Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dojrzały mięsień ma unikalną strukturę, która jest podatna na obrazowanie żywych komórek. W niniejszym artykule opisano eksperymentalny protokół ekspresji białek znakowanych fluorescencyjnie w mięśniu zginacza palca brevis (FDB). Warunki zostały zoptymalizowane, aby zapewnić dużą liczbę wysokiej jakości włókien mięśniowych wyrażających elektroporowany plazmid, jednocześnie minimalizując uszkodzenia mięśni. Metoda wykorzystuje znaczniki fluorescencyjne na różnych białkach. Połączenie tej metody ekspresji z mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości umożliwia obrazowanie żywych komórek, w tym obrazowanie po uszkodzeniu wywołanym laserem. Barwniki fluorescencyjne w połączeniu z obrazowaniem białek znakowanych fluorescencyjnie dostarczają informacji na temat podstawowej budowy mięśni i ich reakcji na bodźce.
Wprowadzenie
Poszczególne włókna mięśniowe to duże, wysoce zorganizowane komórki syncytialne. Istnieje kilka modeli hodowli komórkowych mięśni; Jednak głównym ograniczeniem tych modeli jest to, że nie różnicują się w pełni w dojrzałe włókna mięśniowe. Na przykład linie komórkowe C2C12 i L6 pochodzą odpowiednio od myszy i szczurów 1-4. W warunkach głodu surowicy jednojądrzaste komórki "podobne do mioblastów" przestają się rozmnażać, przechodzą wycofanie cyklu komórkowego i wchodzą w program miogenny, tworząc wielojądrzaste komórki z sarkomerami, zwane miotubami. Przy przedłużonych warunkach hodowli miotubes mogą wykazywać właściwości kurczliwe i "drgać" w hodowli. Obecnie ustalono również ludzkie linie komórkowe 5. Oprócz tych unieśmiertelnionych linii komórkowych, mioblasty jednojądrzaste mogą być izolowane z mięśni i w podobnych warunkach głodu surowicy utworzą miotuby. Te linie komórkowe i pierwotne kultury mioblastów są bardzo przydatne, ponieważ mogą być transfekowane plazmidami lub transdukowane wirusami i wykorzystywane do badania podstawowych procesów biologicznych komórek. Jednak komórki te, nawet gdy są indukowane do tworzenia miotub, nie mają wielu istotnych cech dojrzałej organizacji mięśni. W szczególności miorurki są znacznie mniejsze niż pojedyncze dojrzałe włókna mięśniowe i nie mają normalnego kształtu włókien mięśniowych. Co krytyczne, miorurki nie mają kanalików poprzecznych (T-), błoniastej sieci wymaganej do wydajnego uwalniania Ca2 + w całej mioplazmie.
Alternatywna metoda dla pierwotnych linii komórkowych mioblastów polega na użyciu dojrzałych włókien miogenicznych. Transgeneza może być stosowana do ustalenia ekspresji znakowanych białek, ale ta metoda jest kosztowna i czasochłonna. Elektroporacja in vivo mięśni myszy stała się preferowaną metodą ze względu na jej szybkość i niezawodność 6-10.
Metody elektroporacji in vivo i efektywnej izolacji włókien mięśniowych zostały zoptymalizowane dla mięśnia zginacza palca myszy (FDB) 6. Metody te można łatwo wykonać i są minimalnie inwazyjne w celu indukowania ekspresji in vivo z plazmidów. Podejście to jest obecnie łączone z metodami obrazowania o wysokiej rozdzielczości, w tym obrazowaniem po laserowym rozerwaniu sarcolemmy 6,7. Połączenie barwników fluorescencyjnych i ekspresji białek znakowanych fluorescencyjnie można wykorzystać do monitorowania procesów biologicznych komórek w dojrzałych włóknach mięśniowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Metody w tym badaniu zostały przeprowadzone w sposób etyczny zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.
1. Eksperymentalna procedura elektroporacji in vivo wiązki mięśniowej zginacza Digitorum Brevis (FDB) u myszy
- Zaprojektuj plazmidy do ekspresji in vivo przy użyciu promotora, o którym wiadomo, że ulega ekspresji w komórkach ssaków (np. wirus cytomegalii, CMV) lub w mięśniach (np. Mięśniowa kinaza kreatynowa, MCK) 6,7. Większe plazmidy mogą ulegać ekspresji na niższych poziomach. Promotor CMV był szeroko stosowany 6,7.
- Oczyść plazmidy z E. coli w warunkach wolnych od endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta. Rozpuść plazmid w sterylnym, wolnym od endotoksyn buforze TE w stężeniu 2 - 5 μg plazmidu/μl.
- Rozcieńczyć i podsycić plazmid do stężenia 20 μg DNA w 10 μl sterylnego buforu TE wolnego od endotoksyn (2 μg/μl) we wstrzyknięciu do sterylnej probówki do mikrowirówki. Przygotować jedną porcję na wstrzyknięcie.
- Rozcieńczyć zapas hialuronidazy do 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem bez wapnia i magnezu (PBS-/-), uzyskując końcowe stężenie 8 jednostek. Podaniec 10 μl rozcieńczonej hialuronidazy we wstrzyknięciu do sterylnej probówki do mikrowirówki.
- Znieczulij mysz za pomocą 2,5% izofluranu, aż do uspokojenia i braku reakcji na szczypanie ogona lub palca. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej lub stole grzewczym, aby utrzymać normalną temperaturę ciała.
- Oczyść podnóżek myszy, trzykrotnie nakładając naprzemiennie peeling jodowy powidonu i alkoholu, stosując technikę przygotowawczą pochodzącą z miejsca wkłucia igły i promieniującą na zewnątrz. Technika ta utrzymuje miejsce ukłucia igły w stanie aseptycznym, minimalizując wprowadzanie patogenów.
- Wstrzyknąć na poduszkę myszy 10 μl 1x roztworu hialuronidazy (2 mg/ml = 8 jednostek) między skórę a mięsień za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Hialuronidaza trawi składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, aby umożliwić bardziej efektywne wnikanie plazmidu do włókien mięśniowych. Wejdź u podstawy pięty i przesuń igłę w kierunku palców. Powoli uwalniaj płyn, gdy igła jest cofana. Miejsce wstrzyknięcia pod skórą rozszerzy się i zacznie zmieniać kolor na różowy.
- Powtórz kroki 1.6 i 1.7 na stopie przeciwległej.
- Odłącz znieczulenie i umieść mysz z powrotem w klatce. Pozwól myszy w pełni wyzdrowieć ze znieczulenia.
- Poczekaj 2 godziny.
- Powtórz procedury znieczulania i sterylizacji stóp, kroki 1.5 i 1.6.
- Wstrzyknąć rozcieńczone plazmidowe DNA do opuszki stopy w taki sam sposób, jak hialuronidazę. Upewnij się, że maksymalna objętość wynosi 20 μl lub mniej. W przypadku ekspresji podwójnego plazmidu wstrzyknąć 20 μg każdego plazmidu o maksymalnej objętości 20 μl lub mniejszej.
- Powtórzyć wstrzyknięcie plazmidu na przeciwległą opuszkę stopy lub użyć stopy przeciwległej do wstrzyknięć kontrolnych.
- Na stopie, której początkowo wstrzyknięto, należy odsunąć skórę od mięśnia podskórnego za pomocą cienkich kleszczy i umieścić jedną igłę 27 G przez kulki skóry w pobliżu palców u nóg w pozycji prostopadłej do linii gojenia się palca stopy. Weź drugą sterylną igłę 27 G i umieść ją poziomo przez skórę na pięcie. Igły układać równolegle do siebie w odległości ~1 cm od siebie.
- Za pomocą zacisków krokodylkowych zaciśnij elektrody do równoległych igieł, upewniając się, że igły nie stykają się ze sobą. Użycie plasteliny może zabezpieczyć zaciski na miejscu.
- Podłącz elektrody do stymulatora elektrycznego.
- Naelektryzuj mięsień, stosując 20 impulsów o czasie trwania 20 ms/każdy, przy 1 Hz, przy 100 V/cm. Palce u nóg mogą drgać podczas stymulacji.
- W razie potrzeby powtórz procedurę stymulacji na stopie przeciwległej.
- Usuń igły. Przetrzyj podnóżek peelingiem jodowym powidonu.
- Wyłącz znieczulenie. Umieść mysz z powrotem w klatce odzyskiwania i monitoruj aktywność. Jeśli zabieg został przeprowadzony zgodnie z oczekiwaniami, zwierzę powinno odzyskać normalne poruszanie się w ciągu 30 minut i nie wykazywać różnicy w poruszaniu się lub poziomie aktywności w porównaniu z zachowaniem przed wstrzyknięciem. W związku z tym nie są potrzebne żadne pozabiegowe leki przeciwbólowe. Po wyzdrowieniu zwierzę należy umieścić w salwie wiwium.
Uwaga: Ekspresję białka można oznaczyć już po 48 godzinach od elektroporacji. Jednak, aby umożliwić pełniejszą regenerację po elektroporacji, preferujemy izolację i badanie włókien mięśniowych 7 - 14 dni po elektroporacji 10. Ekspresję można oznaczyć nawet 4 tygodnie po elektroporacji.
2. Eksperymentalna procedura izolacji włókien Flexor Digitorum Brevis (FDB)
- Rozmrozić kolagenazę. Dla każdej wiązki FDB przygotuj dwie studzienki na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Do jednego dołka dodać 1 ml wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagles z albuminą surowicy bydlęcej (DMEM + BSA), a do drugiego dołka dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu Ringera. Dodatkowo dodaj świeże 10 ml roztworu 1x Ringers do naczynia Sylgard 35 mm.
- Zwierzę należy złożyć w ofierze poprzez wdychanie CO2 lub gazu znieczulającego, a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub inną metodę w celu zapewnienia śmierci.
- Zdejmij tylne stopy powyżej stawu skokowego za pomocą czystej żyletki i zanurz w 1x roztworze Ringers w naczyniu Sylgard 35 mm.
- Przypnij mocno jedną stopę, podeszwą skierowaną do góry, do szalki Sylgard za pomocą igieł 30 G przez każdy z 5 końcówek palców i przy kostce.
- Zaczynając od kostki, odetnij skórę prosto z boku stopy wzdłuż linii włosów w kierunku palców u stóp, uważając, aby nie naciąć mięśnia pod skórą. Powtórz po drugiej stronie stopy.
- Trzymając skórę u podstawy kostki cienkimi kleszczami, przetnij skórę w poprzek pięty.
- Unosząc płat skóry za pomocą kleszczy, skieruj nożyczki w stronę skóry, aby nie naciąć mięśnia. Odetnij leżącą poniżej tkankę łączną, skutecznie usuwając skórę.
- Aby usunąć pęczek mięśniowy FDB, przetnij duże ścięgno na pięcie, aby uwolnić ścięgno od kości. Trzymając ścięgno kleszczami, odetnij pęczek FDB od dużego białego ścięgna, ostrożnie usuwając nożyczkami tkankę łączną przyczepioną do FDB. Jeśli zostanie to zrobione prawidłowo, pęczek z łatwością oderwie się od leżących pod nim ścięgien, odsłaniając jasne białe ścięgna prowadzące do poszczególnych palców. Przetnij FDB na ścięgnach w pobliżu palców, uwalniając wiązkę od stopy.
- Umieść cały pęczek mięśniowy w studzience zawierającej DMEM + BSA.
- Powtórz na stopie przeciwnej.
- Po wyizolowaniu wszystkich mięśni FDB, dodaj 100 μl kolagenazy do każdej studzienki zawierającej DMEM + BSA i mięśnie.
- Sprawdź powodzenie elektroporacji na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym przed trawieniem. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, można osiągnąć ponad 90% wydajność transfekcji.
- Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 10% CO2 przez około 1 godzinę. Czas inkubacji może się różnić w zależności od modelu i tła choroby oraz partii kolagenazy.
- Po 1 godzinie ostrożnie przenieś wiązkę FDB do studzienki zawierającej tylko roztwór Ringera.
- Rozetrzeć wiązkę FDB w studzience roztworem Ringersa za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odetnij koniec końcówki pipety czystą żyletką, tak aby wiązka mogła łatwo przejść przez końcówkę pipety. Delikatnie rozerwać mięsień (~15 razy), pozwalając wiązce przesuwać się w górę iw dół równolegle do końcówki. Nienaruszone włókna odpadną do roztworu Ringersa. Kiedy włókna nie spadają łatwo z wiązki, umieść mięsień z powrotem w roztworze kolagenazy.
- Ułóż izolowane włókna na naczyniu ~ 500 μl na płytkę.
- Pozwól mięśniom trawić się w studzienku przez 15 minut.
- Powtarzaj kroki od 2.15 do 2.17, aż wiązka zmniejszy swój rozmiar i większość włókien zostanie oddzielona od wiązki (zwykle w sumie 2-3 razy). Po dysocjacji mięsień łatwo przechodzi przez końcówkę pipety o pojemności 1 ml.
- Pozwól włóknom przylgnąć do naczynia przez co najmniej 15 minut. Świeży roztwór Ringera można dodać do płytki w celu rozcieńczenia resztkowej kolagenazy lub zmienić w zależności od ograniczeń czasowych.
Uwaga: Włókna są teraz gotowe do obrazowania.
3. Eksperymentalna procedura wizualizacji uszkodzeń błon indukowanych laserem za pomocą mikroskopii konfokalnej
- Załaduj włókna bezpośrednio przed obrazowaniem 300 μl 2,5 μM FM 1-43 barwnika FM 4-64 w roztworze Ringera. Ogólnie rzecz biorąc, światłowody obrazują się od 15 minut do 2 godzin po izolacji. Jednak włókna można obrazować do 24 godzin po izolacji.
- Umieść szklaną dolną miskę na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w laser UV i obiektyw 60X / 63X.
- Zlokalizuj włókno. Upewnij się, że włókno jest mocno przymocowane do naczynia, dotykając podstawy mikroskopu. Wyklucz włókna, które zostały uszkodzone w procesie dysocjacji. Uszkodzone włókna mogą zawierać pęcherzyki błonowe, wchłaniać wysoki poziom barwnika FM, intensywnie się zwijać lub zginać.
- Aby wywołać uszkodzenie błony na włóknie, umieść sarkolemmę w środku okienka obrazowania z polem wolnym od jąder. Skoncentruj się na sarkolemmie za pomocą kanału barwnika FM tak, aby sarkolemma była wyjątkowo ostra.
- Umieść celownik ROI na sarkolemmie za pomocą kanału FM 4-64.
- Naświetlić 1 punkt piksela przy mocy 80% przez 3 sekundy (obszar ~ 350 nm x 350 nm). Barwnik FM dostanie się do komórki w miejscu urazu. Moc i czas można dostosować, aby zwiększyć lub zmniejszyć obszar zniewagi.
- Rób obrazy światłowodu przed uszkodzeniem, w momencie uszkodzenia, co 2 sekundy po uszkodzeniu, a następnie co 10 sekund przez maksymalnie 5 minut. Czas można dostosować w zależności od potrzeb. Poszczególne obrazy można konwertować na filmy poklatkowe w programie Image J.
- Powtórz kroki od 3.3 do 3.7 na maksymalnie 3 włóknach na naczynie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Elektroporacja jest małoinwazyjną techniką, która pozwala na wydajne wprowadzenie oczyszczonego plazmidowego DNA do pęczka mięśnia zginacza krótkiego palców (FDB) (Rysunek 1A). Siedem dni po transfekcji białko znakowane fluorescencyjnie jest wizualizowane w wyizolowanych włóknach mięśniowych (Rysunek 1B). Wyizolowane włókna są następnie wysiewane i przygotowywane do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. Włókna mogą zostać poddane uszkodzeniu indu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowanie elektroporacji do badania fluorescencyjnie znakowanych białek in vivo idealnie nadaje się do badania mięśni, biorąc pod uwagę brak odpowiednich modeli linii komórkowych, które wiernie odwzorowują całą strukturę komórkową mięśni. Protokół ten opisuje wykorzystanie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zapewnienia szczegółowego obrazowania lokalizacji i translokacji białek po zranieniu laserowym. Metodę tę można dostosować do badania innych procesów komórkowych, w t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health NS047726, NS072027 i AR052646.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Pożywka preparacyjna Rozcieńczenie: 50 ml +100 g |
| kolagenazy BSA, typ II | Life Technologies | 17101-015 | Trawienie błonnika Rozcieńczenie: 160 mg / 4 ml DMEM (podwielokrotność 40 mg/ml) |
| Naczynia 12-dołkowe | Falcon Fisher Scientific | 877229 | Roztwór |
| Ringers do trawienia błonnikaTrawienie i obrazowanie błonnika Rozcieńczenie: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH 7,4 cala H2O | |||
| 1 ml Pipety | Axygen | T-1000-C-R | Żyletki do wytrawiania |
| Personna | 94-120-71 | Digestion | |
| Precision Glide 30 G Igła | BD Biosciences | 305128 | Rozwarstwienie |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Rozwarstwienie |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | preparacyjne |
| FST firmy Dumont | #5/45 | preparacyjne | |
| Roboz | RS-4913 | ||
| Nożyczki | World Precision Instruments | 500260 | Rozwarstwienie |
| BSA | Sigma | A7906 | Pożywka preparacyjna Rozcieńczenie: 100 mg/50 ml Szalki DMEM |
| Falcon 60 mm | Fisher Scientific | 08772B | Rozwarstwienie - służy do trzymania |
| elektroporacji | z gliny | ||
| Trawa | s88x | Zaciski do elektroporacji | |
| Radio Shack | 270-356 | Elektroporacja | |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Elektroporacja |
| Precyzyjny ślizg 27 G Igła | BD Biosciences | 305136 | Symulator elektroporacji |
| Trawa | SIU-V | ||
| Gaza | Covidien | 2146 | Elektroporacja |
| Hialuronidaza | Sigma | H4272 | Iniekcja Rozcieńczenie: Dodaj 160 ul PBS (1x) do 40 i mikro; l 5x magazynowa |
| strzykawka insulinowa 1 cc U-100 (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Rurki |
| iniekcyjne Eppendorf | Fisher Scientific | 02-682-550 | Wtrysk |
| 35 mm szklane dno Miska Microwell | MaTek | P35G-1.5-14-C | Mikroskopia |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Mikroskopia Rozcieńczenie: Końcowe 2,5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Mikroskopia< Br / > Rozcieńczenie: Końcowe 2,5 ug / ml |
| Endotoksynowy zestaw Maxi do plazmidu | Qiagen | 12362 | Oczyszczanie plazmidu |
Bibliografia
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34(2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
