Artykuł metodologiczny

Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a)BSL-4: 2. Praktyki ogólne

DOI:

10.3791/53600

⸱

3 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Integrated Research Facility at Frederick, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzanie testów wirusowych w laboratorium BSL-4 jest bardziej skomplikowane w porównaniu do pracy w laboratorium BSL-2 ze względu na wymagane dodatkowe środki ostrożności. W tym miejscu przedstawiamy przegląd praktyk i procedur stosowanych w laboratorium BSL-4, ilustrujących prawidłowe użytkowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego klasy II, gospodarowanie odpadami/usuwanie ich oraz usuwanie próbek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium zabezpieczającym poziom bezpieczeństwa biologicznego 4 (BSL-4) wymaga czasu i dużej dbałości o szczegóły. Ta sama praca, która jest wykonywana w laboratorium BSL-2 z patogenami o niewysokich konsekwencjach, potrwa znacznie dłużej w warunkach BSL-4. Ten zwiększony wymóg czasowy wynika z wielu czynników, które mają na celu ochronę badacza przed infekcjami nabytymi w laboratorium, środowisko pracy przed potencjalnym zanieczyszczeniem, a społeczność lokalną przed możliwym uwolnieniem patogenów o poważnych konsekwencjach. Wewnątrz laboratorium ruch jest ograniczony ze względu na węże powietrzne przymocowane do obowiązkowych kombinezonów ochronnych na całe ciało. Ponadto wymagana jest dezynfekcja każdego przedmiotu, który jest usuwany z komór bezpieczeństwa biologicznego (BSC) klasy II. Specjaliści laboratoryjni muszą być przeszkoleni w zakresie praktyk laboratorium BSL-4 i muszą wykazywać się wysoką biegłością w umiejętnościach, które wykonują. Celem tego artykułu jest nakreślenie właściwych procedur i technik zapewniających laboratoryjne bezpieczeństwo biologiczne i dokładność eksperymentalną przy użyciu standardowego testu płytki wirusowej jako przykładowej procedury. W szczególności nacisk wizualny zostanie położony na właściwe techniki bezpiecznej pracy w środowisku BSL-4 podczas wykonywania eksperymentu. Techniki te obejmują: ustanowienie BSC klasy II do eksperymentów, właściwe czyszczenie BSC klasy II po zakończeniu pracy, gospodarowanie odpadami i bezpieczne usuwanie odpadów wytwarzanych w laboratorium BSL-4 oraz usuwanie inaktywowanych próbek z laboratorium BSL-4 do laboratorium BSL-2.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ bezpieczeństwo personelu laboratoryjnego zajmującego się patogenami o poważnych konsekwencjach (brak profilaktyki infekcji ani opcji leczenia) jest najważniejsze, Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych ustalił wytyczne dotyczące budowy obiektów i najlepszych praktyk dla bezpiecznego prowadzenia pracy z patogenami w laboratoriach biomedycznych i klinicznychz punktu widzenia bezpieczeństwa biologicznego1. Dzięki przepisom i regulacjom wiele praktyk i procedur stało się obowiązkowymi wymogami, których należy przestrzegać w przypadku pracy z tymi patogenami. W Stanach Zjednoczonych patogeny, które łatwo przenoszą się z człowieka na człowieka, powodują wysoką śmiertelność i/lub mogą mieć poważny wpływ na zdrowie publiczne i bioterroryzm, są klasyfikowane jako Narodowy Instytut Zdrowia / Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIH / NIAID) Priorytet A Patogeny i/lub Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) Czynniki bioterroryzmu kategorii A2. Ponadto patogeny o wysokich konsekwencjach są klasyfikowane jako czynniki selektywne poziomu 1, jeśli są potencjalnymi czynnikami bioterrorystycznymi, mają potencjał do masowych ofiar lub niszczycielskich skutków dla gospodarki, infrastruktury krytycznej lub zaufania publicznego3.

Operacje BSL-4, w tym dostęp do instytutów z laboratoriami BSL-4, są bardziej kontrolowane niż operacje BSL-2/3. Na przykład znacznie trudniej jest uzyskać dostęp do laboratorium BSL-4 w porównaniu z laboratorium BSL-2 lub BSL-3 ze względu na znaczne wymagania dotyczące szkolenia w zakresie kombinezonów, obszerne wymagania dotyczące mentoringu i dodatkowe wymagania wstępne dotyczące medycznego bezpieczeństwa biologicznego. Ponadto w obiekcie BSL-4 jest zazwyczaj więcej fizycznych barier bezpieczeństwa w porównaniu z obiektem BSL-2 lub BSL-34-6. Jak opisano w naszym pierwszym artykule na temat procedur wejścia i wyjścia BSL-4, personel laboratoryjny przechodzi intensywne szkolenie i badania psychologiczne, aby zakwalifikować się do przyjęcia do laboratoriumBSL-4 7. W laboratorium BSL-4 ryzyko infekcji i błędów jest unikane lub ograniczane poprzez przestrzeganie ustalonych procedur. Badania muszą przebiegać ostrożnie i celowo, z minimalną wielozadaniowością lub rozproszeniem uwagi. Schylanie się w skafandrach nadciśnieniowych jest trudne, a osłona twarzy może ograniczać zabiegi, takie jak mikroskopia. Nieporęczne rękawice utrudniają wykonywanie zadań motorycznych, takich jak przenoszenie małych przedmiotów lub etykietowanie probówek. Aby zminimalizować czas spędzony w laboratoriach BSL-4, specjaliści laboratoryjni powinni dokonać przeglądu procedur pracy w celu określenia kroków, które można wykonać z wyprzedzeniem w laboratorium BSL-2, a następnie przetransportować te materiały do laboratorium BSL-4 w celu wykonania zadania (zadań). Podczas usuwania materiałów do dalszej obróbki w laboratorium BSL-2, materiały są mocowane i usuwane z laboratorium BSL-4 w szczelnym pojemniku wtórnym. Przykłady próbek, które mogą wymagać usunięcia, obejmują: stałe płytki lub probówki z zakażonym materiałem, które będą analizowane za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), testu immunofluorescencyjnego (IFA) lub reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Oprócz większych ograniczeń fizycznych nakładanych przez środki ochrony osobistej wymagane w laboratoriach BSL-4 w porównaniu do tych w laboratoriach BSL-2, procedury inaktywacji patogenów o wysokich konsekwencjach na płytkach hodowli komórkowych i usuwania odpadów są bardziej rygorystyczne niż te wymagane dla mniej patogennych wirusów badanych w laboratorium BSL-2. Metody te powinny spełniać co najmniej wymagania CDC. Na przykład zanieczyszczone płytki do hodowli komórkowych i inne materiały mogą być inaktywowane odczynnikami chemicznymi, takimi jak formalina buforowana obojętnie. Poddane działaniu substancji płytki lub probówki do hodowli komórkowych umieszcza się w torebkach termozgrzewalnie zawierających formalinę i wyjmuje z laboratorium za pomocą zbiornika do zanurzania wypełnionego płynnym środkiem dezynfekującym. Wiadra na odpady wypełnione roztworami dezynfekującymi i środkami dezynfekującymi w sprayu służą do czasowego przyjmowania odpadów powstałych podczas eksperymentu oraz do dezynfekcji rękawic, czyszczenia powierzchni szaf bezpieczeństwa biologicznego i narzędzi. Czwartorzędowy roztwór dezynfekcyjny amoniowy o podanym stężeniu jest uważany za złoty standard dla wszystkich amerykańskich laboratoriów BSL-4 (Barr J, komunikacja osobista, 2015). Odpady stałe z wiadra na odpady są sterylizowane w autoklawie w celu wyeliminowania potencjalnego zanieczyszczenia.

Aby wizualnie zademonstrować przebieg pracy i ograniczenia ogólnych procedur BSL-4, użyliśmy standardowego testu płytki wirusowej jako przykładu powszechnie stosowanej procedury wirusowej. Chociaż procedura oznaczania wirusów jest opisana ogólnie, w niniejszym protokole kładziemy nacisk na procedury bezpieczeństwa biologicznego stosowane w celu zapewnienia bezpieczeństwa personelu laboratoryjnego. Proszę zapoznać się z poprzednimi klasycznymi wizualizacjami testów płytkowych, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat techniki oznaczania płytkinazębnej 8,9.

Przedstawione tutaj procedury są zgodne ze specyfikacjami BMBL określonymi przez CDC1. Przedstawione protokoły są jednak specyficzne dla IRF-Frederick. Każda placówka BSL-4 ma różne standardowe procedury operacyjne (SOP) i metody działania, które mają wpływ na wykonywanie eksperymentów w laboratorium BSL-4. Alternatywne procedury zarządzania strumieniem odpadów i wykonywania testów płytki nazębnej mogą się różnić w zależności od zarządzania i działania tych laboratoriów. Niemniej jednak ogólna wiedza na temat konfiguracji laboratorium kombinezonu BSL-4 i procedur wykonywania pracy z szafami klasy II w środowisku BSL-4 pomoże naukowcom zrozumieć ograniczenia i implikacje dla bezpieczeństwa podczas rozważania badań patogenów wysokiego ryzyka. Zwiększona świadomość współpracowników zewnętrznych na temat trudności związanych z pracą w laboratorium BSL-4 może prowadzić do dostosowania oczekiwań i większej łatwości w opracowywaniu medycznych środków zaradczych w społeczności naukowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wpis do laboratorium

  1. Zbierz wszystkie materiały z laboratorium BSL-2 do eksperymentu (np. ogniwa, pożywki i materiały eksploatacyjne) przed wejściem do laboratorium BSL-4.
  2. Ukończ procedurę wjazdu BSL-4 (opisaną szczegółowo w odnośniku7).

2. Przygotowanie Gabinetu Bezpieczeństwa Biologicznego II klasy w Laboratorium BSL-4

  1. Po wejściu do laboratorium BSL-4 upewnij się, że codzienna wewnętrzna lista kontrolna (rysunek 1) została wypełniona. Wypełnij listę kontrolną, jeśli lista kontrolna nie została wcześniej wypełniona, i wskaż, które wirusy zostaną użyte. Jeśli lista kontrolna została już wypełniona, dodaj nazwę i wirusa, który będzie używany do listy.
  2. Oczyścić BSC klasy II, spryskując całe wnętrze BSC (łącznie ze skrzydłem) 5% podwójnym czwartorzędowym roztworem środka dezynfekcyjnego (np. chlorkiem n-alkilodimetylobenzyloamoniowym, chlorkiem n-alkilodimetyloetylobenzyloamoniowym lub innym środkiem dezynfekującym odpowiednim dla stosowanego środka) i wytrzeć ręcznikami papierowymi10,11. Rozpyl 70% roztwór etanolu wewnątrz szafki i skrzydła, aby usunąć lepki roztwór dezynfekujący.
  3. W przypadku siedzenia należy ustawić krzesło przed BSC klasy II na wygodnej wysokości, aby upewnić się, że tył szafki jest dostępny i że twarz specjalisty laboratoryjnego znajduje się powyżej przedniego otworu (Rysunek 2)11.
  4. Przygotuj pojemnik na odpady do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że końcowe stężenie podwójnego czwartorzędowego amoniowego roztworu dezynfekującego w pojemniku na odpady nie jest mniejsze niż 5%. Zaplanuj odpowiednio i przygotuj 10% roztwór, do którego zostaną dodane odpady, które rozcieńczą środek dezynfekujący. Ponadto należy umieścić butelkę z rozpylaczem z 5% podwójnym czwartorzędowym roztworem środka dezynfekującego amoniowego wewnątrz BSC klasy II, aby spryskać wszelkie przedmioty przed usunięciem oraz ręce w rękawiczkach w trakcie i po zakończeniu testu.
  5. Umieść odpowiednie materiały potrzebne do całego eksperymentu w BSC klasy II jak najdalej w szafie, aby uniknąć wielokrotnego wprowadzania materiału do BSC klasy II i zakłócenia przepływu powietrza11.

3. Przykład: Test płytki nazębnej

  1. Próbki zawierające wirusa i wirusa należy ręcznie pobrać z miejsca przechowywania, a następnie rozmrozić materiały w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  2. Oznaczyć studzienki na płytkach 6-dołkowych, które mają być użyte, zgodnie z planowanymi rozcieńczeniami wirusa. Zaznacz pokrywki i korpus płytek, aby zapewnić pomyślne dopasowanie, jeśli pokrywki i korpus są oddzielone.
  3. Przenieś materiały z kroków 3.1-3.2 do BSC klasy II. Wszystkie przedmioty, które nie miały lub nie będą miały kontaktu z wirusem, należy umieścić po jednej stronie ("czysta strona"), a odpady po drugiej stronie ("brudna strona"). Jeśli to możliwe, należy przechowywać "czyste przedmioty" w odległości co najmniej 30 cm od "brudnych przedmiotów" podczas czynności wytwarzających aerozol11.
  4. Pracuj jak najbliżej środka BSC klasy II, ponieważ środek wewnętrzny został zaprojektowany tak, aby był najskuteczniejszą pozycją do ochronysiebie 11.
  5. Usunąć 50 μl próbki wirusa i wirusa kontrolnego i umieścić w 450 μl zmodyfikowanej pożywki Eagle's firmy Dulbecco z 2% płodową surowicą bydlęcą. Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń tak daleko, jak to konieczne (Rysunek 3A).
  6. Podczas rozcieńczania należy powoli i ostrożnie wymieszać próbki wirusa co najmniej 5 razy końcówką pipety, starając się zminimalizować wytwarzanie pęcherzyków powietrza w próbkach. Wymieniać końcówki pipet po każdym dodaniu do następnego dołka rozcieńczenia.
  7. W ostatnim rozcieńczeniu, po 5-krotnym wymieszaniu próbki, wyrzucić 50 μl próbki wirusa do pojemnika na odpady, aby zapewnić równe objętości rozcieńczeń.
  8. Podczas wyrzucania końcówek należy przepłukać każdą końcówkę roztworem dezynfekującym z pojemnika na odpady, aby odkazić wnętrze i zewnętrzną część końcówki przed wyrzuceniem końcówki do pojemnika na odpady.
  9. Po rozcieńczeniu należy odłożyć studzienki rozcieńczające na bok i rozpocząć zasysanie pożywki z dołków płytek do hodowli komórkowych, pozostawiając 500 μl pożywki w każdym dołku płytki 6-dołkowej.
  10. Po zakończeniu z końcówką pipety odessać roztwór dezynfekujący z wiadra na odpady do górnej części pipety za pomocą ręcznego, regulowanego objętości pipetora przyciskowego, aby zapewnić prawidłowe odkażenie wnętrza pipety. Pozostaw końcówkę w pojemniku na odpady do końca eksperymentu.
  11. Po wyjęciu pożywki z płytek dodać 100 μl właściwej próbki do odpowiedniego dołka w wstępnie oznakowanych płytkach w dwóch częściach, zmieniając końcówki dla każdej próbki.
  12. Po zakończeniu inokulacji testem płytki nazębnej, spryskaj ręce w rękawiczkach roztworem dezynfekującym i użyj ręcznika papierowego nasączonego roztworem dezynfekującym, aby wytrzeć zewnętrzną stronę wszystkich płytek przed ręcznym umieszczeniem płytek z powrotem w inkubatorze. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie płytki znajdą się z powrotem w inkubatorze.
  13. Kołysz płytkami ruchem cyfry 8, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie próbki po komórkach co 15 minut przez 1 godzinę.
  14. Po zakończeniu płytek kołyszących, należy wnieść płytki z powrotem do BSC klasy II wraz z mieszaniną 2x minimalnego niezbędnego podłoża Eagle i 1,6% tragakantu, półstałej powłoki, która jest łatwiejsza w obsłudze niż agaroza, używanej do nakładania testu płytki nazębnej.
  15. Dodać 2 ml mieszaniny nakładki do każdej studzienki na płytce 6-dołkowej i ponownie kołysać ruchem cyfry 8, aby równomiernie rozprowadzić nakładkę na całej powierzchni studzienki. Powtarzaj ten proces, aż każda używana studzienka zostanie pokryta mieszanką nakładkową.
  16. Upewnij się, że końcówka pipety serologicznej nie dotyka żadnej cieczy w studzienkach, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego podczas wykonywania procedury nakładania.

4. Usuwanie odpadów i czyszczenie narzędzi i szafy bezpieczeństwa biologicznego

  1. Całkowicie zanurzyć wszystkie odpady w 5% roztworze dezynfekującym w pojemniku na odpady na czas kontaktu wynoszący co najmniej 10 minut. Zdezynfekować końcówki pipet, pipety serologiczne i inne odpady zgodnie z powyższym opisem. Ponadto spryskaj wiadro na odpady (wewnątrz i na zewnątrz) 5% roztworem dezynfekującym, aby roztwór pozostał w kontakcie z pojemnikiem na odpady przez czas kontaktu 10 minut.
  2. Czekając na upływ czasu kontaktu z odpadami, namocz ręcznik papierowy w 5% roztworze dezynfekującym, wytrzyj narzędzia, takie jak mikropipety, i wyjmij je z BSC. Spryskaj dłonie w rękawiczkach 5% roztworem dezynfekującym przed wyjęciem rąk w rękawiczkach z BSC klasy II.
    1. Po wyjęciu mikropipet z BSC należy je przetrzeć osobnym ręcznikiem papierowym z 70% roztworem etanolu, aby uniknąć lepkiego osadzania się na instrumentach. Spryskaj wszystkie narzędzia, których nie można skutecznie przetrzeć, 5% środkiem dezynfekującym i pozostaw w kontakcie z roztworem w BSC na 10 minut.
  3. Po upływie odpowiedniego czasu kontaktu wyjmij wszystkie elementy z BSC. Zanieś przedmioty, w tym wiadro na odpady zawierające odpady, do zlewu. Opłucz przedmioty, które można ponownie wykorzystać, aby usunąć pozostałości środka dezynfekującego. Przywróć wszystkie przedmioty do ich miejsc przechowywania.
  4. Wyczyść powierzchnię roboczą BSC klasy II, boki i tył szafki, wnętrze szkła i skrzydło1 5% roztworem dezynfekującym, a następnie 70% roztworem etanolu.
  5. Wyciągnąć i opróżnić pipety serologiczne z pojemnika na odpady, a zdezynfekowane powierzchniowo pipety serologiczne umieścić w oddzielnych tackach na pipety do autoklawowania (pipety serologiczne mogą stwarzać zagrożenie ostrymi narzędziami i mogą rozerwać worek na śmieci. Umieść te pipety w pojemniku o twardych ściankach przed sterylizacją w autoklawie).
  6. Wlej zawartość wiadra na odpady do sitka umieszczonego na dnie zlewu.
  7. Przynieś pojemnik na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, który jest wyłożony czerwoną torbą na wypadek zagrożenia biologicznego, do zlewu i wrzuć zawartość sitka do czerwonej torby na zagrożenie biologiczne. Nie sięgaj do sitka w celu usunięcia końcówek mikropipet, które mogą przykleić się do wnętrza sitka. Uderz sitkiem wzdłuż wewnętrznej strony pojemnika na odpady, aż wszystkie końcówki zostaną usunięte, lub użyj pęsety, aby usunąć końcówki z sitka.
  8. Wypłucz wiadro na odpady i umieść do wyschnięcia na stojaku obok zlewu.

5. Odpady z autoklawowania

  1. Wyjmij worek z zagrożeniem biologicznym z pojemnika na odpady biologiczne i umieść na tacy autoklawu na wózku.
  2. Pozostaw otwarte torby z zagrożeniem biologicznym i umieść kawałek taśmy autoklawu na zewnątrz worka, łącząc boki tacki autoklawu, aby worek był zabezpieczony w tacy.
  3. Umieść dwa kawałki taśmy autoklawu na tacki na końcówki do pipet serologicznych i oznacz ją swoimi inicjałami i datą. Umieść tackę na pipety serologicznej na wózku razem z tacą autoklawu.
  4. Otwórz autoklaw. Podłącz dostarczony wózek do załadunku/rozładunku autoklawu do autoklawu i wyjmij wysuwaną platformę autoklawu, aby spoczęła na wózku.
  5. Wyjmij metalowy pręt z autoklawu i otwórz górę. Umieścić fiolkę ze wskaźnikiem biologicznym zawierającą zarodniki Geobacillus stearothermophilus w metalowym pręcie, aby sprawdzić, czy cykl sterylizacji w autoklawie został pomyślnie zakończony.
  6. Umieść metalowy pręt na środku worka na odpady w tacce autoklawu, ale upewnij się, że metalowy pręt jest nadal łatwo dostępny.
  7. Umieść tackę autoklawu wypełnioną odpadami i tackę na pipety serologiczne na wysuwanej platformie autoklawu i wepchnij ją z powrotem do autoklawu.
  8. Odłącz wózek załadowczy/rozładowczy autoklawu od autoklawu i zamknij drzwi autoklawu.
  9. Uruchom autoklaw.
  10. Nie opuszczaj autoklawu, dopóki cykl się nie rozpocznie. Ekran operacyjny autoklawu wskaże czas pozostały do tego przebiegu.
  11. Po zakończeniu autoklawu należy usunąć wskaźnik biologiczny i ocenić wzrost przez ogrzewanie w określonym inkubatorze. Jeśli na wskaźniku biologicznym zostanie wykryty wzrost, ponownie uruchom śmieci w autoklawie i oceń nowy wskaźnik. Jeśli nie zostanie wykryty żaden wzrost, usuń śmieci z obiektu.

6. Przykład: Utrwalanie i barwienie testów płytki nazębnej

  1. Po upływie odpowiedniej liczby dni (zależnej od użytego wirusa) należy powrócić do laboratorium i ponownie wykonać czynności opisane w sekcjach 1 i 2.
  2. Ostrożnie wyjąć płytki do oznaczania płytki płytki nazębnej z inkubatora, zgodnie z krokiem 3.1.2, i ręcznie umieścić w BSC klasy II.
  3. Odpipetować wszystkie podłoża i materiał nakładki, a następnie przelać do pojemnika z roztworem dezynfekującym i zastąpić mieszaniną 10% neutralnej buforowanej formaliny i 0,8% fioletu krystalicznego12,13. Pozostaw mieszaninę na płytkach przez 30 minut, aby dezaktywować wirusa na płytkach.
  4. Po inaktywacji ostrożnie usunąć neutralną zbuforowaną mieszaninę formaliny i fioletu krystalicznego i umieścić w oddzielnym pojemniku na odpady, który ma zostać zneutralizowany przed usunięciem.
  5. Spryskaj ręce w rękawiczkach środkiem dezynfekującym i wytrzyj zewnętrzną stronę płytek przed wyjęciem ich z BSC klasy II, jak opisano powyżej.
  6. Podejdź do zlewu, opłucz talerze, aby usunąć nadmiar plamy, a następnie umieść talerze na wózku do wyschnięcia.
  7. Gdy płytki całkowicie wyschną, użyj lightboxa, aby policzyć płytki. Zapisz wszystkie zliczenia i oblicz miano wirusa na podstawie równania standardowego (rysunek 3B).

7. Usuwanie próbek z laboratorium BSL-4

  1. Dezaktywuj wszystkie próbki, które będą manipulowane w warunkach laboratoryjnych BSL-2. Należy postępować zgodnie z jedną z dwóch metod zatwierdzonych przez wewnętrzne biuro ds. bezpieczeństwa biologicznego w IRF-Frederick przy użyciu 10% neutralnie buforowanej formaliny (NBF) lub Trizolu LS (fenol, izotiocyjanian guanidyny, tiocyjanian amonu, octan sodu, glicerol)1,14. Przenieś próbki do nowej czystej probówki lub płytki poza BSC przed zapakowaniem w celu usunięcia z laboratorium BSL-4.
  2. Zgrzewane na gorąco inaktywowane próbki w probówkach lub płytkach w woreczku do zgrzewania zawierającym wystarczającą ilość 5% środka dezynfekującego lub roztworu utrwalającego do dezynfekcji wnętrza worka i zewnętrznej strony probówek z próbkami przenoszonych poza laboratorium BSL-4. Umieść tę torebkę w innej saszetce, postępując zgodnie z tą samą procedurą.
  3. Zgrzebnij drugą torebkę i umieść zgrzewaną torebkę w zbiorniku do zanurzania zawierającym 5% roztwór dezynfekujący na co najmniej 10 minut, aby zdezynfekować zewnętrzną część zgrzewanej torebki.
  4. Wypełnij dziennik zbiornika do zanurzania w laboratorium, określając liczbę i rozmiar probówek, objętość w probówkach, użyty środek, zastosowaną metodę inaktywacji oraz pomieszczenie, do którego zostaną przeniesione próbki.
  5. Skoordynuj działania z kolegą na zewnątrz laboratorium BSL-4, aby pobrać worek ze zbiornika do zanurzania i zabrać próbki do laboratorium BSL-2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzeganie odpowiednich procedur w laboratorium BSL-4 jest kluczowe dla zapewnienia bezpiecznego i skutecznego przeprowadzenia analiz. Odwołując się do wypełnionej codziennej wewnętrznej listy kontrolnej (Rycina 1), personel laboratorium upewnia się, że sprzęt jest w pełni sprawny. Prawidłowe ustawienie ciała w centrum BSC zapewnia przeprowadzenie eksperymentu w optymalnych warunkach przepływu powietrza (Rycina 2). Próbkę wirusa poddaje się rozcieńcza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium BSL-4 wymaga znacznej ilości czasu i dodatkowej dbałości o szczegóły. Każdy rodzaj pracy w tym środowisku wymaga dobrze wyszkolonych, dokładnych i sumiennych osób. Standardowy test płytki wirusowej zapewnia dokładny model powszechnej procedury pracy z patogenami o wysokich konsekwencjach w laboratorium BSL-4, ponieważ test obejmuje kilka głównych koncepcji, w których pracownicy laboratoryjni muszą zostać przeszkoleni.

Pierwszą ważną koncepcją jest właściwe stosowanie i sto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych (DHHS) lub instytucji i firm powiązanych z autorami. Prace te zostały częściowo sfinansowane z głównego kontraktu Battelle Memorial Institute z amerykańskim Narodowym Instytutem Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) na podstawie umowy nr 1. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. i J.W. wykonywali tę pracę jako pracownicy Battelle Memorial Institute. Podwykonawcami Battelle Memorial Institute, którzy wykonali te prace, są: S.M. jako pracownik MRI Global; M.G.L. jako pracownik Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; oraz J.H.K. jako pracownik Tunnell Government Services, Inc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Micro-Chem PlusNarodowe Laboratoria Chemiczne255
EtanolFisherBP2818500
2 ml Płytki głębinowe 96Fisher278743
10 ml Pipeta serologicznaFisher13-678-11E
Pipeta serologiczna 25 mlFisher13-678-11
Płytki 6-dołkoweFisher
Crystal VioletSigmaHT90132-1L
10% Neutralna Buforowana FormalinaFisher22-050-105
TragacanthFisher50-702-2000 
20 μ l Końcówki do pipetFisher21-402-550
200 μ l Końcówki do pipetFisher21-402-561
1,000 μ l Końcówki do pipetFisher21-402-581
DMEMLonza12-604Q
FBSSigmaF2442-500mL
Penicylina/StreptomycynaLonza17-602E
2x EMEMJakość Biologiczna115-073-101
PipetaDrummond4-000-101
1,000 μ l Pipeta Deszcz  L-1000XLS+
200 μ l Pipeta Deszcz  L-200XLS+
12-Well, wielokanałowy 200 μ l PipetorRaininL12-200XLS+
8-Well, wielokanałowy 1,000 μ l PipettorRaininLA8-1200XLS
AtestEkspresowe zaopatrzenie medyczne 
AutoklawGetingeGEB 2404 AMB-2
Torba na autoklawFisher01-828E
2 000 ml ZlewkaFisher02-591-10H
Tacka na autoklawFisher13-359-20B
Tacka na pipetyFisher13-361-5
37 ° C InkubatorFisherWU-39321-00
Biohazard CanRubbermaid CommercialFG614500 RED
Taśma autoklawowaFisher15-903
Pręt do autoklawuwyprodukowany przez IRF FacilityN/A
Light BoxFisherS11552
ZgrzewarkaFisherNC9793612 
Woreczki do zgrzewaniaFisher01-812-25H
Torba BiohazardFisher01-828E
ml 140675MMM12192

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
  2. Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
  3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. , The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
  4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
  5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
  6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. , Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
  7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
  8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065(2014).
  9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297(2012).
  10. Biosafety manual for Texas Tech University. , Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
  11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. , NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
  12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
  13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
  14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

One of the authors names was corrected from:

Nicole Joselyn

to:

Nicole Josleyn

Tagi

dygestorium mikrobiologicznemetoda p ytek wirusowychutylizacja odpad wsterylizacja w autoklawieroztw r dezynfekcyjnyrodki ochrony indywidualnejinaktywacja pr bkiobliczanie miana wirusaprocedury bezpiecze stwa laboratoryjnego

Powiązane artykuły