Artykuł metodologiczny

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

DOI:

10.3791/53548

⸱

23 lutego 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1LCBPT - UMR8601, Institut de Chimie, Université Paris Descartes, 2Institute of Physics of Biological Systems, EPFL, 3PARCC - INSERM U970, Université Paris Descartes

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym ograniczeniem badań opartych na NMR jest niska czułość. Powoduje to długie czasy akwizycji, zapobiegając w ten sposób pomiarom przemian metabolicznych NMR w czasie rzeczywistym. Hiperpolaryzacja poprzez rozpuszczanie DNP omija część problemów z czułością dzięki dużemu nierównowagowemu namagnesowaniu jądrowemu wynikającemu z przeniesienia polaryzacji spinu elektronu do jądra. Uzyskany sygnał o wysokim NMR może być wykorzystany do monitorowania reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Wadą hiperspolaryzowanego NMR jest ograniczone okno czasowe dostępne do akwizycji sygnału, które zwykle jest rzędu stałej czasu relaksacji podłużnej spinu jądrowego, T1, lub, w korzystnych przypadkach, rzędu stałej czasu relaksacji związanej ze stanem singletowym sprzężonych jąder, TLLS. Wychwyt komórkowy cząsteczek endogennych i tempo metabolizmu mogą dostarczyć istotnych informacji na temat rozwoju guza i odpowiedzi na leki. Liczne wcześniejsze badania nad hiperpolaryzacją NMR wykazały znaczenie pirogronianu jako substratu metabolicznego do monitorowania aktywności enzymatycznej in vivo. Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis konfiguracji doświadczalnej i metod wymaganych do badania reakcji enzymatycznych, w szczególności szybkości konwersji pirogronianu do mleczanu w obecności dehydrogenazy mleczanowej (LDH), za pomocą hiperspolaryzowanego NMR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczna polaryzacja jądrowa (DNP),1,2 technika zaprojektowana w celu zwiększenia polaryzacji spinu jądrowego, tj. nierównowagi między populacjami spinów 'góra' i 'dół' (P = [N↑ - N↓] / [N↑ + N↓]), została po raz pierwszy wprowadzona w latach 1950-tych. Spiny jądrowe, takie jak 13C, mogą być spolaryzowane do P = 10-1 w sprzyjających warunkach, zazwyczaj w temperaturze rzędu 1 K i w polu magnetycznym 3,357 T.3,4 Przełom w zastosowaniach biologicznych nastąpił na początku 2000 roku wraz z opracowaniem rozpuszczania DNP, który polega na rozpuszczaniu zamrożonych spolaryzowanych próbek w przegrzanej wodzie przy zachowaniu wysokiego poziomu polaryzacji jądrowej uzyskanego w niskiej temperaturze. 5 Sygnał NMR w stanie ciekłym jest wzmocniony o współczynnik 103-10 4 w porównaniu z typowymi warunkami NMR RT spolaryzowanymi termicznie. Rozpuszczanie DNP zapewnia zatem sposób na nieinwazyjny pomiar szybkości reakcji biochemicznych in situ w czasie rzeczywistym, umożliwiając monitorowanie dynamiki za pomocą NMR z rozdzielczością czasową 1 sekundę lub mniejszą. 6-10 Możliwe stało się również wykrywanie analitów w bardzo niskich stężeniach. 11

Wśród nieinwazyjnych metod obrazowania molekularnego, hiperpolaryzowany NMR jest jedyną techniką, która pozwala na jednoczesny pomiar substratu i jego produktów przemiany materii w czasie rzeczywistym. Rozpuszczanie DNP zostało przyjęte z entuzjazmem w różnych dziedzinach nauki, począwszy od NMR in vitro, a skończywszy na klinicznym rezonansie magnetycznym12, a najbardziej obiecujące zastosowania są związane z monitorowaniem metabolizmu in situ. 13,14 Głównym ograniczeniem rozpuszczania DNP jest to, że po upływie czasu rzędu pięciokrotności stałej czasowej relaksacji podłużnej T1 dochodzi do utraty zwiększonej polaryzacji. Konieczne jest zatem użycie cząsteczek o spinach jądrowych wykazujących stosunkowo długie T1. Aby przedłużyć czas wzmocnienia polaryzacji, można zastosować wolno relaksujące się jądrowe stany spinowe, znane jako stany długotrwałe (LLS). 15-17 LLS są niewrażliwe na wewnątrzparowe oddziaływanie dipol-dipol, więc ich charakterystyczna stała czasu relaksacji, TLLS, może być znacznie dłuższa niż T1. 18 W związku z tym można było uzyskać czas namagnesowania wynoszący dziesiątki minut i do 1 godziny,19,20 i LLS zaproponowano zarówno dla spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS), jak i MRI. 21

Główne punkty, które muszą być starannie zoptymalizowane do badania szybkości reakcji enzymatycznych za pomocą hiperspolaryzowanego NMR to: (i) maksymalizacja polaryzacji ciała stałego i (ii) minimalizacja utraty polaryzacji podczas transferu hiperspolaryzowanego roztworu z polaryzatora do spektrometru NMR. W artykule opisano adaptację specjalnie wykonanego aparatu do rozpuszczania DNP i systemu iniekcyjnego do badania reakcji enzymatycznych. Charakterystyka i wydajność zestawu zostaną zademonstrowane za pomocą dobrze znanego i szeroko stosowanego hiperspolaryzowanego podłoża [1-13C]pirogronianu. Głównymi powodami tego wyboru są, po pierwsze, naturalnie długi czas relaksacji podłużnej wynoszący 13C (T1 >50 s przy silnych polach magnetycznych i temperaturach powyżej 293 K), który pozwala na monitorowanie reakcji przez kilka minut, a po drugie, jego centralna rola w metabolizmie nowotworów. 13,14 Stosując rozpuszczanie DNP NMR i specjalnie opracowany system iniekcji, utlenianie pirogronianu katalizowane przez dehydrogenazę mleczanową (LDH) można monitorować w obecności początkowej puli nieznakowanego mleczanu9,22 lub bez dodatku nieznakowanego mleczanu, jak pokazano poniżej. Wykazano, że sygnał [1-13C]mleczanu mierzony in vivo (w tym w komórkach) po wstrzyknięciu hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu jest głównie spowodowany szybką wymianą znaczników między pirogronianem a mleczanem, a nie produkcją mleczanu. 6

Prezentujemy tutaj produkcję [1-13C]mleczanu z hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu wstrzykniętego do probówki NMR zawierającej LDH, ale początkowo bez mleczanu.

Opis systemu
W układzie DNP do rozpuszczania występują dwie główne części (rysunek 1): polaryzator DNP i spektrometr NMR. Głównym elementem polaryzatora DNP jest kriostat do schładzania próbki do około 1 K w pompowanej kąpieli helowej. Kriostat jest umieszczony w magnesie nadprzewodzącym o masie 3,35 T i ma geometrię, która gwarantuje, że próbka polaryzująca znajduje się w izocentrum magnesu (ilustracja 1). Wewnątrz kriostatu próbka (a) jest otoczona cewką NMR (b), w celu zmierzenia nagromadzenia polaryzacji, zawartej w przemodizowanej wnęce mikrofalowej (c). Cała próbka jest utrzymywana w niskiej temperaturze w pompowanej kąpieli helowej (d) i napromieniana mikrofalami przez falowód. Cały system jest zarządzany przez specjalnie zaprojektowane oprogramowanie (rysunek 2D).

Sprzęt i sprzęt kriogeniczny potrzebne do przeprowadzenia DNP i późniejszego rozwiązania są nadal wyzwaniem technologicznym. Nowy kriostat DNP23,24 został opracowany i przetestowany w celu określenia jego wydajności kriogenicznej, a następnie zoptymalizowany pod kątem szybkiego schładzania, czasu utrzymywania helu i ogólnego minimalnego zużycia helu podczas pracy.

Kriostat składa się z dwóch części. Pierwszą częścią kriostatu jest izolacja Dewara (rysunek 2A), którą można z grubsza oddzielić w górnej części (a) ogona lub przestrzeni próbki (b) oraz zewnętrznej komorze próżniowej (OVC) utrzymywanej w wysokiej próżni i mieszczącej ekrany promieniowania (c). Drugą częścią kriostatu jest główny wkład (rysunek 2B), umieszczony w izolacji Dewara, gdzie zarządzane są wszystkie regulacje przepływu. Ciekły hel pochodzący z zewnętrznego zbiornika dewara przez linię przesyłową (a) jest w pierwszym etapie skondensowany w separatorze (b), komorze pośredniej używanej zarówno do utrzymywania zimnej górnej części kriostatu, jak i do usuwania helu odparowanego podczas przenoszenia. Ciśnienie separatora jest obniżane przez pompowanie przez kapilarnę (c) owiniętą wokół górnej części kriostatu; przepływ zimnego helu w tej kapilarze jest używany do chłodzenia przegród (d) i ekranów radiacyjnych w izolacji Dewara (OVC). Próbka jest umieszczana i polaryzowana w przestrzeni próbki. Przestrzeń próbki jest połączona z separatorem za pomocą kolejnej kapilary (e), owiniętej wokół ogona głównej wkładki kriostatu. Kapilara ta może być otwierana lub zamykana za pomocą zaworu iglicowego obsługiwanego ręcznie z zewnątrz.

Aby osiągnąć niską temperaturę używaną podczas procesu DNP, ciekły hel musi zostać zebrany w przestrzeni próbki kriostatu i jego ciśnienie obniżone do zakresu mbar. Operacje potrzebne do działania kriostatu są wykonywane przez dość złożony system pompowy z trzema zestawami pomp, monitorowanymi i obsługiwanymi w różnych punktach za pomocą przyrządów elektronicznych i elektromechanicznych (rysunek 2C). Kriostat OVC musi być pompowany do wysokiej próżni przez pierwszy system pompujący. System ten składa się z pompy turbomolekularnej wspieranej przez pompę rotacyjną (a). Ciekły hel jest przenoszony z zasobnika Dewara (b) przez wlot linii przesyłowej kriostatu do separatora kriostatu. Separator posiada wylot podłączony do drugiego zestawu pompowego. Ten zestaw składa się z pompy membranowej o wydajności35 m 3/h (c). Linia ta pozwala na usunięcie helu gazowego gotowanego podczas transferu z dewara oraz podczas chłodzenia separatora. Ciekły hel zebrany w separatorze może być następnie przenoszony do przestrzeni próbki przez rurki kapilarne opisane powyżej. W celu przeniesienia ciekłego helu z separatora do przestrzeni próbki, a następnie obniżenia ciśnienia w komorze próbki do zakresu mbar, trzeci system pompowania składający się z pompy Rootsa o wydajności 250 m3/h wspieranej przez pompę rotacyjną o wydajności 65 m3/h (d) jest podłączony do kriostatu za pomocą ręcznego zaworu motylkowego (e).

Wszystkie operacje systemu próżniowego są kontrolowane i regulowane przez elektropneumatyczne urządzenie wykonane na zamówienie (f). To urządzenie steruje połączeniami przewodów podciśnieniowych między wylotami separatora kriostatu (g) a przestrzenią próbki (h), drugim/trzecim systemem pompowania (c, d), butlą ze sprężonym helem (i) i na zewnątrz. Komunikacja między (f) a zewnętrzną stroną odbywa się przez zawór jednokierunkowy (j). Urządzenie elektropneumatyczne (f), jak również wszystkie parametry systemu i sprzęt do rozpuszczania są sterowane i obsługiwane przez wykonane na zamówienie urządzenie elektroniczne połączone USB ze wspólnym komputerem PC. Wreszcie, cały system, za pośrednictwem urządzenia elektronicznego, jest zarządzany przez samodzielne oprogramowanie wykonane na zamówienie (rysunek 2D), w którym odpowiednie operacje są uruchamiane za pomocą interfejsu za pomocą przycisków oprogramowania.

Do zarządzania próbką i pomiaru narastania sygnału NMR w stanie stałym używana jest seria wkładek (Rysunek 3A). Aby przygotować kriostat do polaryzacji, należy umieścić główną wkładkę próbki (a) w kriostacie. Główna wkładka do próbki jest wyposażona w cewkę NMR (b) umieszczoną w przemodzonej, pozłacanej wnęce mikrofalowej. Wstępnie zamrozić substrat zawierający roztwór, który ma być spolaryzowany (roztwór polaryzujący) w temperaturze ciekłego azotu w odpowiednim pojemniku na próbkę i umieścić go na końcu dna uchwytu na próbkę z włókna szklanego (c). Wsuń uchwyt próbki do głównej wkładki na próbkę, aby dotrzeć do izocentrum magnesu. Włóż pozłacany falowód (d) do uchwytu próbki. Falowód umożliwia przemieszczanie się mikrofal generowanych z zewnętrznego źródła mikrofal przy minimalnych stratach w próbce.

Specjalnie zaprojektowane oprogramowanie do zarządzania kriostatem obsługuje automatycznie, po kliknięciu odpowiedniego przycisku interfejsu, różne operacje, takie jak schładzanie (temperatura kriostatu jest obniżana do temperatury ciekłego helu), napełnianie (kriostat jest napełniany ciekłym helem do wcześniej określonego poziomu), dodatkowy etap chłodzenia do T≈ 1 K (kąpiel ciekłego helu jest pompowana w celu osiągnięcia najniższej możliwej temperatury), zwiększanie ciśnienia (kriostat jest pod ciśnieniem nieco wyższym od ciśnienia pokojowego przy P = 10-30 mbar, aby umożliwić otwarcie kriostatu bez ryzyka zanieczyszczenia kriostatu powietrzem) i rozpuszczanie (automatyczna procedura rozpuszczania próbki DNP i przenoszenia powstałego roztworu hiperspolaryzowanego do miejsca pomiaru, tj. spektrometr NMR).

Polaryzacja jest wykonywana poprzez naświetlanie próbki mikrofalami na częstotliwości 94 GHz (w polu polaryzacyjnym B0 = 3,35 T). Próbka jest uważana za całkowicie spolaryzowaną po 3 TDNP, gdzie TDNP to czas narastania polaryzacji. TDNP jest tego samego rzędu wielkości, co czas wzdłużnego relaksacji jąder docelowych w stanie stałym w danym polu i temperaturze. We wszystkich naszych eksperymentach próbka była spolaryzowana na ponad 5 TDNP.

Pod koniec czasu polaryzacji, próbka musi zostać rozpuszczona w roztworze RT, aby mogła być użyta do pomiaru aktywności enzymatycznej. Podczas procesu rozpuszczania 5 ml przegrzanegoD2Oz kotła wkładu do rozpuszczania (rysunek 3B) jest popychane przez sprężony hel gazowy (P = 6-8 barów) w celu dotarcia do próbki wzmocnionej DNP i rozpuszczenia jej. Powstały hiperspolaryzowany roztwór jest wypychany z wkładki do rozpuszczania przez sprężony hel gazowy przez wylot wkładki do rozpuszczania (rysunek 3C-b), teflonową rurkę transferową o średnicy wewnętrznej 2 mm. Czas potrzebny na proces rozpuszczania wynosi 300 ms.23 Czas potrzebny na przeniesienie próbki z polaryzatora DNP do miejsca spektrometru NMR wynosi około 3 sek.

Proces rozpuszczania odbywa się za pomocą wkładki do rozpuszczania (Rysunek 3B). Wkład rozpuszczający składa się z zespołu elektroniczno-pneumatycznego (a), drążka z włókna węglowego (b) zawierającego rurki łączące kocioł w zespole pneumatycznym i skrytki pojemnika na próbkę (c), która umożliwia szczelne połączenie z pojemnikiem na próbkę i z powrotem do wylotu. Zespół elektropneumatyczny (rysunek 3C) służy do wytwarzania i przetłaczania przegrzanego D2O przez pręt z włókna węglowego do pojemnika na próbkę, a następnie do ekstrakcji hiperspolaryzowanego roztworu z kriostatu. Zespół elektropneumatyczny składa się z zaworów pneumatycznych (a), które sterują połączeniami między przewodem sprężonego helu (P = 6-8 bar) (b), kotłem (c), w którym D2O jest wtryskiwany przez zawór (d), a wylotem (e) przez ramię z włókna węglowego (f). Układ uzupełnia ciśnienie G, termometr i przewód rezystancyjny grzewczy w kotle (c), spust (h) oraz skrzynka przyłączeniowa (i) służąca do połączenia systemu z elektronicznym urządzeniem sterującym.

Kriostat DNP i spektrometr NMR są połączone linią transferową, tj. rurką PTFE o średnicy wewnętrznej 2 mm, wewnątrz której hiperspolaryzowany roztwór jest wypychany przez hel pod ciśnieniem (P = 6-8 bar), gdy następuje rozpuszczenie.

Sekwencja rozpuszczania składa się z następujących operacji: w ciągu pierwszych 300 ms, przegrzany D2O jest wpychany do pojemnika na próbkę w celu stopienia i rozpuszczenia hiperspolaryzowanego zamrożonego roztworu. Następnie hiperspolaryzowany roztwór ekstrahuje się z kriostatu za pomocą helu gazowego pod ciśnieniem (P = 6-8 barów) i przepycha przez rurkę PTFE o średnicy wewnętrznej 2 mm (rysunek 3C-e) do miejsca pomiaru, w którym wykonuje się wstrzyknięcie, za pomocą jednej z procedur opisanych w kroku 6.2.1 lub kroku 6.2.2.

Drugim elementem konfiguracji DNP NMR jest spektrometr NMR. W konfiguracji opisanej w niniejszym dokumencie spektrometr NMR działa w polu B0 = 11,7 Tesli. Sonda NMR 5 mm służy do pomiaru hiperspolaryzowanego sygnału po rozpuszczeniu. Spektrometr NMR jest obsługiwany przez konsolę NMR, używaną zarówno do pomiarów NMR w stanie stałym, jak i ciekłym, oraz za pomocą oprogramowania XWinNMR dostarczonego przez firmę. Typowy pomiar składa się z twardego impulsu o niskim kącie obrotu (skalibrowanego, dla stanu ciekłego lub nieskalibrowanego, dla pomiarów w stanie stałym), po którym następuje akwizycja sygnału.

Pomiary sygnału polaryzacji termicznej ciała stałego i narastania sygnału pochodzącego z DNP są wykonywane przy użyciu specjalnie wykonanej cewki 13C w miejscu polaryzatora DNP (Rysunek 3Ab) sprzężonej ze spektrometrem NMR. W tej konkretnej sytuacji spektrometr NMR nie wykonuje blokady sygnału. Podczas przeprowadzania pomiarów w stanie stałym, aby uniknąć znacznych zakłóceń polaryzacji, opóźnienie czasowe między akwizycjami powinno być wystarczająco długie, w przybliżeniu dłuższe niż 0,5 TDNP.

Wzmocnienie półprzewodnikowe jest zdefiniowane jako figure-introduction-1 gdzie figure-introduction-2 jest sygnałem hiperpolaryzacyjnym (uzyskanym w Kroku 3.3) i figure-introduction-3 jest sygnałem stanu stałego (uzyskanym w stanie równowagi termicznej przy temperaturze pompowanego ciekłego helu w Kroku 3.2) (Rysunek 4A). Ten parametr określa maksymalną polaryzację dostępną dla eksperymentów NMR, przed nieuniknionymi stratami podczas przenoszenia roztworu hiperpolaryzacyjnego. Pomiar jest wykonywany za pomocą prostej sekwencji akwizycji impulsu przy użyciu nieskalibrowanego impulsu o niskim kącie obrotu. Kalibracja impulsów jest często pomijana w przypadku pomiarów półprzewodnikowych.

Analogiczna procedura może być użyta do określenia wzmocnienia sygnału hiperpolaryzacyjnego w stanie ciekłym. W tym przypadku próbka umieszczona w probówce spektrometru przed wstrzyknięciem (etap 6.2) składa się z 500 μlD2O. Po rozpuszczeniu i wstrzyknięciu należy monitorować dwa ważne parametry. Pierwszym z nich jest hiperpolaryzowane wzmocnienie w miejscu spektrometru NMR, figure-introduction-4 (Rysunek 4B), gdzie figure-introduction-5 to sygnał tuż po wstrzyknięciu roztworu hiperpolaryzacji (uzyskany w Kroku 7.1) i figure-introduction-6 to sygnał polaryzacji termicznej (uzyskany w kroku 7.2). Drugi to podłużny czas relaksacji, T1 (rysunek 4B, wstawka), związany z substratem i każdym produktem metabolicznym (uzyskany przez wykładnicze sygnały dopasowania uzyskane w kroku 7.1). Te dwa parametry określają minimalne stężenie substratu niezbędne do uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu (SNR) oraz dostępne okno czasowe do pomiaru przemian metabolicznych. Stosunek między polaryzacją ciała stałego figure-introduction-7 a polaryzacją w stanie ciekłym figure-introduction-8 podaje oszacowanie strat polaryzacji spowodowanych relaksacją podczas transferu roztworu hiperpolaryzacyjnego. Wartość figure-introduction-9 powinna być przestrzegana w przypadku braku strat relaksacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Cała analiza danych została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego oprogramowania.

1. Przygotuj roztwór polaryzujący

  1. Przygotować 2 ml roztworu pirogronianu sodu znakowanego izotopem węgla 1,12 M 13C (Na+[CH 3-CO-13COO]-, substrat) domieszkowanego 33 mM rodnika TEMPOL (4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopiprydyno-1-oksyl, środek polaryzujący)4 w 2:1 D2O/d6-etanolu do obserwacji w temperaturze 13C. UWAGA: Należy zachować środki ostrożności ze względu na łatwopalny charakterd 6-etanolu.
  2. Sprawdź, czy stężenie rodników jest optymalne pod względem osiągniętej polaryzacji.
    1. Zmienić nieznacznie stężenie rodnikowe roztworu w ppkt 1.1 (np. do 30 mM lub 35 mM).
    2. Określ iteracyjnie wzmocnienie stanu stałego (patrz krok 3) i znajdź stężenie rodnika, które prowadzi do maksymalnego wzmocnienia.

2. Polaryzacja

  1. Obniż temperaturę kriostatu DNP poprzez procedurę schładzania. Kliknij przycisk "Ochłodzenie" w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D).
  2. Zebrać ciekły hel w kriostacie DNP podczas procedury napełniania. Kliknij przycisk "Napełnianie" w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D).
  3. Umieścić 300 μl zoptymalizowanego roztworu polaryzacyjnego z kroku 1.1 w pojemniku na próbkę dostarczonym z polaryzatorem DNP. Zamrozić pojemnik na próbkę z próbką w środku, delikatnie zanurzając go w kąpieli ciekłego azotu.
  4. Usunąć ciekły azot, który może znajdować się w pojemniku na próbkę po procedurze zamrażania (etap 2.3), ekstrahując pojemnik na próbkę z kąpieli ciekłego azotu i obracając go do góry nogami.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania całkowitego rozpuszczenia próbki (patrz krok 5).
  5. Włożyć próbkę do kriostatu.
    UWAGA: Ten etap, składający się z następującego podetapu, musi być wykonany szybko (tj. w czasie krótszym niż 10-20 sekund), aby zapobiec stopieniu się próbki.
    1. Umieścić pojemnik na próbkę w uchwycie na próbkę. Umieścić uchwyt na próbkę w głównej wkładce kriostatu. Włóż falowód mikrofalowy do uchwytu próbki.
  6. Obniżyć temperaturę kriostatu, rozpoczynając procedurę chłodzenia o temperaturze 1 K. Kliknij przycisk "Chłodzenie 1K" w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D).
  7. Włącz źródło mikrofal i naświetl próbkę. Kliknij przycisk "MW-ON" w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D).

3. Pomiary NMR w półprzewodniku

  1. Odłącz koncentryczny kanału detekcji konsoli NMR od cewki spektrometru, obracając złącze w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 90° i pociągając je. Podłącz koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego cewki kriostatu NMR. Włóż męskie złącze konsoli NMR do żeńskiego złącza cewki kriostatu NMR, zwracając uwagę na pin orientacyjny; Mocno dociśnij i obróć złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 90°.
  2. Zmierz sygnał termiczny NMR w stanie stałym w miejscu kriostatu za pomocą prostej sekwencji akwizycji impulsów z nieskalibrowanymi impulsami o niskim kącie odwrócenia powtarzanymi w odstępie T = 5 min. Po ustawieniu pomiaru wpisz w wierszu poleceń oprogramowania "zg" i naciśnij klawiatury "Enter". Zapoznaj się z instrukcją obsługi spektrometru NMR, aby uzyskać więcej informacji na temat obsługi spektrometru i konfiguracji pomiaru.
  3. Zmierz sygnał NMR wzmocniony DNP. Powtórz czynności opisane w kroku 3.2 po zainicjowaniu procesu DNP, jak opisano w sekcji 2.
  4. Odłącz koncentryczny kanału wykrywania konsoli NMR od cewki kriostatu NMR, obracając złącze w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 90° i pociągając je. Podłącz koncentryczny kanału detekcji do złącza koncentrycznego cewki spektrometru. Włóż męskie złącze konsoli NMR do żeńskiego złącza cewki spektrometru, zwracając uwagę na pin orientacyjny; Mocno dociśnij i obróć złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 90°.

4. Zoptymalizuj jednorodność głównego pola magnetycznego ('podkładkowanie')

  1. Umieścić w spektrometrze probówkę zawierającą 500 μl mieszaniny wytworzonej w poprzednich doświadczeniach (tj. po kroku 6.2).
  2. Wykonaj podkładkowanie spektrometru NMR, zmieniając prąd w cewkach gradientu podkładkowego, szukając maksymalnego sygnału "blokady" deuteru. Wybierz odpowiednią cewkę podkładkową, naciskając odpowiedni przycisk na konsoli NMR.
    1. Obróć pokrętło na konsoli NMR, aby określić kierunek obrotu, który zwiększa sygnał blokady. Kontynuuj obracanie, aż sygnał osiągnie maksimum. Wybierz inną cewkę podkładkową i powtarzaj maksymalizację, aż zostanie znalezione lokalne maksimum dla wszystkich cewek podkładkowych. Więcej informacji można znaleźć w instrukcji obsługi spektrometru NMR. Na koniec usuń próbkę użytą do zablokowania.

5. Rozwiązanie

  1. Wlać 5 mlD2Odo bojlera z wkładem do rozpuszczania. Zwiększyć ciśnienie i podgrzać D2O za pomocą drutu rezystancyjnego aż do osiągnięcia T ≈ 180-200 °C. Kliknij przycisk "Przygotuj grzałkę" w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D).
  2. Po zakończeniu procedury polaryzacji próbki (np. po 3 TDNP) należy zwiększyć ciśnienie kriostatu nieco powyżej ciśnienia pokojowego. Kliknij przycisk "SS Operations" w interfejsie oprogramowania kriostatu (Rysunek 2D). Wyjmij prowadnicę kuchenki mikrofalowej z wkładki do rozpuszczania.
  3. Wsuń wkładkę do rozpuszczania (Rysunek 3B) w dół do uchwytu próbki (Rysunek 3A-c). Wkładka do rozpuszczania musi sięgać dna uchwytu próbki i musi być mocno dociśnięta, aby zapewnić szczelne połączenie z pojemnikiem na próbkę, aby uniknąć wycieku D2O w kriostacie.
  4. Naciśnij spust sprzętowy (Rysunek 3C-h), aby rozpocząć sekwencję rozpuszczania, z góry określoną sekwencję czasową operacji zaworów pneumatycznych.

6. Wtrysk

  1. Przed rozpuszczeniem umieścić probówkę NMR o średnicy 5 mm, zawierającą 500 μl próbki (np. D2O dla figure-protocol-1 pomiar w Kroku 7 lub roztwór LDH z Kroku 8 w celu pomiarów aktywności enzymatycznej w Kroku 9), w izocentrum spektrometru 11,74 T NMR (patrz Krok 4).
  2. Bezpośrednio po rozpuszczeniu (Krok 5) zmieszać 500 μl roztworu hiperpolaryzacyjnego z próbką umieszczoną w spektrometrze NMR w Kroku 6.1.
    1. Wstrzyknięcie ręczne: zebrać hiperspolaryzowany roztwór na końcu rurki przesyłowej o długości 2,5 m w szklanej zlewce umieszczonej w pobliżu magnesu spektrometru NMR. Ręcznie wstrzyknąć 500 μl hiperspolaryzowanego roztworu do probówki z próbką NMR przez specjalnie wykonany system kapilarny.
    2. Automatyczne wstrzykiwanie: przed procesem rozpuszczania podłącz rurkę transferową do zautomatyzowanego, wykonanego na zamówienie urządzenia do wstrzykiwania, które oddziela hiperspolaryzowany roztwór od helu gazowego używanego do przenoszenia. Urządzenie automatycznie dostarcza 500 μl hiperspolaryzowanego roztworu do probówki z próbką.

7. Pomiar NMR w stanie ciekłym

  1. Po rozpuszczeniu zmierz hiperspolaryzowany sygnał NMR z próbki w spektrometrze za pomocą serii sekwencji impulsów o kącie odwrócenia 10° w odstępach 1,5 sekundy, aby śledzić postęp namagnesowania substratu (A) i produktu (B). Po ustawieniu pomiaru wpisz w wierszu poleceń oprogramowania "zg" i naciśnij klawiatury "Enter". Zapoznaj się z instrukcją obsługi spektrometru NMR, aby uzyskać więcej informacji na temat obsługi spektrometru i konfiguracji pomiaru.
  2. Gdy namagnesowanie zostanie w pełni zrelaksowane (tj. po T = 10 T1), zmierz sygnał termiczny NMR za pomocą serii sekwencji impulsów o kącie odwrócenia 90 ° w odstępach od T = 3 T1 ≈ 3 min. Po ustawieniu pomiaru wpisz w wierszu poleceń oprogramowania "zg" i naciśnij klawiatury "Enter". Zapoznaj się z instrukcją obsługi spektrometru NMR, aby uzyskać więcej informacji na temat obsługi spektrometru i konfiguracji pomiaru.

8. Przygotowanie próbek zawierających enzymy (specyficzne dla przemiany pirogronianu w mleczan)

  1. Przygotować bufor reakcyjny według następującej receptury: 50 mM zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,1 mM ditiotreitol (DTT) w 0,1 M buforze fosforanowym, pH = 7,0.
  2. Przygotować roztwór LDH z mięśni królika o stężeniu 1 j./ml przygotowany na świeżo w buforze reakcyjnym z 20 μg/ml albuminy surowicy bydlęcej, BSA.
  3. Zmieszać 478 μl buforu reakcyjnego (etap 8.1), 20 μl D2O, aby umożliwić stabilizację pola spektrometru ("blokowanie") i 2 μl roztworu LDH (etap 7.2).
  4. Umieścić objętość 500 μl roztworu przygotowanego w kroku 8.3 w probówce NMR o średnicy 5 mm i umieścić probówkę w spektrometrze NMR 500 MHz.

9. Kompletna procedura pomiaru szybkości reakcji enzymatycznej

  1. Przygotuj próbkę polaryzacyjną (Krok 1) i spolaryzuj ją (Krok 2).
  2. Wykonać podkładkowanie na spektrometrze (Krok 4) i przygotować próbkę enzymatyczną (Krok 8).
  3. Wykonaj rozpuszczenie (Krok 5) i wstrzyknięcie (Krok 6).
  4. Zmierz serię sygnałów z hiperspolaryzowanej próbki z akwizycją impulsów kąta odwrócenia 10° w odstępach 1,5 sekundy (krok 7). Ten etap umożliwia pomiar zaniku sygnału hiperpolaryzowanego i nagromadzenia sygnału przez metabolity.

10. Dopasowanie

  1. Dla każdego widma uzyskanego w kroku 9.4 zidentyfikuj piki odpowiadające odpowiednio substratowi (A) i produktowi (B) i zintegruj je (określ obszar pików). Całki pikowe dają sygnały przebiegu czasu magnesowania (M(A,B)(t), patrz równanie 2).
  2. Korzystając z rozwiązania równania (2), wyznacz wartość F = (RA + keff ) z prostego wykładniczego dopasowania sygnału podłoża zintegrowanego w kroku 10.1.
  3. Korzystając z wartości F = (RA + keff ) wyznaczonej w kroku 10.2, wyznacz keff i RB na podstawie dopasowania sygnału produktu MB(t) z funkcją otrzymaną przez całkowanie równania (2). Zapoznaj się z sekcją Reprezentatywne wyniki (Aktywność enzymatyczna i pomiary metaboliczne), aby uzyskać szczegółowe informacje na temat modelowania reakcji, dopasowania i korekcji RF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnał NMR zyskuje dzięki rozpuszczaniu DNP
Efekt DNP polega na przeniesieniu wysokiej polaryzacji niesparowanych spinów elektronów, zwykle ze stabilnych cząsteczek rodnikowych, do jąder aktywnych NMR, pod wpływem promieniowania mikrofalowego próbki. Najczęściej stosowanymi wolnymi rodnikami są TAM(OXO63) i TEMPOL. 4 Procedury polaryzacji przy użyciu TEMPOL mogą być zoptymalizowane przez "polaryzację krzyżową". 25

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Punktami krytycznymi eksperymentu rozpuszczania DNP NMR są: (i) poziom polaryzacji osiągnięty dla substratu, który określa najniższe stężenie produktu niezbędne do eksperymentów, a także liczbę akwizycji sygnału, które można wykonać, oraz (ii) czas życia namagnesowania w porównaniu z czasem trwania transferu między polaryzacją a miejscami detekcji oraz do szybkości przemiany substratu. Opisany tutaj system iniekcji układu DNP do rozpuszczania pozwala na przeniesienie próbki w ciągu zaledwie 3-4 sekund. Chociaż transfer n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr J. J. van der Klinkowi za pomoc w wyborze i montażu sprzętu, a także dr F. Katebowi i dr G. Bertho za przydatne dyskusje. A.C. było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant PPOOP2_157547). Potwierdzamy finansowanie z Paris Sorbonne Cité (NMR@Com, DIM Analytics, Ville de Paris, Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) oraz Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Nasz zespół bierze udział w programach Equipex Paris-en-Résonance i CACSICE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polaryzator DNPVanderklink s.a.r.l (Szwajcaria)Kriostat i sprzęt elektroniczny do polaryzacji próbek
Elementy systemu próżniowegoPróżnia Edwards (Francja)Różne

- konfiguracja pompowania turbomolekularnego

- konfiguracja pompowania membranowego

- wysokowydajny system pompowania korzeni

- armatura i komponenty próżniowe

DNP 3,35T MagnetBruker (Francja)
Spektrometr NMR 500 MHzBruker (Francja)
Origin 8.0OriginLab (US)Oprogramowanie do analizy danych
Chemicals
SODIUM PYRUVANE-1-13C, 99 ATOM % 13CSigma Aldrich (Francja)490709
ETHANOL-D6, BEZWODNY, 99.5 ATOM % DSigma Aldrich (Francja)186414
  4-Hydroxy-TEMPO 97%Sigma Aldrich (Francja)176141
Tlenek deuteruSigma Aldrich (Francja)151882
zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH)Sigma Aldrich (Francja)
Kwas etyleno-diaminotetraoctowy (EDTA)Sigma Aldrich (Francja)
ditiotreitol (DTT)Sigma Aldrich (Francja)
Bufor fosforanowy, pH =  7.0Sigma Aldrich (Francja)
Enzym LDH w Sigma Aldrich (Francja)L-2500
albumina surowicy bydlęcej, BSASigma Aldrich (Francja)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  2. Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).
  3. Wolber, J., Ellner, F., et al. Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization. Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).
  4. Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals. PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).
  5. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  6. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
  7. Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging. JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).
  8. Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction. An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).
  9. Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR. NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).
  10. Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy. Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).
  11. Lerche, M. H., Meier, S., et al. Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism. NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).
  12. Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).
  13. Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
  14. Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function. Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).
  15. Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields. PRL. 92 (15), 153003(2004).
  16. Carravetta, M., Levitt, M. H. Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field. J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).
  17. Vasos, P. R., Comment, A., et al. Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization. PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).
  18. Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance. JMR. 239, 81-86 (2014).
  19. Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution. JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).
  20. Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution. Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).
  21. Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer. MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).
  22. Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).
  23. Comment, A., van den Brandt, B., et al. Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner. Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).
  24. Balzan, R. Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, EPFL - EDPY. Available from: http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf 1-140 (2013).
  25. Bornet, A., Melzi, R., et al. Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization. JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).
  26. Bowen, S., Hilty, C. Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy. PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).
  27. Cavadini, S., Vasos, P. R. Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy. Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).
  28. Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Long-lived States in Multiple-Spin Systems. Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).
  29. Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states. Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).
  30. Sarkar, R., Comment, A., et al. Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization. JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dissolution DNPNMR SpectroscopyPyruvate to Lactate ConversionLactate DehydrogenaseHyperpolarized NMRReal time NMRSignal AcquisitionCryostat Equipment

Powiązane artykuły