Artykuł metodologiczny

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

DOI:

10.3791/53568

⸱

28 grudnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuka produkcji białek rekombinowanych ze złożonymi modyfikacjami potranslacyjnymi stanowi główne wyzwanie dla badań nad strukturą i funkcją. Szybkie tworzenie się i wysoki powrót do zdrowia po przejściowo transfekowanych liniach komórkowych ssaków rozwiązuje tę barierę i jest skutecznym sposobem ekspresji białek, które są naturalnie kierowane przez szlak wydzielniczy za pośrednictwem ER i Golgiego. Oto jeden z protokołów ekspresji białek przy użyciu ludzkich linii komórkowych HEK293F i HEK293S transfekowanych wektorem ekspresyjnym ssaków zaprojektowanym w celu uzyskania wysokiej wydajności białka. Możliwość zastosowania tego systemu wykazano przy użyciu trzech reprezentatywnych glikoprotein, które ulegały ekspresji z wydajnością między 95-120 mg oczyszczonego białka odzyskanego na litr hodowli. Białka te to ludzka FcγRIIIa i szczurza α2-6 sjalilotransferaza, ST6GalI, obie ulegające ekspresji z N-końcową fuzją GFP, a także niezmodyfikowana ludzka immunoglobulina G1 Fc. Ten solidny system wykorzystuje pożywkę niezawierającą surowicy, która jest przystosowana do ekspresji izotopowo wzbogaconych białek i węglowodanów do badań strukturalnych z wykorzystaniem spektrometrii mas i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Co więcej, skład N-glikanu można dostosować, dodając małą cząsteczkę, aby zapobiec niektórym modyfikacjom glikanów w sposób, który nie zmniejsza wydajności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja wysokiej wydajności odpowiednio złożonych i zmodyfikowanych potranslacyjnie ludzkich białek do szczegółowej analizy struktury i funkcji pozostaje znaczącym wyzwaniem. Dostępna jest duża liczba systemów ekspresji, które wytwarzają rekombinowane białka o natywnej funkcji i zachowaniu. Bakteryjne systemy ekspresji, głównie szczepy Escherichia coli, stanowią najbardziej dostępne i powszechnie stosowane narzędzia na arenie badawczej, ze względu na prostotę tych systemów ekspresji, chociaż opisano również systemy drożdżowe, roślinne, owadzie i ssacze1-4. Jednak większość tych systemów nie jest zdolna do odpowiedniej modyfikacji potranslacyjnej białek docelowych. Podstawowym zainteresowaniem laboratoriów Barb i Moremen jest wytwarzanie białek eukariotycznych o odpowiedniej glikozylacji. Wiele ludzkich białek wymaga odpowiedniej glikozylacji do prawidłowego funkcjonowania (patrz5).

Maszyneria glikozylacji eukariotycznej jest rozległa i zdolna do dokonywania różnorodnych modyfikacji, w tym zarówno asparaginy(N)- jak i seryny/treoniny(O) kompleksu glikanów6. Szacuje się, że >50% ludzkich białek to N-glikozylowane7. Glikany są niezbędnymi składnikami wielu białek, w tym terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych, erytropoetyny i czynników krzepnięcia krwi, takich jak czynnik IX, by wymienić tylko kilka. Chociaż istnieje wiele metod odpowiedniego przygotowania białek N-glikozylowanych i wahają się od czysto syntetycznych8-10 do chemoenzymatycznych11-14 lub odzyskiwania z inżynieryjnych systemów rekombinowanych15-20, nie jest zaskoczeniem, że ludzkie systemy ekspresji okazały się do tej pory najbardziej niezawodnymi metodami wytwarzania ludzkich białek.

Wiele terapeutycznych ludzkich glikoprotein jest wytwarzanych w systemach rekombinowanych przy użyciu komórek ssaków. Na uwagę zasługują następujące źródła: jajnik chomika chińskiego (CHO), szpiczak myszy (NS0), nerka chomika (BHK), nerka zarodkowa człowieka (HEK-293) oraz linie komórkowe siatkówki ludzkiej, które są wykorzystywane w hodowli adhezyjnej lub zawiesinowej do produkcji białek4,21,22. Jednak systemy ekspresji białek ssaków wymagały wytworzenia stabilnych linii komórkowych, drogich pożywek wzrostowych i procedur transfekcji wspomaganej substratem23.

Transfekcja komórek ssaków jest osiągana za pomocą licznych czynników, w tym fosforanów wapnia24,25, polimerów kationowych (DEAE-dektran, polibrenu, polilizyny, polietylenoaminy (PEI)) lub dodatnio naładowanych liposomów kationowych26-29. PEI jest polikationowym, naładowanym, liniowym lub rozgałęzionym polimerem (25 kDa)26, który tworzy stabilny kompleks z DNA i jest endocytozowany. Uważa się, że po zakwaszeniu endosomu PEI pęcznieje, co prowadzi do pęknięcia endosomów i uwolnienia DNA do cytoplazmy26,30.

Do niedawna, transfekcja przejściowa w hodowli zawiesinowej była przeprowadzana przez wcześniejsze tworzenie kompleksu DNA/PEI, a następnie dodawanie do hodowli komórkowej29. Jednak Würm i współpracownicy opisali wysoce wydajny protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji rekombinowanych białek w komórkach HEK293, które utworzyły kompleks DNA/PEI in situ31,32. W ten sposób uniknięto przygotowania, sterylizacji kompleksu i wymiany buforu na pożywkę hodowlaną. Dalsza optymalizacja poprzez włączenie plazmidów zwiększających ekspresję doprowadziła do znacznego wzrostu plonów33. Jest to metoda, która opiera się na tych postępach i ma szerokie zastosowanie. Warunki ekspresji mogą być również zmienione w celu wpłynięcia na skład N-glikanów.

Linia komórkowa HEK293S, z delecją genu, która zatrzymuje przetwarzanie N-glikanów na etapie pośrednim, prowadzi do ekspresji białek o jednolitych N-glikanach składających się z 2 reszt N-acetyloglukozaminy plus pięć reszt mannozy (Man5GlcNAc2)34,35. Komórki te nie mają genu N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GntI), który jest wymagany do dalszego przetwarzania N-glikanów36,37. Stosowanie inhibitorów glikozylotransferazy, w tym kifunenzyny, analogów kwasu sjalowego oraz analogu fukozy i 2-deoksy-2-fluoro-fukozy ma podobne efekty i ogranicza przetwarzanie N-glikanów38-41.

Protokół opisany tutaj wykorzystuje wektor pGEn2, jak pokazano na rysunku 142,43, transfekcję przejściową wspomaganą przez PEI do linii komórek ssaków (HEK293F lub HEK293S komórek) oraz odzyskiwanie wysokich plonów odpowiednio glikozylowanego białka. System ten jest solidny i może uwzględniać różne czynniki, w tym znakowanie izotopowe i inżynierię glikanów w celu produkcji dużych mian białek rekombinowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest wystarczający do wyrażania przy użyciu komórek HEK293F lub HEK293S.

1. Założenie komórki

  1. Inokulacja kultur
    Uwaga: Wszystkie procedury manipulacji kulturami muszą być przeprowadzane w obiekcie BSL-2, a każdy przedmiot wniesiony do szafy bezpieczeństwa biologicznego musi zostać wysterylizowany przez spryskanie 70% etanolem w roztworze wodnym.
    1. Wytrząsarkę inkubatora należy uruchomić przy 135 obr./min, wilgotności 80% i przy 8.0% CO2 i temperaturze 37 °C. Włączyć lampę UV w szafie bezpieczeństwa biologicznego co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem pracy. Szczelnie zamknięte butelki Medium A i Medium B należy podgrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Wysterylizuj 125 ml kolby wzrostowe Erlenmeyera z wentylowaną nakrętką, pipetami, pipetami i wstępnie podgrzanymi butelkami z pożywką, spryskując 70% etanolem w roztworze wodnym. Umieść te przedmioty w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Uwaga: Sterylizować tylko zewnętrzną folię przykrywającą kolbę hodowlaną Erlenmeyera o pojemności 125 ml, a następnie wyjmować tylko wtedy, gdy znajduje się ona w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    3. W przypadku 30 ml kultury pobrać 26 ml pożywki A i 3 ml pożywki B (10% końcowej kultury) i przenieść do 125 ml kolby hodowlanej Erlenmeyera i delikatnie wymieszać przez wstrząsanie (zwane dalej świeżą pożywką hodowlaną).
    4. Przenieść jedną fiolkę z komórkami zawierającymi HEK293F komórek, zamrożoną w temperaturze -80 °C, na lód i przenieść do pomieszczenia hodowlanego. Uwaga: HEK293F komórek jest dostarczanych w gęstości 1 x 107 komórek/ml.
    5. Delikatnie ogrzać fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby częściowo rozmrozić komórki (trwa to około jednej minuty i komórki nie powinny być całkowicie rozmrożone). Wysterylizuj zewnętrzną część fiolki 70% etanolem w roztworze wodnym i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać zawiesinę komórek (około 0,7 ml) i przenieść do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml zawierającej 29 ml świeżej pożywki hodowlanej. Zamknąć pokrywę kolby hodowlanej i przenieść ją do inkubowanego wytrząsarki.
  2. Konserwacja komórek: sprawdź gęstość komórek, żywotność i pasaże komórkowe
    1. Sprawdź gęstość komórek po 24 godzinach od rozmrożenia kultury, postępując zgodnie z poniższym protokołem. Uwaga: Komórki są hodowane przez 24 godziny po rozmrożeniu, aby zapewnić niezbędny wzrost komórek i żywotność >80%.
    2. Wysterylizuj kolbę hodowlaną 70% etanolem w roztworze wodnym i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Za pomocą pipety i pipetora o pojemności 1 ml powoli pobrać 100 μl kultury zawiesinowej i przenieść do sterylnej probówki eppendorfa o pojemności 0,5 ml. Zamknąć i przenieść kolbę hodowlaną z powrotem do wytrząsarki tak szybko, jak to możliwe.
    4. Wymieszaj 7,5 μl roztworu błękitu trypanowego z 7,5 μl komórek. Wymieszać energicznie z 7,5 μl mieszaniny komórki/błękitu trypanowego i przenieść na szkiełko liczące.
    5. Włącz automatyczny licznik komórek i umieść szkiełko zliczające w komorze załadowczej. Automatyczny czytnik jest aktywowany, a komórki są automatycznie liczone w jednostkach liczby komórek na ml i procentowej żywotności
    6. Oznaczyć objętość kultury dawcy wymaganą do przeniesienia na świeżą pożywkę hodowlaną przy gęstości komórek 0,3 x 106 żywych komórek/ml.
      Uwaga: Zobacz przykładowe obliczenia w sekcji Materiały dodatkowe.
    7. Powtórzyć kroki 1.1.2 i 1.1.3 protokołu "1.1 Inokulacja kultur" powyżej, aby przygotować materiały wymagane do świeżej pożywki hodowlanej.
    8. Przenieść pożywkę A (23 ml) i pożywkę B (3 ml) do świeżej kolby hodowlanej o pojemności 125 ml. Wyjąć butelki magazynowe Medium A i Medium B z szafy bezpieczeństwa biologicznego.
      Uwaga: Zapasy butelek z pożywką nie powinny być przechowywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w tym samym czasie, co ogniwa HEK 293F. Ogranicza to możliwość zanieczyszczenia butelek z podłożem wyjściowym.
    9. Wyjmij hodowlę komórkową HEK293 z inkubatora i spryskaj 70% etanolem w roztworze wodnym. Za pomocą nowej pipety pobrać podwielokrotność komórek (4 ml, objętość ta została oznaczona zgodnie z krokiem 1.2.6) z kultury i przenieść ją do kolby zawierającej świeżą pożywkę hodowlaną.
    10. Przenieść obie kultury z komory bezpieczeństwa biologicznego do zestawu wytrząsarki inkubatora zgodnie z ppkt 1.1.1. Hoduj komórki do przybliżonej gęstości 2-3 x 106 żywych komórek/ml.
      Uwaga: Przybliżony czas podwajania komórek wynosi 32 godziny. Osiągnięcie tej gęstości zajmie 3-4 dni. Inkubuj komórki przez 3-4 przejścia, aby uzyskać stabilny wzorzec wzrostu komórek przed pierwszą transfekcją.

2. Przygotuj materiały do transfekcji

  1. Przygotowanie komórek HEK293 (dzień 1)
    1. Subkultura komórek do gęstości 1 x 106 komórek/ml w świeżej pożywce B 24 godziny przed transfekcją zgodnie z etapem 1.2.
      Uwaga: objętość kultury transfekcyjnej będzie zależała od liczby komórek. Większe objętości transfekcji (>20 ml) będą wymagały na tym etapie większej objętości hodowli.
  2. Przygotowanie zapasów materiałów
    1. Przygotować roztwór podstawowy liniowej polietyleneniminy (PEI) o stężeniu 1 mg/ml w buforze zawierającym 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 150 mM NaCl (pH 7,5). Całkowicie rozpuść PEI; może to zająć 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Wysterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego użytkowania.
    2. Przygotować sterylne plazmidowe DNA (zgodnie z krokami 2.2.2.1-2.2.2.4). Procedura budowy plazmidu jest opisana w innym miejscu42. Krótka procedura przygotowania DNA jest wyjaśniona tutaj:
      1. Hodować kulturę chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli przekształconych za pomocą wektora pGEn2 w 1 l pożywki LB (trypton - 10 g / L, ekstrakt drożdżowy - 5 g / L i chlorek sodu - 10 g / L) uzupełnionych 100 μg / ml ampicyliny. Bakterie E. coli hoduje się w temperaturze 37 °C w nienawilżanym inkubatorze z wytrząsaniem.
      2. Oczyść wektor pGEn2 kodujący docelowe plazmidowe DNA zgodnie z protokołem oczyszczania DNA producenta.
      3. Aby zapewnić całkowitą sterylność plazmidowego DNA, należy przeprowadzić końcowe etapy wytrącania i ponownego zawieszania izopropanolu w procedurach ekstrakcji DNA w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      4. Dodać objętość izopropanolu (określoną w zestawie do przygotowania plazmidu) do eluowanego DNA i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut. Wysterylizować zewnętrzną część pojemnika DNA 70 % etanolem w roztworze wodnym i przenieść go do komory bezpieczeństwa biologicznego. Wyrzucić supernatant izopropanolu za pomocą pipety i wysuszyć osad DNA na powietrzu. Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad w sterylnym 10 mM buforze Tris, pH 8,0.
    3. Przygotować roztwór podstawowy 220 mM kwasu walproinowego (VPA) w wodzie i sterylizować, przechodząc przez sterylny filtr 0,22 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

3. Ustanawianie transfekcji przejściowej

  1. Transfekcja (dzień 0)
    1. Sprawdź gęstość komórek, wykonując kroki od 1.2.2 do 1.2.5 z "1.2. Konserwacja komórki" powyżej. Określić ilość komórek do transfekcji (2,5-3,0 x 106 żywych komórek/ml o żywotności >95%). Zobacz przykładowe obliczenia w Materiałach uzupełniających.
    2. Objętość komórek hodowli zawiesiny obliczoną w poprzednim kroku (tutaj 67 ml) przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 5 minut przy 100 x g.
    3. W międzyczasie należy przygotować świeżą pożywkę do transfekcji, postępując zgodnie z krokiem 1.1.3 zgodnie z "1.1. Inokulacja kultur" powyżej. Zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi, aby zapoznać się z przykładowymi obliczeniami. Przenieść również 5 ml świeżej pożywki hodowlanej do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odstawić na bok.
    4. Przenieść probówki zawierające granulowane komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego po wysterylizowaniu zewnętrznej części probówek 70% etanolem w roztworze wodnym i użyć sterylnej pipety do zdekantowania supernatantu składającego się ze zużytej pożywki hodowlanej.
    5. Energicznie zawiesić granulowane komórki, pipetując w górę i w dół przy użyciu 10 ml świeżej pożywki hodowlanej i przenieść do kolby ze świeżą pożywką do hodowli transfekcyjnej (przygotowaną w kroku 3.1.3 powyżej). Nakręcić nakrętkę na wentylowaną kolbę do hodowli komórkowej i przenieść kolbę do inkubatora (jak ustawiono w ppkt 1.1.1) na 15 minut do 1 godziny z wytrząsaniem.
    6. W tym czasie rozcieńczyć plazmidowe DNA i PEI za pomocą świeżej pożywki hodowlanej (używając 5 ml objętości pobranej z kroku 3.1.3 powyżej) do końcowego stężenia 0,5 μg/μl. Zobacz przykładowe obliczenia w Materiałach uzupełniających, aby określić ilość DNA i PEI. Przenieść kolbę hodowlaną z rozproszonymi komórkami do komory bezpieczeństwa biologicznego.
    7. Dodać plazmidowe DNA (300 μl z 0,5 μg/μl) do kultury za pomocą mikropipety i wymieszać przez delikatne ręczne potrząsanie. Dodaj PEI (900 μl z 0,5 μg/μl) do kultury, wymieszaj delikatnie wstrząsając. Dodać 3,8 ml świeżej pożywki hodowlanej, z etapu 3.1.3 powyżej, i przenieść kolbę do wytrząsarki inkubatora na 24 godziny.
    8. Wyczyść komorę bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z krokiem 1.1.
  2. Rozcieńczenie (dzień 1) (dla objętości transfekcji 50 ml)
    1. Inkubować transfekowaną kulturę przez 24 godziny.
    2. Pobrać 1 ml wstępnie podgrzanego 220 mM kwasu walproinowego (VPA; przygotowanego zgodnie z krokiem 2.2.3.) za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 1 ml i przenieść go do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Pobrać 5,0 ml podgrzanej pożywki B i 44 ml podgrzanej pożywki A i dodać je do roztworu VPA za pomocą sterylnej pipety serologicznej, aby przygotować 50 ml świeżej pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 4,4 mM VPA.
    4. Po wysterylizowaniu zewnętrznej części kolby roztworem 70% etanolu w roztworze wodnym przenieść transfekowaną kulturę do komory bezpieczeństwa biologicznego, dodać przygotowaną pożywkę rozcieńczającą i przenieść kolbę z powrotem do inkubowanego wytrząsarki.
  3. Ekspresja i żniwa (dni 2-6)
    1. Inkubuj komórki przez dodatkowe 4-5 dni (łącznie 5-6 dni od transfekcji).
    2. Pobrać podwielokrotności pożywki zgodnie z krokami 1.2.2-1.2.5 opisanymi w "1.2. Cell Maintenance" powyżej przy użyciu sterylnej pipety serologicznej o pojemności 1 ml, w celu monitorowania żywotności komórek i zapisywania podwielokrotności do analizy ekspresji białek każdego dnia za pomocą SDS-PAGE (patrz sekcja 5 poniżej).
    3. Zebrać komórki po 5-6 dniach, odwirowując komórki wraz z podłożem w ilości 1 000 g przez 5 minut. Dodatkowo, jeśli żywotność komórek spadnie poniżej 50%, należy zebrać supernatant (patrz kroki 1.2.2-1.2.5).
    4. Odlej supernatant, który będzie zawierał wydzielane białko. Dodaj 5 ml 10% wybielacza do osadu komórek HEK i wyrzuć jako zagrożenie biologiczne.

4. Oczyszczanie białek

  1. Przygotować kolumnę z 5 ml sefarozy Protein-A. Zrównoważyć kolumnę z 5 objętościami buforu A (20 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCl).
  2. Odwirować zebrany supernatant z wyrażonym białkiem z dużą prędkością (14 000 g przez 10 minut) w celu usunięcia wszelkich pozostałych resztek komórkowych. Zbierać, dekantując do świeżej tuby. Wyrzuć granulki jako zagrożenie biologiczne.
  3. Pobrać 10 μl podwielokrotności supernatantu i dodatkowo pobrać małą próbkę na każdym etapie oczyszczania białka w celu analizy próbki za pomocą SDS-PAGE (opisanej w sekcji 5). Załadować oczyszczony supernatant i zebrać przez niego przepływ.
  4. Przemyć kolumnę 3-kolumnowymi objętościami buforu A i wymyć białko 5-kolumnowymi objętościami 100 mM glicyny o pH 3,0. Zebrać eluat w probówkach zawierających połowę objętości 1 M buforu TRIS o pH 8,0 w celu szybkiego zneutralizowania pH.
  5. Umyj kolumnę 10 objętościami buforu A i przechowuj do wykorzystania w przyszłości.
  6. Wymiana buforowa eluowanego białka z co najmniej 10-krotnym nadmiarem buforu A przy użyciu filtrów odśrodkowych o masie cząsteczkowej 10 kDa. Uwaga: Nie należy zagęszczać eluowanej próbki do bardzo małej objętości (<2 ml) w eluowanym buforze. Użyj filtrów odśrodkowych, aby wymienić bufor na bufor A.
  7. Oczyszczone białko przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego użycia.
    Uwaga: Białko wyrażone w supernatance może być oczyszczone za pomocą kolumn powinowactwa dobranych na podstawie właściwości białka lub przy użyciu znaczników powinowactwa. W typowej procedurze oczyszczania kolumna białka A może być używana do fragmentów IgG lub Fc lub kolumna niklowa może być używana do białek wyrażanych za pomocą znacznika polihistydynowego. Oto opis etapów oczyszczania IgG1-Fc przy użyciu kolumny białka A.

5. Analiza białka za pomocą SDS-PAGE

  1. Rozcieńczyć podwielokrotności (7,5 μl) każdej próbki równą objętością 2x buforu ładującego (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-merkaptoetanolu, 20% glicerolu i 0,01% błękitu bromofenolowego).
  2. Gotować mieszaninę w temperaturze 90 °C przez 5 minut, używając bloku grzewczego lub łaźni wodnej. Odwirować próbki o masie 10 000 g przez 1 minutę. Do przygotowanego żelu należy załadować 5 μl białka znacznikowego i 14 μl próbek do analiz za pomocą pipety o pojemności 20 μl z jednorazową końcówką.
  3. Uruchom jeden żel przy natężeniu 25 miliamperów przez 60 minut. Po zakończeniu etapu elektroforezy przenieś żel do pojemnika z 1 litrem wody i mikrofalówki na 5 minut.
  4. Zabarwić żel roztworem barwiącym (40% etanolu, 10% kwasu octowego i 0,1% błękitu brylantowego coomassie) przez 2 godziny i odbarwić w wodzie.

6. Analiza glikanów za pomocą spektrometrii mas

  1. Analizuj glikany zgodnie z wcześniejszym opisem44. Krótko mówiąc, 75 μg IgG1-Fc poddano trypsynizacji, a następnie potraktowano PNGaseF w celu uwolnienia glikanów45. Uwolnione glikany poddano permetylacji i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOFMS).

7. Poprawki protokołu dla specjalnych scenariuszy

  1. Znakowanie białek za pomocą 15aminokwasów znakowanych N (dla objętości transfekcji 50 ml)
    1. Dozować 5 mg każdego aminokwasu do jednej sterylnej szklanej fiolki. Zawiesić ponownie w 4 ml autoklalawowanej wody (uwaga: Tyr nie rozpuszcza się całkowicie, w przeciwieństwie do Lys i Phe). Wysterylizować roztwór przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury około 50-60 °C.
    2. W przypadku transfekcji o objętości 50 ml należy postępować zgodnie z krokiem 3.1.3 zgodnie z "3.1 Ustanawianie transfekcji przejściowej". Zapoznaj się z sekcją Materiały uzupełniające, aby zapoznać się z przykładem z odpowiednimi woluminami.
    3. Aby wykonać transfekcję, wykonaj czynności opisane w "3. Ustanawianie transfekcji przejściowej" przy użyciu świeżej pożywki hodowlanej podstawionej znakowanymi resztami aminokwasowymi, jak przygotowano powyżej.
    4. Po 24 godzinach od transfekcji, w dniu rozcieńczenia hodowli, pobrać 5,0 ml wstępnie podgrzanej pożywki B, 40 ml podgrzanej pożywki A i świeżo autoklawowaną 4 ml podwielokrotności mieszaniny aminokwasów (przygotowanej jak w kroku 7.1.1 powyżej) i dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu podstawowego roztworu VPA w celu przygotowania 50 ml świeżej pożywki hodowlanej do rozcieńczania o końcowym stężeniu 4,4 mM VPA. Dodać tę pożywkę do kultury transfekcyjnej za pomocą sterylnej pipety serologicznej.
    5. Przenieść transfekowaną kulturę do komory bezpieczeństwa biologicznego po wysterylizowaniu zewnętrznej części kolby 70% roztworem etanolu w wodzie, dodać przygotowane podłoże rozcieńczające i przenieść kolbę z powrotem do inkubowanego wytrząsarki.
      Uwaga: Medium A to chemicznie zdefiniowane podłoże bez surowicy. W ten sposób możliwe jest przygotowanie innego preparatu. Skontaktuj się z dostawcą, aby uzyskać niestandardowy preparat Medium A, który nie zawiera niektórych aminokwasów. Możliwe jest pominięcie wszystkich aminokwasów, jednak wolimy używać pożywki, która nie zawiera tylko kilku wybranych reszt, ponieważ kompletna pożywka dropout wymagałaby dostosowania osmolarności po suplementacji. Wybraliśmy pożywkę Lys-Tyr-Phe, która może być suplementowana i nie wymaga regulacji osmolarności. Ponadto dostawca medium A nie dzieli się swobodnie stężeniami składników medium; z powodzeniem stosowaliśmy po 100 mg / L dla Lys, Tyr i Phe. Objętość pożywki do transfekcji i ekspresji musi być dostosowana w celu uwzględnienia dodanych aminokwasów. Poniżej przedstawiono zmiany w powyższym protokole dotyczące znakowania izotopów
  2. Uzupełnij transfekcję małą cząsteczką
    1. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy 2-deoksy-2-fluoro-l-fukozy przy użyciu autoklalawowanej wody i wysterylizować ten roztwór za pomocą filtra 0,22 μM.
    2. W przypadku hodowli o objętości 50 ml dodać 125 μl (przy 250 μM) roztworu analogu fukozy do pożywki do transfekcji i rozcieńczania. Uwaga: Zaniedbaliśmy dalszą regulację objętości, ponieważ dodanie podstawnika w tym stężeniu stanowi tylko 0,25% całkowitej objętości kultury. Możliwa jest modyfikacja ekspresji za pomocą małocząsteczkowych inhibitorów przetwarzania glikanów. Tutaj opisujemy warunki włączenia 2-deoksy-2-fluoro-l-fukozy, inhibitora fukozylacji glikanów. Stwierdziliśmy >90% redukcję fukozylacji poprzez dodanie analogu fukozy w stężeniu 250 μM w pożywce do transfekcji i rozcieńczania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja i czystość białka na wysokim poziomie

Ten zoptymalizowany system ekspresji wygenerował wysoką wydajność glikozylowanych białek. Typowy wzór jest pokazany w ekspresji IgG1-Fc (ryc. 1). W tym przypadku dzień 0 jest dniem transfekcji, po którym następuje dzień 1 (rozcieńczenie) i kolejne dni hodowli, aż do dnia 5. Ekspresję białka analizuje się przy użyciu rozpuszczalnej frakcji ekspresji w pożywce surowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ilustruje ekspresję białek poprzez przejściową transfekcję komórek HEK293F lub S. Optymalne warunki transfekcji ustalone w laboratoriach Barb i Moremen wykorzystują krytyczną kombinację gęstości komórek i stężeń odczynników w celu osiągnięcia wysokiej wydajności transfekcji. Krytyczne kwestie związane z wdrażaniem tego protokołu obejmują: utrzymanie stabilnej kultury przed transfekcją (ze stałymi czasami podwajania hodowli); transfekcja aktywnie rosnących komórek (osiągana przez rozcieńczenie komórek do 1 × ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych w tym manuskrypcie.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była finansowana z grantów K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) i P01GM107012 (KWM) z National Institutes of Health, oraz z funduszy z Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biologii Molekularnej im. Roya J. Carvera na Uniwersytecie Stanowym Iowa. Za treść tej pracy wyłączną odpowiedzialność ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Klasa II, typ A2 Komora bezpieczeństwa biologicznego
Wytrząsarka inkubacyjnaINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 Podłoże bez Serum SIGMA14571C 
125 Kolba Erlenmeyera z wentylowaną nasadkąCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Kolba Erlenmeyera z wentylowaną nasadkąCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsTechnologiesR790-07
1 ml Jednorazowa pipeta serologicznaFisher Scietific13-676-10B
10 ml Jednorazowa pipeta serologicznaFisher Scietific13-676-10J
25 ml Jednorazowa pipeta serologicznaFisher Scietific13-676-10K
Pipetor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Solution Thermo Scientific SV30084.01
Zjeżdżalnie do liczenia Bio-Rad145-0011
TC20 Automatyczny licznik komórek Bio-Rad 145-0102
Polietyleninina (PEI)Polysciences Inc.23966Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w buforze zawierającym 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 150 mM NaCl (pH 7,5). Całkowicie rozpuść PEI; sterylizować przez 0,22 μ M strzykawkę przefiltrować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
Filtr strzykawkowy 25 mm, 0,22 μ MFisher Scietific09-719A
Trisaminometan (baza Tris)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Ekstrakt drożdżowyFluka Analytical 92144
Chlorek soduChemikalia BDHBDH8014
Zestaw do oczyszczania plazmiduQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Przygotować roztwór podstawowy 220 mM w wodzie, wysterylizować przez przejście przez sterylny filtr 0,22 mm i przechowywać w temperaturze -20 ° C
WirówkaThermo Scientific EW-17707-65
Kolumna białkowa A-SepharoseSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlicynaFisher ScietificBP381-500
10 kDa odcięcie masy cząsteczkowej Amicon® Filtry ultra odśrodkowe MilliporeUFC901096
Dodecylosiarczan soduALDRICHL3771
Beta-merkaptoetanolALDRICHM6250
GlicerolSIGMAG5516
Precision Plus Białko Wszystkie niebieskie standardyBio-Rad161-0373
Kwas octowy, lodowaty Fisher Scietific64-19-7
coomassie brylantowo niebieski Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N znakowane L-tyrozynaALDRICH332151
15N znakowane L-lizynaALDRICH592900
Nieznakowane L-fenyloalaninaSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-glukozaALDRICH389374
2- Deoksy-2-fluoro-L-fukoza SANTA CRUZ Biotechnologiasc-283123
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226(2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13(2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96(2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Tagi

Recombinant Protein ExpressionGlycoprotein PurificationSuspension CultureAffinity PurificationCell Density MonitoringVPA TreatmentProtein Yield AnalysisGlycan Modification

Powiązane artykuły