Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

26.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

31 grudnia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Streszczenie

Wzór przerzutów raka jajnika znacznie różni się od większości innych guzów nabłonkowych, ponieważ rzadko rozprzestrzenia się hematogennie. Zamiast tego komórki raka jajnika złuszczone z guza pierwotnego są przenoszone przez płyn otrzewnowy do miejsc przerzutów w jamie otrzewnej. Miejsca te, w szczególności otrzewna brzuszna i sieć małżeński, są narządami pokrytymi powierzchnią wyłożoną międzybłonkiem. Aby zbadać procesy rozsiewu raka jajnika, zbudowaliśmy złożony trójwymiarowy system hodowli, który rekonstruuje wyściółkę jamy otrzewnej in vitro. Pierwotne ludzkie fibroblasty i komórki międzybłonka wyizolowano z ludzkiej sieci komórkowej. Fibroblasty zostały następnie zmieszane z macierzą zewnątrzkomórkową i pokryte warstwą pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka, aby naśladować powierzchnie otrzewnej i onerwowej napotykane przez przerzuty komórek raka jajnika. Uzyskany w ten sposób model organotypowy jest, jak pokazano, wykorzystywany do badania wczesnych etapów rozprzestrzeniania się raka jajnika, w tym adhezji, inwazji i proliferacji komórek rakowych. Model ten został wykorzystany w wielu badaniach mających na celu zbadanie roli mikrośrodowiska (komórkowego i bezkomórkowego) we wczesnym rozprzestrzenianiu się raka jajnika. Został również z powodzeniem zaadaptowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i wykorzystany do identyfikacji i testowania inhibitorów przerzutów raka jajnika.

Wprowadzenie

Rak jajnika jest najbardziej śmiertelnym nowotworem ginekologicznym1. Większość pacjentów rozpoznaje się po rozprzestrzenieniu się raka w całej jamie otrzewnej. Gdy rak rozprzestrzeni się w jamie otrzewnej, chirurgia cytoredukcyjna i chemioterapia często nie są wystarczającym leczeniem, aby zapobiec nawrotom raka i chemooporności, co skutkuje mniej niż 30% 5-letnim wskaźnikiem przeżycia. Przerzuty raka jajnika ograniczają się głównie do jamy otrzewnej, a kilka innych typów raka, w tym rak żołądka, trzustki i jelita grubego, daje przerzuty do tych samych miejsc anatomicznych w jamie otrzewnej. Ogólnie rzecz biorąc, komórki raka jajnika odłączają się od raka in situ w jajowodzie lub pierwotnym guzie jajnika, przemieszczają się w płynie otrzewnowym jako pojedyncze komórki lub sferoidy i przyczepiają się do wyściełanych międzybłonkiem powierzchni sieci oczu, jelita grubego i ściany brzucha2.

Mikrośrodowisko guza odgrywa ważną rolę w postępie choroby i chemooporności w wielu nowotworach3-6. Jama otrzewnej jest unikalnym mikrośrodowiskiem, w którym większość powierzchni pokrywa monowarstwa komórek międzybłonka (ryc. 1A)7. Wyściółka międzybłonka działa jak bariera, która tworzy powierzchnię o niskim współczynniku tarcia, która zwykle chroni przed adhezją komórek rakowych8. Bezpośrednio pod tą wyłożoną międzybłonkiem powierzchnią znajduje się warstwa zbudowana głównie z fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które sprzyjają adhezji i inwazji komórek rakowych8. Komórki raka jajnika wydzielają czynniki, które indukują zmiany w wyściółce komórek międzybłonka, które zwiększają adhezję, inwazję i przerzuty komórek raka jajnika9,10. Komórki raka jajnika przylegają do powierzchni międzybłonka poprzez mechanizmy za pośrednictwem integryny i CD44 (ryc. 1B)11-16.

Historycznie rzecz biorąc, opracowano kilka modeli 3D do badania interakcji raka jajnika z mikrośrodowiskiem. Niektóre z pierwszych modeli badały interfejs rak jajnika i ECM17-21, rak jajnika - komunikacja komórek międzybłonka13,14,21-24 lub oba25 (przegląd przez nas 26). Niedbala i wsp. odkryto, że komórki raka jajnika wykazują szybszą i mocniejszą adhezję do ECM niż do komórek międzybłonka lub do samego plastiku25. Jednak modele te nie przypominały histologicznie mikrośrodowiska otrzewnej. W związku z tym stworzyliśmy model organotypowy 3D, aby dokładniej odtworzyć mikrośrodowisko raka jajnika. Aby lepiej zrozumieć rolę mikrośrodowiska i interakcji między nowotworem a komórkami otrzewnej w rozsiewaniu się raka jajnika w otrzewnej, opracowaliśmy 3D organotypowy model hodowli in vitro wyściółki jamy otrzewnej (schemat na rycinie 1C). Proponowany model składa się z pierwotnych ludzkich fibroblastów i ECM, pokrytych warstwą pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka - każdy typ komórek jest izolowany z ludzkiej sieci komórkowej. Histologicznie model ten przypomina normalną wyściółkę otrzewnej lub onerwowej i zapewnia powierzchnię, na której możemy badać mikrośrodowisko guza, interakcję między komórkami rakowymi a normalną tkanką oraz procesy adhezji, inwazji i proliferacji komórek rakowych8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane protokoły badawcze zostały sprawdzone przez University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Przed zabiegiem uzyskano świadomą zgodę od każdego pacjenta, a badanie zostało zatwierdzone przez IRB Uniwersytetu w Chicago. Podczas pracy z tkankami ludzkimi należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego typu 2 i rękawic w celu ochrony i zmniejszenia ryzyka skażenia komórek.

1. Izolacja i hodowla pierwotnych nieprzekształconych komórek zrębu

  1. Pobieranie i przygotowanie tkanek ludzkich.
    1. Pobrać próbki ludzkiej sieci o długości 2 cm3 usuniętej podczas operacji jamy brzusznej i natychmiast zanurzyć tkankę w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami RT (PBS) (ryc. 2A). Kawałek sieci o wymiarach 3 cm x 2 cm zwykle daje 1 milion pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka (HPMC) i 200 000 pierwotnych ludzkich fibroblastów lub normalnych fibroblastów ocznych (NOF).
    2. Odwirować PBS, w którym zanurzono tkankę, w ilości 0,5 x g na 3 minuty, tak szybko jak to możliwe po pobraniu (< 2 godziny w PBS) i przenieść tkankę do świeżej 20 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Pokrój tkankę na3 kawałki o średnicy 5 mm, mieląc je skalpelami w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm (ryc. 2B).
  2. Pierwotna izolacja ludzkich komórek międzybłonka8
    1. Aby wyizolować HPMC, przenieś zmieloną tkankę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odczekaj 1 minutę, aż stałe kawałki wypłyną na wierzch (Rysunek 2C i D). HPMC i czerwone krwinki (RBC) będą obecne w cieczy na dnie. Za pomocą pipety usuń płyn z dna probówki i do nowej stożkowej probówki. Odwirować ciecz o masie 0,5 x g przez 3 minuty i odessać supernatant z osadu HPMC/RBC.
      1. Powtórz proces trzy razy: dodać 20 ml PBS do zmielonej tkanki, pozostawić tkankę do wyrośnięcia, usunąć płyn z dna za pomocą pipety i do probówki HPMC/RBC, odwirować i usunąć supernatant. Po zakończeniu wszystkich wirowań i odessaniu supernatantu, osad będzie zawierał HPMC i RBC.
    2. Umieścić wszystkie komórki z osadu w kolbie o średnicy 75cm2 w 15 ml pełnej pożywki wzrostowej (DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 1% witaminami MEM [93 mg/L], 1% aminokwasami endogennymi MEM [81,4 mg/L], 1% penicyliny streptomycyny [Pen-Strep, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny]).
    3. Wykonaj wtórne płukanie PBS w celu wyizolowania dodatkowych HPMC.
      1. W przypadku wtórnego płukania PBS należy wstrząsnąć pozostałą tkanką stałą z prędkością 200 obr./min, w temperaturze 37 °C przez 10 minut w 20 ml PBS, a następnie odczekać 1 minutę, aż chusteczka wypłynie na wierzch. Usunąć płyn z dna probówki do nowej probówki, odwirować przy 0,5 x g przez 3 minuty i odessać supernatant.
      2. Umieścić wszystkie HPMC/RBC z wtórnego PBS w oddzielnej kolbie o długości 75cm2 w 15 ml pełnej pożywki wzrostowej.
    4. Aby wyizolować pozostałości HPMC, wstrząsnąć zmieloną tkanką z prędkością 200 obr./min, 37 °C stopni przez 10 minut w 20 ml roztworu 1:1 0,25% trypsyny 25 mM EDTA:PBS objętościowo. Pozwól chusteczce urosnąć, zbierz płyn z dna probówki do nowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj w dół z prędkością 0,5 g x 3 min.
      1. Odessać supernatant i umieścić wszystkie HPMC/RBC w oddzielnej kolbie o długości 75cm2 w 15 ml pełnej pożywki wzrostowej.
    5. Hodować posiane komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2 w wilgotnym środowisku. Nakarm posiane komórki, dodając 15 ml pełnej pożywki wzrostowej w 3 i 5 dniu bez usuwania zużytej pożywki. HPMC można hodować przez 5-7 dni przed podziałem.
      1. Używaj HPMC o niskim pasażu (do pasażu 2) we wszystkich eksperymentach, aby zminimalizować dedyferencjację i modyfikację oryginalnego fenotypu. Użyj mikroskopu szerokokątnego, najlepiej z obiektywem 20x z możliwością kontrastu różnicowego z tworzywa sztucznego lub obiektywu 4-20x z możliwością kontrastu fazowego (filtry kontrastu fazowego pod mikroskopem) do wykonywania wszystkich obrazów komórek, oraz obiektywu 10x () w jasnym polu do analizy immunohistochemicznego barwienia 3,3'-diaminobenzydyny (DAB).
    6. Potwierdź, że HPMC są prostopadłościenne i wyrażają cytokeratynę 8 i wimentynę, wykonując immunohistochemię8 (Figura 3A, C, E).
  3. Izolacja NOF8
    1. Przygotować 10 ml roztworu kolagenazy typu III (10x) łącząc mieszaninę 1:1:1 100x Pen-Strep: 1,500 jednostek aktywności/ml kolagenazy typu III: 714 jednostek aktywności/ml hialuronidazy w PBS.
    2. Wstrząsnąć rozdrobnioną tkanką sieci jajowej, która pozostaje po izolacji HPMC przy 200 obr./min, 37 °C przez 6 godzin w 10 ml 10 x roztworu kolagenazy typu III rozcieńczonego w podłożu bez surowicy (DMEM z 1% witaminami MEM [93 mg / L], 1% aminokwasami endogennymi MEM [81,4 mg / L], 1% streptomycyną penicyliny [Pen-Strep, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny]). Strawiona tkanka będzie wyglądać na nieprzezroczystą i może zawierać pewne włókniste szczątki (ryc. 2E).
    3. Odwirować roztwór zawierający komórki NOF w zawiesinie w stężeniu 0,5 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i umieścić osad w kolbie o długości 75cm2 w 13 ml pełnej pożywki wzrostowej.
    4. Usuń stare podłoża i zastąp je 15 ml świeżej, pełnej pożywki po 24 godzinach. NOF nie można hodować przez 1-3 dni przed podziałem. Należy pamiętać, że proliferacja NOF ustanie, gdy komórki osiągną zbieg.
    5. Potwierdź, że pierwotne ludzkie fibroblasty są płaskimi, wydłużonymi komórkami i wyrażają wimentynę, ale nie cytokeratynę 8, wykonując immunohistochemię8 (Figura 3B, D, F). Do eksperymentów należy stosować NOF o niskim pasażu (najlepiej przed pasażem 3), aby zminimalizować dedyferencjację i modyfikację oryginalnego fenotypu. Użyj mikroskopu szerokokątnego z obiektywem 20x z możliwością plastikowego DIC do wykonywania obrazów wszystkich faz komórek oraz obiektywu 10x w jasnym polu do analizy immunohistochemicznych barwień DAB.

2. Posiewanie kultur organotypowych8

  1. Uwolnić NOF z kolby hodowlanej o średnicy 75 cm, przepłukując ją 10 ml PBS, a następnie 3 ml 0,25% trypsyny/25 mM EDTA przez nie więcej niż 5 minut. Zneutralizować trypsynę co najmniej 3-krotnością objętości pożywki dla pełnego wzrostu.
  2. Przenieś trypsynizowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj w tempie 0,5 g x 3 min. Usuń supernatant i przenieś komórki z powrotem do 5 ml pełnej pożywki wzrostowej. Użyć licznika komórek, aby policzyć komórki odzyskane z kolby hodowlanej.
  3. Rozcieńczyć komórki w odpowiedniej objętości pożywki o pełnym wzroście, aby pokryć 2 000-4 000 NOF na 100 μl na czarną, klarowną, 96-dołkową płytkę. Dodać 0,5 μg/100 μl kolagenu I ze szczurzego ogona do mieszaniny komórek przed posiewem. Pozostawić komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez co najmniej 4 godziny lub do momentu, gdy komórki przylgną do powierzchni płytki.
  4. Uwolnić HPMC z kolby hodowlanej, stosując te same metody, które opisano w krokach 2.1 i 2.2. Rozcieńczyć komórki w odpowiedniej ilości pożywki o pełnym wzroście, aby pokryć 10 000-20 000 HPMC na 50 μl na wierzchu NOF już posiaznanego kolagenem I na płytkach 96-dołkowych. Pozostaw komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez co najmniej 18 godzin przed rozpoczęciem eksperymentów.
  5. Hodowla komórek raka jajnika HeyA8 z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) w pożywce o pełnym wzroście. Komórki raka jajnika HeyA8 są znakowane fluorescencyjnie przez ekspresję wektora lentiwirusowego wyrażającego widłonóg cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Komórki raka jajnika HeyA8 powinny być zlewane w 80-90% w dniu stosowania (logarytmiczna faza wzrostu). Uwolnić komórki z płytki hodowlanej i policzyć, stosując te same metody opisane w krokach 2.1-2.2 dla komórek pierwotnych.
  6. Pozwól komórkom raka jajnika zregenerować się w pożywce o pełnym wzroście przez 15-20 minut w temperaturze 37°C w stożkowej probówce z luźno zamkniętą pokrywką.

3. Test adhezji8

  1. Po wyzdrowieniu należy otoczkować komórki raka jajnika, wirując przez 3 minuty w temperaturze 0,5 x g, a następnie usunąć supernatant i rozcieńczyć komórki w odpowiedniej objętości pożywki wolnej od surowicy, aby osiągnąć stężenie 50 000 komórek/100 μl.
  2. Odwróć 96-dołkowe płytki z kulturami organotypowymi HPMC/NOF w celu usunięcia zużytej pożywki i dodaj 100 μl zawiesiny komórek rakowych w pożywce bez surowicy do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez 30 minut do 4 godzin.
  3. Odwróć 96-dołkową płytkę, aby usunąć pożywkę i nieprzylegające komórki. Za pomocą pipety wielokanałowej o małej mocy ostrożnie i delikatnie odpipetować 100 μl PBS do każdej studzienki i ponownie odwrócić płytkę. Powtórz pranie PBS jeszcze raz.
  4. Odwróć, aby usunąć PBS i dodaj 100 μl 4% paraformaldehydu do każdej studzienki. Pozostaw płytkę na 20 minut, aby utrwalić komórki. Po 20 minutach odwróć płytkę i dodaj 100 μl PBS.
  5. Należy pamiętać, że można podać całkowitą fluorescencję studzienek lub określić ilościowo liczbę komórek. W celu określenia ilościowego należy najpierw umieścić krzywą wzorcową w dwóch egzemplarzach przy użyciu komórek HeyA8 o stężeniu 1 miliona komórek/ml.
    1. Wykonaj krzywą standardową, obracając 1 milion komórek, usuwając pożywkę i pozwalając im siedzieć w 1 ml 4% paraformaldehydu przez 20 minut.
    2. Ponownie odwiruj komórki i wynieś 1 ml PBS (przelicz komórki, aby potwierdzić stężenie 1 miliona/ml). Umieść 50 000, 40 000, 30 000, 20 000, 10 000, 5000, 1 000 i 0 komórek w każdym dołku w dwóch egzemplarzach i dodaj PBS do końcowej całkowitej objętości 50 μl w każdym dołku.
  6. Odczytać od dołu płytkę hodowlaną na czytniku płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie = 488 nm, emisja = 528 nm), skalowanie wysokich studzienek (50 000 na krzywej standardowej). Użyj krzywej standardowej, aby obliczyć, ile komórek raka jajnika przylegało do hodowli organotypowej w każdym dołku (ryc. 4A-C).

4. Test proliferacji10

  1. Po wyzdrowieniu komórek raka jajnika (patrz kroki 2.5 i 2.6 powyżej), osadzać komórki przez 3 minuty w 0,5 x g, a następnie rozcieńczyć komórki w odpowiedniej objętości 1% pożywki FBS (DMEM z 1% FBS, 1% witamin MEM [93 mg/L], 1% aminokwasów endogennych MEM [81,4 mg/L], 1% penicyliny streptomycyny [Pen-Strep, 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny]) w celu osiągnięcia stężenia 4 000 komórek/150 μl.
  2. Odwróć 96-dołkową płytkę z kulturami organotypowymi HPMC/NOF w celu usunięcia zużytej pożywki i dodaj 150 μl zawiesiny komórek rakowych w 1% pożywce FBS do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez 72 godziny.
  3. Raz dziennie należy odczytać płytkę hodowlaną na czytniku płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie = 488 nm, emisja = 528 nm), aby ocenić względną proliferację komórek. Kontynuuj test przez 96 godzin, zmieniając pożywkę po 48 godzinach (Rysunek 5A-C). Uważaj, aby nie zakłócić kultury podczas zmiany podłoża (preferowane jest odwrócenie płytki).

5. Test inwazji8

  1. Przed posiewem kultury 3D dodaj 7,5 μg kolagenu ze szczurzego ogona I w 200 μl PBS do 24-dołkowej wkładki do płytki hodowlanej (wielkość porów 8 μm). Pozostawić na płytce inkubację O/N, a następnie ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipety bezpośrednio przed posiewem kultury organotypowej HPMC/NOF na wkładkach pokrytych kolagenem (krok 2 powyżej).
  2. Przygotować komórki raka jajnika jak w kroku 3.1. Aby umieścić komórki raka jajnika na kulturach organotypowych na wkładkach, ostrożnie użyj pipety, aby usunąć nadmiar pożywki z górnej części wkładek. Do każdej studzienki dodać 100 μl zawiesiny komórek raka jajnika w pożywce bez surowicy.
  3. Dodać 750 μl pełnej pożywki wzrostowej do studzienki poniżej wkładki, aby wywołać inwazję komórek rakowych do kultur organotypowych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym środowisku przez 24 godziny
    Uwaga: Komórki raka jajnika, które atakują kulturę organotypową, przechodzą przez wkładkę i pozostają na jej spodzie.
  4. Po 24 godzinach chwycić wkładkę szczypcami i krótko opłukać ją w zlewce PBS, a następnie przenieść wkładkę do pustej studzienki. Szoruj górną część każdej wkładki obiema stronami bawełnianego wacika, łącznie przez 1 minutę. Szybko umieść wkładkę na płytce zawierającej 750 μl 4% paraformaldehydu w każdym dołku. Pozostaw każdą wkładkę na 10 minut w paraformaldehydzie przed przeniesieniem wkładek do studzienek wypełnionych 750 μl PBS.
  5. Zobacz zaatakowane komórki (przyklejone i przymocowane do dna wkładek) za pomocą mikroskopu w powiększeniu 2,5x. Gdy cała studnia znajdzie się w polu view, ustaw powiększenie na 10x i zrób 5 zdjęć, jedno w pobliżu środka i 1 w każdej ćwiartce studni, unikając robienia zdjęć zbyt blisko krawędzi. Postępuj zgodnie z tym samym wzorem dla każdej studzienki.
  6. Użyj programu producenta, aby policzyć liczbę komórek na każdym obrazie, aby uzyskać średnią liczbę komórek zaatakowanych na pole w każdej studzience (rysunek 6A-C) zgodnie z ich protokołem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kulturę organotypową przygotowano, najpierw mieszając pierwotne ludzkie fibroblasty z kolagenem typu I, a następnie nakładając na tę kulturę 5-krotnie większą liczbę komórek mezohelialnych. Kulturę inkubowano przez co najmniej 18 hr przed dodaniem komórek raka jajnika w celu zbadania adhezji, inwazji lub proliferacji. Każdy test powtórzono z wieloma (n=3-5) kulturami 3D pochodzącymi od różnych pacjentów, a w każdym wariancie przetestowano liczne studzienki dla testów adhezji (n=5), proliferacji (n=5) i inwazji (n=3). Kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stworzono organotypowy model mikrośrodowiska otrzewnej w celu oceny indywidualnych i zbiorowych funkcji zarówno komórkowych, jak i wrodzonych składników mikrośrodowiska w rozprzestrzenianiu się raka jajnika. Dostępne są szczegółowe protokoły posiewu i dostosowywania hodowli organotypowej 3D w celu zbadania adhezji, proliferacji i inwazji komórek raka jajnika. Pierwotne ludzkie komórki międzybłonka żołądkowego i fibroblasty wyizolowano od pacjentów i wykorzystano we wczesnym okresie pasażu, aby zachować normalną morfologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim rezydentom i lekarzom prowadzącym, w szczególności dr A.F. Haneyowi (University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) za pobranie biopsji omentalnych. Dziękujemy również Stacey Tobin i Gail Isenberg za staranną redakcję tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez Bears Care, charytatywnego beneficjenta Chicago Bears Football Club, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702 oraz National Cancer Institute grant R01 CA111882 dla E.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Izolacja i hodowla komórek pierwotnych
PBSFisher ScientificSH3001304
Jednosieczne żyletkiFisher Scientific12-640
15 cm Naczyniahodowlane BD Biosciences353025
Szklana kolba??
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM z L-glutaminąCorning10-013-CV
MEM WitaminyCorning25-020-Cl
MEM Aminokwasy endogenneCorning25-025-CI
Penicylina-StreptomycynaCorning30-002-CI
Wstrząsarka Wirówka Thermo-FisherMaxQ 4450
Inkubator Eppendorf5702
Termo-FisherForma Series II Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Model 3100
Trypsyna EDTA, 1x (0,25%)Corning25-053-CI
HialuronidazaWorthington BiochemicalLS002592
Kolby T-75BD Biosciences
Kolby T-175353112BD Biosciences
do pipetRaininP2, P10, P20, P200 i P1000
Końcówki do pipetCorningFiltrowane końcówki P2, P10, P20, P200 i P1000
Nazwa odczynnika/strong<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
2. Poszycie 3D Hodowla
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Szkiełka komory do liczenia komórekInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Kolagen typu I (ogon szczura)BD Biosciences354236
96-dołkowa płytka, przezroczyste dno,BD Nauki biologiczne353219
Nazwa odczynnika/ SprzętFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
3. Test adhezji
Pipeta wielokanałowaEppendorfXplorer 300
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Czytnik płytekUrządzenia molekularneMinimax
Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowy<strong>Komentarze/Opis
5. Test inwazji
Cell Culture Inserts (8um, 24-dołkowy)BD Biosciences353097
Waciki bawełniane Wacikibawełnianez końcówkami Q
ZeissAxiovert 200m
Cell Profilerdomena
Płytka 24-dołkowaBD Biosciences353047
Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
6. Przeciwciała
Antyintegryna i alfa; Vβ 3 Przeciwciało, klon LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
353136 Końcówki do pipet Końcówki Mikroskop publiczna

Bibliografia

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model jamy otrzewnejpierwotne ludzkie komórki mezohelialnenormalne fibroblasty sieci wielkopławnejadhezja komórek nowotworowychinwazja komórek nowotworowychproliferacja komórek nowotworowychhamowanie peptydem RGDblokujące przeciwciała przeciwko integrynom
Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.