynało się przy 75% konfluencji hESC,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH (1F30HL118923-01A1) do T.J.C., NIH/NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C do K.D.C., research grant council of Hong Kong TRS T13-706/11(K.D.C), NIH (R01 HL113499) do B.D.G., American Heart Association (12PRE12060254) do R.J. oraz Research Grant Council of HKSAR (TBRS, T13-706/11) do R.L. Dodatkowe fundusze zostały zapewnione T.J.C. przez NIH DRB 5T32GM008553-18 oraz jako staż na NIDCR-Interdisciplinary Szkolenie z zakresu biologii systemowej i rozwojowej oraz wad wrodzonych T32HD075735. Autorzy pragną również podziękować Arthurowi Autzowi z The Zahn Center of The City College of New York za pomoc w obróbce bioreaktora oraz Mamdouhowi Eldaly'emu za pomoc techniczną. Dziękujemy również dr Kennethowi Bohelerowi za porady dotyczące różnicowania serca oraz dr Joshua Hare za hojne dostarczenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell CultureFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Przygotuj zapas 2,5 mg/ml w DMSO i sterylizuj filtrem
B27 za pomocą InsulinLife Technologies17505055
B27 bez insulinyLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μ M zapasów, a następnie podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20  °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Ludzkie embrionalne komórki macierzysteWiCellWA07
Matryca kwalifikowana do hESC, Corning MatrigelCorning354277Rozmrażanie na lodzie w temperaturze 4 & stopni; C przez noc, a następnie podwielokrotność 150 μ l do oddzielnych tub i przechowywać w temperaturze -20  °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Utwórz 10 mM kolby i podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Technologie życiasurowicy cielęcej noworodków16010159
Odczynnik dysocjacji nieenzymatycznej: Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekTechnologie komórek macierzystych7174
Penicylina-StreptomycynaCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Przechowywać w lodówce
Y-27632 (inhibitor ROCK)Stemgent04-0012Zawiesić do stężenia zapasów 10 mM, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20  °C. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.
Cell Sorting<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Odczynnik do dysocjacji enzymatycznej: Cell Detach Kit I (0,04% trypsyny / 0,03% EDTA, roztwór neutralizujący trypsynę i buforowany roztwór soli Hanksa) PromoCellC-41200
Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyNumer katalogowyUwagi
0,25% Trypsyna/0,1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOpcjonalnie: Do pobierania dodatkowych komórek zainteresowania
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x Pakiety PBSSigma-AldrichP3813
Kolagen, bydło typu ILife TechnologiesA10644-01Trzymaj na lodzie
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagles (DMEM), wysoka glukozaSigma-AldrichD5648
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodowy HEPESSigma-AldrichH3784
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich221465
MateriałyFirmaNumer katalogowyUwagi
1,5 ml probówki do mikrowirówekFisher Scientific NC0536757
15 ml polipropylenowa probówkaCorning352096
5 ml Polistyrenowa rurka okrągłodennaCorning352235Ze zintegrowanym 35 μ M Sitko komórkowe
50 ml polipropylenowa probówka wirówkowaCorning352070
6-dołkowa płaska płytka do hodowli tkankowych z płaskim dnemSkrobak do komórek Corning353046
, jednorazowyBiologix70-2180
PolisulfonMcMaster-Carr
Politetrafluoroetylen (teflon)McMaster-Carr
Equipment<strong>Firma>Numer katalogowyKomentarze
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZ-61Lub podobny, musi mieć uchwyt do szybkiej kamery do mocowania
Elektryczny system stymulacjiAstro-Med, IncStymulator
o dużej prędkości KameraPixelinkPL-B741ULub podobna, ale musi być zdolna do 100 klatek na sekundę w celu dokładnego pozyskiwania danych
KontrolaSłuży do utrzymywania temperatury nośnika podczas pozyskiwania danych.
Custom Materials<strong>CompanyNumer katalogowyKomentarze
LabView Programdostępny na życzenie od autorów
4 wirówkowa trawy S88X temperatury płyty Post-tracking

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397(2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147(2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293(2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742(2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Engineered Cardiac TissueLive Cell SortingSIRP Alpha MarkerCD90 Fibroblast MarkerCollagen Based MatrixBioreactor SystemMesenchymal Stem CellsContractile Force MeasurementTissue CompactionFACS Collection

Related Articles