Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów

Podsumowanie

Pomijanie eksonów jest obecnie najbardziej obiecującą opcją terapeutyczną dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Aby rozszerzyć możliwości zastosowania u pacjentów z DMD i zoptymalizować stabilność/funkcję powstałych skróconych białek dystrofiny, opracowano podejście z pominięciem wielu eksonów przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych i zademonstrowaliśmy ogólnoustrojowe ratowanie dystrofiny w modelu psów.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest jedną z najczęstszych śmiertelnych chorób genetycznych na świecie, spowodowaną mutacjami w genie dystrofiny (DMD). Przeskakiwanie eksonów wykorzystuje krótkie cząsteczki podobne do DNA/RNA zwane oligonukleotydami antysensownymi (AON), które przywracają ramkę odczytu i wytwarzają krótsze, ale funkcjonalne białka. Terapia z pominięciem eksonów napotyka jednak dwie poważne przeszkody: ograniczoną możliwość zastosowania (tylko 13% pacjentów może być leczonych pojedynczym lekiem AEN) oraz niepewną funkcję skróconych białek. Problemy te zostały rozwiązane za pomocą podejścia koktajlowego AON. Podczas gdy około 70% pacjentów z DMD może być leczonych przez pomijanie pojedynczych eksonów (wszystkie eksony łącznie), można potencjalnie leczyć ponad 90% pacjentów z DMD, jeśli można zrealizować pomijanie wielu eksonów za pomocą koktajlowych leków antysensownych. Psi model psiej dystrofii sprzężonej z chromosomem X (CXMD), którego fenotyp jest bardziej podobny do ludzkich pacjentów z DMD, został wykorzystany do przetestowania skuteczności ogólnoustrojowej i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów w eksonach 6 i 8. Model psa CXMD zawiera mutację miejsca splicingu w intronie 6, co prowadzi do braku eksonu 7 w mRNA dystrofiny. Aby przywrócić ramkę odczytu w CXMD, wymagane jest pominięcie wielu eksonów 6 i 8; dlatego CXMD jest dobrym średniej wielkości modelem zwierzęcym do testowania skuteczności i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów. W obecnym badaniu zaprojektowano koktajl antysensownych morfolinos ukierunkowanych na ekson 6 i ekson 8, który przywrócił ekspresję dystrofiny w mięśniach szkieletowych na całym ciele. Przedstawiono metody transfekcji/iniekcji oligonukleotydów koktajlowych oraz ocenę skuteczności i bezpieczeństwa przeskakiwania wieloeksonowego w modelu psa CXMD.

Wprowadzenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest recesywną chorobą mięśni sprzężoną z chromosomem X, charakteryzującą się postępującym osłabieniem mięśni, po raz pierwszy opisaną przez dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) ¹. DMD jest powszechną chorobą genetyczną dotykającą około 1 na 3500 chłopców na całym świecie, przy czym każdego roku rodzi się około 20 000 dotkniętych nią dzieci ^2,3. Rozwój motoryczny jest opóźniony, a zaburzenia chodu obserwuje się we wczesnym dzieciństwie ⁴, a następnie uzależnienie od wózka inwalidzkiego około wczesnych nastolatków. Śmierć zwykle następuje w wieku od 20 do 30 lat z powodu niewydolności oddechowej lub serca ^5-8 lat. Obecnie nie ma lekarstwa na DMD. Leczenie glikokortykosteroidami może do pewnego stopnia spowolnić postęp zwyrodnienia mięśni, ale wiąże się ze znaczącymi skutkami ubocznymi, w tym otyłością i cukrzycą ^2,7,8. DMD wynika z mutacji w genie dystrofiny (DMD), co prowadzi do utraty funkcjonalnego białka dystrofiny. DMD jest niezwykle dużym genem z ponad 2 milionami par zasad i 79 eksonami ^9,10. Mutacje delecji, nonsensu i duplikacji prowadzące do mutacji poza ramką są najczęstszą przyczyną fenotypu DMD. Regiony eksonów 3 - 9 i eksonów 45 - 55 są określane jako "hotspoty mutacji", ponieważ większość pacjentów ma mutacje delecyjne w tych częściach genu, co prowadzi do niefunkcjonalnej dystrofiny u pacjentów z DMD ^3,9,11-16. Dystrofina funkcjonuje w kompleksie dystrofina-glikoproteina (DGC), który odgrywa główną rolę w stabilizacji błony mięśniowej. N- i C-końce są najważniejszymi domenami dla funkcji, podczas gdy centralna domena pręcików odgrywa mniej ważną rolę ^3,9,17. Obserwacja łagodnego fenotypu związanego z dystrofią mięśniową Beckera (BMD), która wynika głównie z mutacji w obrębie genu DMD, zainspirowała zastosowanie pomijania eksonów w leczeniu DMD. Pacjenci z BMD mają skrócone, ale funkcjonalne białko dystrofiny, które utrzymuje oba końce ^3,6,18. Teoretycznie przeskakiwanie eksonów może przywrócić ramkę odczytu, co skutkuje skróconymi, ale funkcjonalnymi białkami dystrofiny podobnymi do tych obserwowanych w BMD ^3,19.

Wiele typów antysensownych oligonukleotydów (AON) zostało przetestowanych w badaniach klinicznych, w tym 2'O-metylowane fosforotioniany(2'OMePS) i oligomery morfolino-oligomerów fosforodiamidanu (PMO). Zbadano pomijanie eksonów 51 i 53 przy użyciu tych AON i chociaż wyniki są obiecujące, pomijanie pojedynczych eksonów ma ograniczone zastosowanie, ponieważ jest specyficzne dla mutacji ^{3, 19, 20,21, 22-26}. Pozostają również pytania o stabilność powstałych skróconych białek dystrofiny wytwarzanych z pominięcia pojedynczego eksonu ^22,23. Ponadto niektórzy pacjenci wymagają pominięcia więcej niż jednego eksonu w celu przywrócenia ramki odczytu ³. Chociaż technicznie trudniejsze, pomijanie wielu eksonów jest jedną z metod, która może rozwiązać te problemy ^3,19. Przeskakiwanie wielu eksonów zostało wcześniej wykazane w dystroficznym liniach komórkowych psów i ludzi in vitro. Dodatkowo, mysie i psie modele dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X (CXMD) mdx52 zostały wykorzystane w badaniach in vivo ^22,24-27. Użyto tutaj psów rasy beagle z dystrofią mięśniową sprzężoną z chromosomem X (CXMD_J), ponieważ ramka odczytu CXMD_J może zostać przywrócona przez pominięcie wielu eksonów eksonów 6 i 8 lub dodatkowych eksonów (np. eksonów 3 - 9) (ryc. 1). CXMD oparty na beagle ma ten sam wzorzec mutacji, co model dystrofii mięśniowej Golden Retriever (GRMD), ale beagle są mniejsze i tańsze w utrzymaniu ze względu na ich rozmiar ciała, co stanowi użyteczny model dla DMD ^28,29. Psy z CXMD bardziej naśladują ludzki fenotyp DMD niż mniejsze modele zwierzęce, takie jak gryzonie, i są bardziej wiarygodne w ocenach toksykologicznych ^3,22,30,31 (Figura 2). Psy z CXMD wykazują postępujący rozpad mięśni, zaburzenia chodu oraz problemy z sercem i układem oddechowym podobne do tych obserwowanych w DMD. W porównaniu z pomijaniem pojedynczych eksonów, pomijanie wielu eksonów ma zastosowanie do znacznie większego odsetka pacjentów. Spośród trzech najczęstszych typów mutacji (delecje, nonsens i duplikacje), 80 - 98% pacjentów może być leczonych poprzez pomijanie wielu eksonów ^14,32,33, podczas gdy 45% wszystkich pacjentów z DMD może odnieść korzyści ze specyficznego pomijania egzonów 45 - 55 ^3,19,22,34.

Wraz z rozwojem modyfikowanych morfolinów, poprawiła się skuteczność koktajli AON w ułatwianiu pomijania eksonów. Bogate w argininę, penetrujące komórki, sprzężone z peptydami PMO (PPMO) i vivo-morpholinos (vPMO) to substancje chemiczne AEN, które znacznie poprawiły zdolność i stabilność przenikania do komórek ^3,35-38. Utrzymują się obawy dotyczące długoterminowej toksyczności AEN; Poczyniono jednak znaczne postępy. Modyfikacje chemiczne wprowadzone do morfolinosów znacznie zmniejszają efekty niezamierzone, a badania przedkliniczne nie wykazały znaczących skutków toksycznych ^3,22,39,40. Pozostałym wyzwaniem dla pomijania wielu eksonów jest obecny wymóg, aby każdy pojedynczy AON był testowany pod kątem toksyczności samodzielnie, jako pojedynczy lek, a nie razem jako koktajl ^{3,19,22,41,42}. W badaniach DMD obejmujących zarówno jedno-, jak i wieloeksonowe pomijanie ukierunkowane na serce, nastąpiła niewielka poprawa w dystroficznej tkance serca. Uważa się, że skuteczność morpholinos w sercu jest niska ze względu na słabą zdolność przenikania do komórek. PPMO sprzężone z peptydami poprawiły zdolność AON-ów do przenikania do komórek serca, zwiększając ilość funkcjonalnego białka dystrofiny uratowanego w sercu ^3,19,38.

Tutaj nasze podejście do koktajli AON jest szczegółowo omówione, w tym projektowanie sekwencji AON za pomocą oprogramowania ESEfinder ⁴³. Opisano również protokoły eksperymentów na psach z przeskakiwaniem wieloeksonowym. Beagle CXMD_J zostały użyte do eksperymentów z pominięciem eksonów 6 i 8. Przeskakiwanie wielu eksonów w modelu CXMD u psów daje obiecujące wyniki, ale nadal istnieją wyzwania, które należy pokonać, zanim będą miały zastosowanie kliniczne.

Protokół

Wszystkie wymienione poniżej protokoły są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami określonymi przez Narodowe Centrum Neurologii i Psychiatrii (NCNP) w Japonii. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NCNP.

1. Konstrukcja antysensownych oligonukleotydów

1. Użyj programów ratunkowych ESE i ESEfinder do wykrywania witryn ESE ^{44, 45-47}.
2. Zaprojektuj sekwencje 25 par zasad (bp), które są antysensowne w stosunku do eksonów, które mają być celowane. Docelowe eksony 6 i 8 w modelu psa (ryc. 1).
   1. Stosować sekwencje 25 - 30 pz dla PMO (Tabela 1) lub 25 pz dla 2'OMePS. Aby zaprojektować sekwencje o długości 25 pz, wybierz sekwencje, które znajdują się w regionie docelowym. Weź pod uwagę strukturę drugorzędową, unikanie heterodimerów, motywy wzmacniające splot eksonów i zawartość GC, aby stworzyć stabilne sekwencje ⁴³. Ataki AON powinny być ukierunkowane na co najmniej jedną z lokalizacji ESE zidentyfikowanych przez wyżej wymienione oprogramowanie.
   2. Wybierz AON, których zawartość GC jest mniejsza niż 65%, z mniej niż 4 kolejnymi literami "G" i nie zawierają sekwencji samouzupełniających. Użyj oprogramowania NCBI Blast, aby przewidzieć niewłaściwe miejsca wyżarzania ^22,48,49.
3. Wybierz odpowiednią chemię szkieletu AAN. Do eksperymentów in vitro należy stosować 2'O-metylowe oligonukleotydy (2'OMePS) lub morfolinosy. Do eksperymentów in vivo należy użyć 2'OMePS, morpholinos lub vPMOs. ^3,19,48,50

2. Eksperymenty in vitro (przeskakiwanie eksonów 6 i 8 w modelu CXMD)

1. 2'OMePS Transfekcja mioblastów psów
   1. Hodowla mioblastów CXMD w 3 ml pożywki wzrostowej na płytkach 6-dołkowych. Nasiona 1 - 5 x 10³ komórki/cm² z 0,5 ml/^cm2 pożywki dla mioblastów. Jako pożywkę wzrostową należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) ⁴⁰.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do uzyskania 60 - 80% konfluencji. Trwa to około 12 do 24 godzin.
   3. Rozcieńczyć kationowy środek transfekcyjny liposomów do łącznej objętości 100 μl w zredukowanej pożywce surowicy (środek transfekcyjny w stosunku 2:1: AONs, np. 10 μl lipofektyny vs. 5 μg AONs). Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 - 45 minut.
   4. Rozcieńczyć AON (2'OMePS lub morpholinos) do końcowej objętości 100 μl w zredukowanym pożywce surowicy.
   5. Połączyć rozcieńczony środek transfekcyjny z rozcieńczonymi AON i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
   6. Podczas gdy mieszanina środka transfekcyjnego/AON znajduje się w temperaturze pokojowej, usuń stare media z komórek poprzez aspirację i umyj komórki pożywką.
   7. Dodać 0,8 ml pożywki do mieszaniny środka do transfekcji/AON, a następnie dodać cały roztwór do świeżo umytych komórek. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
   8. Po inkubacji zastąp pożywkę pożywką różnicującą (DM); Różnicowanie może potrwać do 10 dni. Sprawdź, czy zróżnicowanie nastąpiło począwszy od około 3 dnia. Pożywką różnicującą jest DMEM z 2% surowicą końską, 200 U/ml penicyliny, 200 mg/ml streptomycyny i 10 μg/ml insuliny.
2. Transfekcja morfolino mioblastów psów
   1. Hodowla mioblastów CXMD w pożywce wzrostowej, jak opisano w kroku 2.1.
   2. Przełącz się na pożywkę różnicującą (DM) i dodaj 0,1 mM podstawowej morfoliny do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Podgrzewać morfoliny koktajlowe w temperaturze 65 °C przez 10 minut przed transfekcją lub wstrzyknięciem, aby uniknąć agregacji AEN. Dodać odczynnik dostarczający peptyd ^39,51 i dostosować do końcowego stężenia 3-6 μM.
   3. Po 16 - 48 godzinach inkubacji zbierz komórki do ekstrakcji RNA. Dodać 1 ml kwaśnego tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu do komórek, aby oderwać komórki od płytki. Po tym kroku wykonaj ekstrakcję RNA.
      1. Alternatywnie, dodać trypsynę tak, aby pokryła wszystkie komórki i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
         Uwaga: Jeśli zamierzasz przeprowadzić immunochemię, do hodowli należy użyć szkiełek z komorą. Po różnicowaniu komórki można utrwalić za pomocą paraformaldehydu (PFA) (4% przez 10 min).
3. Ekstrakcja RNA i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)
   1. Po różnicowaniu komórek w miotuby, usunąć pożywkę i dodać 1 ml kwaśnego tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu; inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml. Połączyć z 200 μl chloroformu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aż będą widoczne trzy oddzielne warstwy. Trzy warstwy od góry do dołu to: warstwa RNA, warstwa DNA i warstwa białka.
   3. Wirować w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć górną warstwę supernatantu i umieścić w probówce z 500 μl izopropanolu (w przypadku zatrzymania się na tym miejscu należy przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C). Odwirować supernatant w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; po odwirowaniu zachowaj powstały osad RNA i wyrzuć supernatant.
   4. Przemyć granulat etanolem i odwirować przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odparować resztki etanolu, odwracając rurkę na 15 minut, a następnie dodać 15 - 30 μl wody wolnej od RNaz. Określić ilościowo całkowite stężenie RNA za pomocą spektroskopii US/VIS przy długości fali 260 nm.
   5. Połącz odczynniki wymagane do reakcji RT-PCR: 1,5 μl 10 μM startera do przodu, 1,5 μl 10 μM startera odwrotnego, 1 μl dNTP, 5 μl jednoetapowego buforu zestawu PCR, 0,7 μl inhibitora RNazy, 1 μl mieszaniny enzymów z jednoetapowego zestawu PCR i 200 ng RNA. Po ich wymieszaniu dodać wodę do końcowej objętości 25 μl.
   6. Umieść mieszaninę w termocyklerze. Uruchom 30-minutowy cykl w temperaturze 50 °C, 15-minutowy cykl w temperaturze 95 °C, następnie 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, 60 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę. Na koniec uruchom 10-minutowy cykl w temperaturze 72 °C. Produkt PCR należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C lub -20 °C
4. Sekwencjonowanie komplementarnego DNA (cDNA)
   1. Zidentyfikuj prążki pominięte w eksonie 6 - 9 za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załadować 5 μl każdej próbki do studzienek z 1,5% żelem agarozowym, przepuścić 135 V przez żel przez 5 minut, a następnie 120 V przez 20 minut. Następnie inkubować żel w barwieniu żelu DNA w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wizualizacja pasm za pomocą oprogramowania do obrazowania.
   2. Wytnij pasmo zainteresowania za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      1. Wyciąć fragment DNA i rozpuścić plasterek żelu przy użyciu 200 μl żelu NTI/100 mg. Pozostaw na 5 do 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Następnie przenieś do rurki z membraną krzemionkową.
      2. Wirować przy 11 000 x g przez 30 sek. Przemyć dwukrotnie 700 μl buforu NT3 przed ponownym odwirowaniem przy 11 000 x g przez 30 sek.
      3. Wysuszyć membranę krzemionkową przez odwirowanie przy 11 000 x g przez 1 min.
      4. Dodać 15 - 30 μl buforu NE i pozostawić na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować przy 11 000 x g przez 1 minutę. Usuń żel krzemionkowy i trzymaj zawartość w tubce.
   3. Użyj zestawu do sekwencjonowania, aby określić sekwencję zgodnie z protokołem producenta.

3. Zastrzyki domięśniowe lub otwarta biopsja mięśni

1. W celu utrzymania sterylnych warunków podczas operacji przeżycia należy usunąć włosy za pomocą maszynki do strzyżenia w obszarze otaczającym miejsce operacji (kończyna tylna). Użyj jodoforów lub chloroheksydyny jako środka dezynfekującego. Używaj sterylnych obłożeń na miejsce operacji, umieszczając je i zabezpieczając na całym zwierzęciu i stole operacyjnym.
   1. Na salę operacyjną należy nosić czyste fartuchy, maseczki na twarz, nakrycie głowy, sterylne rękawiczki i specjalne obuwie na salę operacyjną^52,53.
2. Wstrzyknąć psom z CXMD 20 mg/kg tiopentalu sodu w celu znieczulenia. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
3. Stosować 2-3% inhalację izofluranu w celu utrzymania znieczulenia ogólnego (ryc. 3). Sprawdź odruchy mięśniowe i monitoruj tętno i częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia. Normalna częstość oddechów (RR), tętno (HR) i SpO₂ w znieczuleniu ogólnym są następujące: RR: 10 - 20 oddechów/min; SpO₂: 95 - 100%, HR: 80 - 120 uderzeń na minutę (bpm).
4. Za pomocą skalpela przeciąć skórę nad kością piszczelową czaszki (CT), znaną również jako piszczel przednia (TA), i wykonać pojedyncze cięcie około 5 cm wzdłuż (dla młodych dorosłych psów). Aby oznaczyć miejsca wstrzyknięć, należy zszyć powięź głęboką za pomocą igły chirurgicznej i nici chirurgicznej i wykonać dwa znaczniki ściegu w odstępach co 2 cm.
5. Wstrzyknąć pożądane stężenie AON do mięśnia za pomocą igły 27 G. Pożądane stężenie różni się w zależności od warunków leczenia. W przypadku tomografii komputerowej należy podać dwa wstrzyknięcia o objętości 1 ml każde, co daje łącznie 1,2 mg PMO w postaci koktajlu (0,4 mg każdy PMO) lub 0,4 mg vPMO w postaci koktajlu (po 0,13 mg każdy vPMO). W przypadku mięśnia kończyny przedniej prostownika nadgarstka łokciowego (ECU) należy wstrzyknąć dwie objętości po 0,5 ml każda, co daje łącznie 1,2 mg PMO koktajlu (0,4 mg każdy PMO) lub 0,4 mg koktajlowych vPMO (0,13 mg każdy vPMO). Pozostaw igłę na 1 minutę. Użyj równej ilości każdego AON do koktajlu.
6. Wykonaj otwartą biopsję mięśni, usuwając kawałek tkanki mięśniowej o długości około 2 cm z mięśnia CT za pomocą skalpela chirurgicznego.
7. Przejdź do kroku 6.5, aby przygotować próbkę mięśni.
8. Za pomocą igły należy podać domięśniowo wstrzyknięcie 0,02 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny przed przebudzeniem ze znieczulenia ogólnego. Połóż powięź mięśniową i skórę z powrotem na mięśniu i zszyj je za pomocą nici wchłanialnej 3-0 i nici nylonowej 3-0 odpowiednio do powięzi mięśniowej i zamknięcia skóry.
9. Trzymając usta otwarte, ustal, czy odruch wymiotny powrócił; gdy odruch wymiotny powrócił, ekstubuj psa.
10. Podawać od 15 do 30 mg/kg cefazoliny lub cefaleksyny (antybiotyki) przez okres do 3 dni we wstrzyknięciu dożylnym lub domięśniowym, aby zapobiec zakażeniu.
11. Usuń szwy w ciągu siedmiu dni. Nie pozostawiaj psa bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i nie pozwalaj psu na interakcję z innymi zwierzętami, dopóki nie nastąpi pełne wyzdrowienie. Utrzymuj rurki dotchawicze na miejscu tak długo, jak to możliwe i wyjmij je, gdy zwierzę zacznie żuć lub połykać. Monitoruj tętno, oddech i nawodnienie zwierzęcia, aby upewnić się, że są stabilne i mieszczą się w normalnych granicach.
12. W przypadku opieki pooperacyjnej należy zapewnić znieczulenie przez 3 dni (np. buprenorfina 0,01 mg/kg) i wsparcie w pielęgnacji, w tym ciche, ciemne miejsce odpoczynku, odpowiednią pielęgnację ran i bandaży, miękką powierzchnię spoczynkową, nawodnienie płynami doustnymi lub pozajelitowymi oraz powrót do normalnego karmienia poprzez stosowanie bardzo smacznych pokarmów lub smakołyków. Jeśli jakiekolwiek zwierzęta wymagają dodatkowego leku, Wykonać domięśniowe wstrzyknięcie 0,3 mg/kg winianu butorfanolu w zależności od objawów bólowych.
    Uwaga: Psy odczuwające ból mogą gryźć, drapać lub strzec bolesnych obszarów, a jeśli są dotykane, mogą być niezwykle lękliwe lub agresywne. Ponadto ból w jednej kończynie zwykle powoduje utykanie lub trzymanie się chorej kończyny przy próbach jej użycia. W takich sytuacjach należy wykonać wstrzyknięcie domięśniowe w postaci 0,02 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny co 6 - 8 godzin.

4. Zastrzyki ogólnoustrojowe

Uwaga: Ta procedura może być powtarzana co tydzień lub co dwa tygodnie przez żądaną liczbę tygodni.

1. Unieruchamiaj psy ręcznie i delikatnie, zmuszając psa do położenia się, a następnie ułóż ręce na ramionach i biodrach, aby utrzymać psa na miejscu przez cały zabieg.
2. wstrzykiwanie AONs; 120 - 240 mg/kg koktajlowe PMO (40 - 80 mg każdy AON) za pomocą igły do zamieszkania żylnego do żyły kończyny (znanej jako żyła głowowa lub odpiszczelowa). Ilość wstrzykiwanego AON zależy od warunków doświadczalnych. Użyj równej ilości każdego AON do koktajlu.
3. Za pomocą pompy infuzyjnej lub sterownika strzykawkowego wstrzyknąć łącznie 50 ml z szybkością 2,5 ml/min przez 20 minut, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Powtarzaj wstrzyknięcia co tydzień lub co dwa tygodnie (co dwa tygodnie) co najmniej 5 razy, ponieważ ekspresja dystrofiny będzie się kumulować przy wielokrotnych wstrzyknięciach.
4. Wykonuj badania krwi co tydzień w celu zbadania toksyczności.
   1. Za pomocą igły pobrać 3 ml krwi — 0,5 ml w przypadku pełnej morfologii krwi (CBC) i 2,5 ml w przypadku innych — z jednej z żył podskórnych kończyny przedniej lub tylnej. Uwzględnij morfologię krwi, gamma-glutamylotransferazę (GGT), aminotransferazę asparaginianową (AST), azot mocznikowy we krwi (BUN), aminotransferazę alaninową (ALT), kinazę kreatynową (CK) i kreatyninę podczas badania pobranej krwi, postępując zgodnie z instrukcjami producenta z zestawów do badania krwi. ^{Kategoria 40,54}
   TGL

5. Klasyfikacja kliniczna psów

1. Skonfiguruj kamerę wideo i nagrywaj zachowanie i chód psa. Nagraj całe spotkanie z psem, ponieważ będzie to służyć jako odniesienie podczas oceniania psa; Oznacza to, że każdy film będzie miał inną długość w zależności od umiejętności i chęci psa. Użyj domyślnych parametrów nagrywania. Filmowanie tworzy zapis oceny, dzięki czemu można go przejrzeć w późniejszym terminie.
2. Stopień chodu i zaburzenia ruchu.
   1. W przypadku zaburzeń chodu i ruchu należy stosować następujące stopnie:
      Stopień 1 = brak, stopień 2 = siedzenie z wysuniętą tylną kończyną, stopień 3 = królicze skoki z tylnymi kończynami, stopień 4 = chód szurający i stopień 5 = niezdolność do chodzenia.
   2. W przypadku zaburzeń ruchomości użyj następujących stopni: stopień 1 = brak, stopień 2 = leżenie więcej niż normalnie, stopień 3 = niezdolność do skakania na tylnych kończynach, stopień 4 = rosnące trudności w poruszaniu się i stopień 5 = niezdolność do wstawania i poruszania się.
3. Zmierz czas, ile czasu zajmuje psu przebiegnięcie 15 m. Odmierz 15 m, umieść psa na linii startu i zachęć go do biegu do znaku 15 m.
4. Określ zanik mięśni kończyny za pomocą następującej skali ocen:
   Stopień 1 = brak, stopień 2 = podejrzana twardość, stopień 3 = wyczuwalna twardość lub wydaje się cienka, ocena 4 = między ocenami 3 i 5, a klasa 5 = wyjątkowo cienka lub twarda.
5. Ocena ślinienia się przy użyciu następującej skali: stopień 1 = brak, stopień 2 = od czasu do czasu kapie śliną podczas siedzenia, stopień 3 = trochę śliny podczas jedzenia i picia, stopień 4 = struny śliny podczas jedzenia lub picia, a stopień 5 = ciągłe ślinotok.
6. Stopień przerostu języka (makroglosja) w następującej skali: stopień 1 = brak, stopień 2 = nieznacznie powiększony, stopień 3 = rozszerzone uzębienie zewnętrzne, stopień 4 = powiększony i nieznacznie pogrubiony, a stopień 5 = powiększony i pogrubiony.
7. Oceń zdolność psa do połykania za pomocą następującej skali: stopień 1 = brak trudności, stopień 2 = wymaga czasu i wysiłku w przyjmowaniu pokarmu, stopień 3 = trudność w pobieraniu pokarmu z talerza, stopień 4 = trudności w żuciu, połykaniu lub piciu, a stopień 5 = niezdolność do jedzenia.
8. Oblicz łączną ocenę, dodając wyniki z każdej kategorii (z wyjątkiem testu biegowego na 15 m) ⁵⁵,
   Uwaga: Badania powinny być zaślepione, aby nie wprowadzać stronniczości.

6. Rezonans magnetyczny (MRI)

1. Użyj rezonansu magnetycznego o natężeniu 3 Tesli (3T) i cewki kończyn ludzkich o średnicy 18 cm/długości 18 cm, aby uzyskać obrazy kończyn tylnych ważone T2.
2. Znieczulać zwierzęta, wstrzykując psom CXMD 20 mg/kg tiopentalu. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Stosować 2-3% inhalację izofluranu w celu utrzymania znieczulenia ogólnego.
   1. Sprawdź odruchy mięśniowe i monitoruj tętno i częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia. Normalna częstość oddechów (RR), tętno (HR) i SpO₂ w znieczuleniu ogólnym są następujące: RR: 10 - 20 oddechów/min, SpO₂: 95 - 100%, HR: 80 - 120 uderzeń na minutę (bpm).
3. Użyj następujących ustawień, aby uzyskać obrazy ważone T2: TR/TE = 4 000/85 ms, grubość warstwy = 6 mm, odstęp warstwy = 0 mm, pole widzenia = 18 cm x 18 cm, rozmiar matrycy = 256 x 256 i liczba akwizycji = 3 podczas szybkiego echa wirowania (rysunek 4).

7. Pobieranie i przygotowanie mięśni (sekcja zwłok)

Uwaga: Próbki mięśni powinny być pobrane tydzień lub dwa po ostatnim wstrzyknięciu AEN.

1. Wstrzyknąć psom 20 mg/kg tiopentalu sodu w celu znieczulenia. Stosuj maść weterynaryjną na oczy podczas znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
2. Stosować 2 - 3% inhalacji izofluranu w celu utrzymania znieczulenia. Sprawdź odruchy mięśniowe i monitoruj tętno i częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia. Normalna częstość oddechów (RR), częstość akcji serca (HR) i SpO₂ w znieczuleniu ogólnym są następujące: RR: 10 - 20 oddechów/min; SpO₂: 95 - 100%, HR: 80 - 120 uderzeń na minutę.
   1. Eutanazja psów przez wykrwawienie w znieczuleniu ogólnym (tylko do sekcji zwłok). Stosuj wykrwawianie w głębokim znieczuleniu ogólnym, aby uniknąć skutków spowodowanych przez czynniki pochodzenia krwi w analizie molekularnej (np. mięsień sercowy).
3. Przeanalizuj następujące mięśnie (ryc. 5): CT, prostownik palca długiego (EDL), mięsień brzuchaty łydki, płaszczkowaty, mięsień dwugłowy uda, mięsień prosty uda, biceps brachii, triceps brachii, deltoid, ECU, prostownik nadgarstka promieniowego (ECR), zginacz nadgarstka łokciowego (FCU), zginacz nadgarstka promieniowego (FCR), gracilis, mięśnie międzyżebrowe, mięśnie brzucha, przepona, boczny grzbiet, przełyk, mostek obojczykowo-sutkowy i serce. Aby zbadać toksyczność, należy pobrać próbki nerek i wątroby. Użyj Evansa i Alexandra de Lahunty (2009) jako odniesienia dla techniki preparacji ⁵⁶.
4. Przeciąć CT, EDL, mięśnie brzuchate łydki, płaszczkowaty, mięsień dwugłowy uda, mięsień prosty uda, mięsień dwugłowy ramienia, mięsień trójgłowy ramienia, naramienny, ECU, ECR, FCU, FCR, gracilis, mięśnie międzyżebrowe, mięśnie brzucha, boczny grzbiet, przełyk, mostek obojczykowo-sutkowy, serce, nerki i wątrobę na małe odcinki o długości około 1 - 1,5 cm. Zwiń membranę, a następnie pokrój ją na odcinki 1 - 1,5 cm ⁵⁶.
5. Ułóż gumę tragakantową tak, aby miała grubość około 0,5 - 1 cm na krążkach korkowych. Oznacz krążki z identyfikacją zwierzęcia i nazwą mięśnia po przeciwnej stronie gumy tragakantowej.
6. Umieść mięśnie tak, aby ich oś podłużna była prostopadła do korka w gumie tragakantowej.
7. Umieść korki w pojemniku z izopentanem, który znajduje się w ciekłym azocie. Przesuwaj go stale pęsetą przez 1 minutę lub do całkowitego zamrożenia. Przechowywać mięśnie na korkach w fiolkach w temperaturze -80 °C. Podczas transportu fiolki należy umieścić na suchym lodzie.
8. Przygotuj szkiełka podstawowe z etykietą identyfikującą zwierzę / nazwą mięśnia i datą.
9. W kriostacie schłodzonym do temperatury -25 °C zamontuj korek na stojaku. Ustaw grubość przekroju na żądany poziom. Użyj 8 μm do barwienia immunohistochemicznego i 12 μm do barwienia hematoksyliną i eozyną (HE). Do próbek Western blot należy użyć 15 μm. Przytnij około jednej czwartej mięśnia, aby uzyskać płaski mięsień do prawidłowego pobierania próbek mięśni.
10. Wycinając jedną sekcję mięśnia na raz, umieść co 6^sekcję na tym samym szkiełku, jeśli planujesz użyć próbek do immunohistochemii lub barwienia HE. W przypadku stosowania próbek do plam zachodnich, umieścić 30 - 40 odcinków w probówce i przechowywać w temperaturze -80 °C.
11. Po przygotowaniu szkiełek należy pozostawić je do wyschnięcia na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.

8. Immunohistochemia

1. Wyjmij przygotowane szkiełka z magazynu i umieść je w komorze wilgotnościowej, aby utrzymać szkiełka oddzielnie i utrzymać wilgoć. Napełnij komorę wilgotnościową tak, aby dno było pokryte wodą (około 1 mm wody).
2. Suszyć na powietrzu przez 0,5 godziny. Narysuj kwadrat otaczający próbkę mięśni na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
3. Dodać 15% surowicy koziej do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować przez 2 godziny w odczynniku blokującym RT In.
4. Dodaj mysie pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne anty-dystrofiny (DYS-1) lub C-końcowe przeciwciało monoklonalne (DYS-2) do barwienia dystrofiny u psa (rozcieńczenie 1:150). Rozcieńczyć za pomocą środka blokującego w 1,25 ml PBS. Inkubować O/N w lodówce w temperaturze 4 °C.
5. Myć PBS przez 5 minut, powtórzyć trzy razy. Dodaj przeciwciało drugorzędowe Alexa 594 kozie przeciwciało przeciwko mysiej IgG1 (dla DYS-2) lub IgG2 (dla DYS-1) (1:2,500). Rozcieńczyć odczynnikiem blokującym w PBS zawierającym 0,1% etoksylowany oktylofenol. Inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Myć PBS przez 5 minut, trzy razy. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia. Dodać 1-2 krople (3 ng/ml) roztworu montażowego 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI). Za pomocą pęsety umieść szklaną szkiełko na górnej części sekcji, unikając pęcherzyków.
7. Zobacz włókna dodatnie dystrofiny (DYS-1/DYS-2) pod mikroskopem fluorescencyjnym przy długości fali 594 nm przy 20-krotnym powiększeniu.

9. Western Blotting (zachodnia plama)

1. Pobrane skrawki mięśni z kriosekcji dodać do 150 μl buforu do próbki na lodzie.
2. Za pomocą homogenizatora ręcznego krótko homogenizować próbki białek. Podgrzewać próbki w probówce o pojemności 1,5 ml w inkubatorze z blokiem grzewczym w temperaturze 95 °C przez 3–5 minut. Odwirować przy 16 500 × g przez 15 minut i zebrać supernatant.
3. Przechowywać podwielokrotności supernatantu w temperaturze -70 °C. Użyć wody destylowanej do rozcieńczenia do 100 razy.
4. Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Dodać 2x Laemmli bufor ładujący SDS do próbek i podgrzewać przez 3 minuty w temperaturze 95 °C.
5. Załaduj próbki do 3-8% żelu tris-octanowego przed uruchomieniem go na 3 godziny przy napięciu 150 V. Dołącz kilka rozcieńczonych próbek typu dzikiego (WT) (np. 1%, 10% i 50%) w celu oceny ilościowej. Za pomocą tej metody należy wykryć mniej niż 1% poziom dystrofiny WT.
6. Umieść żel w buforze katodowym na 20 minut. W tym czasie weź dziewięć kawałków bibuły filtracyjnej i umieść je w transferowych (odpowiednio 3 bibuły w buforze katodowym [+], buforze anodowym ([-] i skoncentrowanym buforze anodowym [--]). Opisuje to metodę transferu półsuchego, która zwiększa czułość (ryc. 6).
7. Namocz membranę PVDF w metanolu na 20 sekund, a następnie umieść w buforze anodowym.
   Ustaw żel z membraną do transferu półsuchego i pozwól mu pracować przez 1,5 godziny przy 400 mA w temperaturze pokojowej lub w chłodni.
8. Umyj membranę PBS. Inkubować błonę w mieszaninie PBS z Tween 20 (PBST) i 5% mleka w proszku przez 2 godziny.
9. Rozcieńczyć DYS-1 (przeciwciało pierwszorzędowe) w mieszaninie PBST i 5% mleka w proszku do rozcieńczenia 1:100. Dodaj go do błony i pozwól mu inkubować przez co najmniej 1 godzinę. Przemyć trzy razy 100 ml PBST przez 15 minut każdy.
10. Dodać 65 μl/pas sprzężonego z HRP przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG2a dla DYS1) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 1 godzinę w RT w ciemnym obszarze. Następnie przemyć trzykrotnie 200 ml PBST przez 20 minut. Wymieszaj roztwory z zestawu do wykrywania zgodnie z zaleceniami. Inkubować przez 1 minutę.
11. Wywołaj film do wykrywania pasm i analizy za pomocą oprogramowania ImageJ ^48,57,58.

Wyniki

Eksperymenty in vitro

Mioblasty zostały przetransfekowane różnymi warunkami leczenia 2'OMePS w celu porównania skuteczności każdego AON. Wykonano pojedyncze zabiegi AON z 600 nM każda z Ex6A, Ex6B, Ex8A lub Ex8B, a także zabieg koktajlowy z 600 nM każdą ze wszystkich 4 sekwencji AEN. Próbki RNA pobrano cztery dni po transfekcji. Po RT-PCR próbki do każdego zabiegu prowadzono na żelu wraz z próbkami niepoddanymi działaniu substancji (NT). Pasma znajdujące się wyżej na żelu reprezentują produkty DMD poza ramką; prążki te obserwowano w mioblastach traktowanych NT, Ex8A i Ex8B. Ex6A, Ex6B, Ex8A i mioblasty potraktowane koktajlem wykazały produkty w ramce. Koktajl i Ex6A/B wykazały 100% produktów w ramce, podczas gdy Ex8A tylko 30% produktów w ramce (ilustracja 7). Aby potwierdzić przeskakiwanie eksonów i przywrócenie ramki odczytu, przeprowadzono sekwencjonowanie cDNA; wyniki wskazały, że eksony 6 - 9 zostały rzeczywiście pominięte (ryc. 7). Immunohistochemia wykazała, że psy leczone AON miały zwiększoną ilość włókien dystrofino-dodatnich w porównaniu z próbkami NT (ryc. 8).

Eksperymenty in vivo

Aby porównać skuteczność różnych warunków leczenia AON, psom CXMD (w wieku 0,5 - 5 lat) wstrzyknięto jednorazowo 1,2 mg Ex6A lub koktajl Ex6A, Ex6B i Ex8A w różnych dawkach. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu pobrano próbki mięśni i wybarwiono je DYS-1 w celu porównania liczby włókien dystrofino-dodatnich. Wszystkie próbki poddane działaniu koktajlu wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z próbkami NT. Włókna dystrofinowo-dodatnie zwiększały się wraz z dawką AON (ryc. 9). Po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym, próbki mięśni CXMD typu dzikiego (WT), NT i koktajlu wybarwiono DYS-1 (Figura 10). Psy leczone koktajlem CXMD wykazywały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z psami z NT CXMD, zarówno w próbkach CT, jak i mięśnia sercowego. Jednak mięśnie szkieletowe (CT) leczone AON wykazywały znacznie wyższą ekspresję dystrofiny w porównaniu z leczonym mięśniem sercowym. Immunoblot porównujący WT, NT i różne mięśnie leczone koktajlem morpholino doprowadziły do tego samego wniosku. Stwierdzono również duży zakres ekspresji dystrofiny w próbkach leczonych mięśni szkieletowych (ryc. 10). Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) ujawniło, że leczone psy z CXMD wykazały poprawę histopatologii, ze znacznym spadkiem włókien centralnie jądrowych (CNF) w porównaniu z psami z NT CXMD (Figura 11). Oznacza to, że u psa NT występuje więcej zwyrodnień/regeneracji, co jest oznaką dystroficznej patologii mięśni. Dodatkowo leczone psy miały szybszy czas pracy i lepsze wyniki w skali ocen klinicznych. Leczone psy z CXMD wykazały lepsze wyniki niż psy z NT CXMD we wszystkich kategoriach (ryc. 12).

Rysunek 1. Wzorzec mutacji psa CXMD i egzonów 6 - 8 strategii pomijania przy użyciu koktajlu antysensownego. Psy CXMD mają mutację punktową w eksonie 6, prowadzącą do utraty eksonu 7 w dystroficznym mRNA psa. Powoduje to, że mRNA jest poza ramą, a produkcja białka dystrofiny zostaje utracona. Krótkie sekwencje AON są zaprojektowane do wiązania się z eksonami 6 i 8, co powoduje splicing mRNA, skutecznie pomijając egzony 6 - 8. Szary pasek u psów leczonych koktajlem AON reprezentuje krótkie sekwencje AEN. Ekson 9 koduje domenę zawiasową i czasami jest spontanicznie łączony z AON-ami przeciwko eksonowi 6 i 8. Powstałe mRNA koduje białka dystrofiny, które są krótsze, ale funkcjonalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Główne objawy kliniczne 1-rocznego zwierzęcia z dystrofią mięśniową sprzężoną z chromosomem X (CXMD). Pokazany jest 1-roczny beagle w typie dzikim i pies CXMD. Zajęcie mięśni proksymalnych, kończyn i skroniowych obserwuje się zwykle od 2 miesiąca życia. Przykurcz stawów i przesunięcie miednicy są widoczne od 4 miesiąca życia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Znieczulenie ogólne dla psa. A) Iniekcje domięśniowe i biopsje mięśni wykonuje się w znieczuleniu ogólnym z izofluranem. B) Przetrzymywanie zwierzęcia w celu wykonania wstrzyknięć ogólnoustrojowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) CXMD typu dzikiego, nieleczonego i leczonego CXMD. Skany MRI kończyny tylnej w wieku 3 miesięcy i 5 miesięcy u psów z CXMD WT i NT. Pokazano dwa przykładowe obrazy MRI kończyn tylnych leczonych CXMD przed (1 tydzień przed pierwszym wstrzyknięciem) i po wstrzyknięciu AON. 2703MA leczono 7 razy w tygodniu morfinom koktajlowym w dawce 200 mg/kg. 2001MA leczono 5 razy w tygodniu iniekcją dożylną morfinów koktajlowych 120 mg/kg. Psy kontrolne i leczone były w tym samym wieku. Leczone psy wykazują zmniejszone sygnały T2. Obrazy zostały zaadaptowane za zgodą Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley & Sons) ⁴⁰ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Procedura biopsji mięśni u psa. A) Kończyna dolna jest mocowana do biopsji mięśni. B) Za pomocą kleszczy przytrzymuje się kończynę dolną. C) Mięsień CT jest odsłonięty. Technikę otwartej biopsji stosuje się w celu uzyskania próbek mięśni z miejsc wstrzyknięcia. Nici służą do przechowywania próbek z biopsji. D) Próbki mięśni na gumie tragakantu po sekcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Metoda transferu półsuchego. Przedstawiono metodę transferu półsuchego dla Western blot. Trzy papiery nasączone skoncentrowanym buforem anodowym kładzie się na ujemnym zacisku; Na tym kładzie się 3 papiery nasączone buforem anodowym. Papier Mb PVDF jest nasączony metanolem, a następnie buforem anodowym przed umieszczeniem na 6 papierach. Żel, który został nasączony buforem katodowym, delikatnie układa się na papierze PVDF. Na koniec na żelu kładzie się 3 papiery nasączone buforem katodowym. Zacisk dodatni jest ustawiony na górze. Przez 1 godzinę przez system przepływa prąd 400 mA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Przeskakiwanie eksonów w mioblastach CXMD. Mioblasty CXMD transfekowano samym Ex6A, Ex6B, Ex8A lub Ex8B lub koktajlem wszystkich czterech. Do poszczególnych sekwencji użyto łącznie 600 nM, a do koktajlu użyto 600 nM każdej sekwencji. A) Leczenie 2'OMePS w mioblastach psów CXMD. Ex6A, Ex6B i próbki poddane działaniu koktajlu wykazują silne prążki w oczekiwanej pozycji transkryptów pominiętych w klatce. Ex8A pokazuje pasmo pośrednie, Ex8B pokazuje słabe pasmo, a NT nie pokazuje pasma w pozycji w klatce. B) sekwencjonowanie cDNA z samego Ex6A, 4 dni po transfekcji. Zdjęcia zostały zaadaptowane za zgodą Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley & Sons) ⁴⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Zwiększona ekspresja dystrofiny w transfekowanych mioblastach CXMD transfekowanych fosforotionianem 2'O-metylu (2'OMePS). Mioblasty CXMD transfekowano samym Ex6A lub koktajlem 2'OMePS. Pokazane są barwienie DYS-2 (czerwone) i DAPI (niebieskie). Poddane działaniu mioblasty porównuje się z mioblastami typu dzikiego (WT) i nieleczonymi (NT). Zdjęcia zostały zaadaptowane za zgodą Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley & Sons) ⁴⁰. Bar = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Ratowanie ekspresji dystrofiny za pomocą domięśniowych wstrzyknięć morpholinos u psów z CXMD. Albo sam Ex6A, albo koktajl Ex6A, Ex6B i Ex8A wstrzyknięto do mięśni CT psów z CXMD. Pokazane jest barwienie dystrofiną (DSY-1) psów typu dzikiego (WT), nieleczonych (NT) i leczonych CXMD. Psy leczono 1,2 mg samego Ex6A lub 1,2 mg koktajlu. Zdjęcia zostały zaadaptowane za zgodą Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley & Sons) ⁴⁰. Bar = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Zwiększona ekspresja dystrofiny po ogólnoustrojowym leczeniu koktajlem morpholino u psów z CXMD. Barwienie dystrofiną (DYS-1) zastosowano w celu porównania ekspresji dystrofiny u psów typu dzikiego (WT) (kontrola pozytywna), nieleczonych (NT) (kontrola ujemna) i CXMD leczonych koktajlem morfolino 120 mg / kg (40 mg / kg każdego AON). Koktajl morpholino zawierał Ex6A, Ex6B i Ex8A. Psom wstrzykiwano dożylnie 5 razy w tygodniu ten koktajl. A) Porównanie ekspresji dystrofiny w mięśniach piszczelowych czaszki (CT) u WT, NT i leczonych psów. B) Porównanie ekspresji dystrofiny w tkance serca między psami leczonymi NT i koktajlem morfolino. C) Immunoblot dla dystrofiny z desminą jako kontrolą obciążenia pokazano dla psów leczonych koktajlami WT, NT i morpholino. U leczonych psów pokazane są następujące mięśnie: triceps brachii (TB), biceps brachii (BB), przepona (DIA), przełyk (ESO), CT, przywodziciel (ADD), prostownik długi palca (EDL), żwacz (MAS) i serce. Zdjęcia zostały zaadaptowane za zgodą Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley & Sons) ⁴⁰. Bar = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11. Poprawa histopatologii u psów z CXMD leczonych przez 7 tygodni koktajlem Morpholino w dawce 240 mg/kg. Psom z CXMD w wieku od pół roku do pięciu lat wstrzykiwano dożylnie koktajl morfolino 240 mg/kg (Ex6A, Ex6B i Ex8A) raz w tygodniu przez 7 tygodni. Czternaście dni po ostatnim wstrzyknięciu pobrano mięśnie przełyku i wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Barwienie mięśni przełyku u psów CXMD nieleczonych (NT) i leczonych koktajlem morfoliny (leczonych) psów CXMD (soczewka obiektywowa 40X). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12. Poprawa wyników w ocenie klinicznej i czasie biegu 15 m po leczeniu morfolino. Psy leczone morfoliną porównano z nieleczonymi (NT) rodzeństwem z miotu. Słupki błędów na wykresie wskazują SEM. A) Całkowity wynik na klinicznym egzaminie oceniającym obliczono przed i po leczeniu, a leczone zwierzęta porównano z rodzeństwem z miotu NT. B) Porównanie 15 m czasu biegu psów leczonych i NT. c) podobny do b; Używano jednak młodszych psów. Zdjęcia zostały zaadaptowane za zgodą Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley & Sons) ⁴⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział:

Oligonukleotyd antysensowny	Sekwencja nukleotydów
Zobacz materiał Ex6A	GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG
Zobacz materiał Ex6B	ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT
Zobacz materiał Ex8A	CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC powiedział:

Tabela 1. Projekt oligonukleotydu antysensownego.

Dyskusja

Przeskakiwanie eksonów jest obiecującą techniką terapeutyczną w leczeniu DMD. Zarówno eksperymenty in vitro , jak i in vivo wykazały, że pomijanie wielu eksonów jest wykonalne. W tym miejscu omówiono zastosowanie modelu psa CXMD. Po pierwsze, AON zostały zaprojektowane przy użyciu programów Rescue-ESE i ESEfinder do celowania w eksony dystrofiny 6 - 8. Do transfekcji mioblastów CXMD wykorzystano chemię 2'OMePS AON, a do eksperymentów in vivo wybrano chemię szkieletu AON. vPMO są bardziej skuteczne niż niezmodyfikowane PMO, ale ze względu na ich wyższą toksyczność nie nadają się do wstrzykiwań ogólnoustrojowych. Ekstrakcję RNA, RT-PCR i sekwencjonowanie cDNA przeprowadzono na mioblastach CXMD. Psy, którym wstrzyknięto koktajl PMO, zostały ocenione klinicznie w celu oceny ewentualnej poprawy objawów klinicznych. Po humanitarnej eutanazji psów pobrano próbki mięśni i przygotowano je do kriosekcji. Uważa się, że okres półtrwania białka dystrofiny indukowany przez AON wynosi około 1 - 2 miesięcy. W tym badaniu wykorzystano młode dorosłe psy, chociaż eksperymenty te można przeprowadzić z nowonarodzonymi psami i starszymi psami (>5 lat). Przygotowane skrawki mięśni wykorzystano do oceny histopatologii i oceny ratowania białka dystrofiny przez Western blot i immunohistochemię⁴⁸.

Ważne jest, aby upewnić się, że objętość roztworu PMO jest prawidłowa przed wstrzyknięciem; Niezastosowanie się do tego będzie miało znaczący wpływ na wyniki. Podczas wstrzyknięć domięśniowych wymagane jest wystarczające ciśnienie, aby dostać się do włókien mięśniowych. Monitorowanie stanu zdrowia psa i inspekcja miejsca operacji są ważne dla rozwiązywania problemów. W celu monitorowania stanu zdrowia zwierząt należy przeprowadzać cotygodniowe badania krwi i ważenie. Po eutanazji zwierzęcia i przygotowaniu próbek mięśni, krytycznym krokiem w celu zapewnienia czułości w wykrywaniu białka dystrofiny jest użycie zarówno żelu Tris-acetat, jak i metody półsuchego blottingu podczas procedury Western blot.

Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, mioblasty traktowane Ex6A, Ex6B, Ex8A i koktajlem (zawierającym Ex6A, Ex6B, Ex8A i Ex8B) wytwarzały produkty DMD w ramce. Ponieważ Ex8B nie wytwarzał produktów pomijanych przez egzony, nie był używany w kolejnych eksperymentach in vivo . Sekwencjonowanie cDNA wykazało, że nastąpiło przeskakiwanie eksonów 6 - 9, a immunocytochemia z barwieniem DYS-2 wykazała przywróconą ekspresję dystrofiny w leczonych próbkach. Psy leczone AON wykazały znaczny wzrost włókien dystrofinowo-dodatnich. Wskazuje to, że eksony 6 - 8 były pomijane i wytwarzano skrócone białko. Ilość włókien dystrofinowo-dodatnich wzrastała, gdy stosowano koktajl AON i była proporcjonalna do dawki AEN. Immunobloty wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny u psów leczonych morfoliną układową. Mięśnie szkieletowe miały zmienny poziom włókien dystrofiny; Jednak tkanka serca leczona morfoliną wykazała niewielką poprawę ekspresji dystrofiny. Ponieważ dystrofina ma wysoką masę cząsteczkową (427 kDa), wykrycie małych ilości dystrofiny może być trudne. Dla uzyskania najlepszych rezultatów zastosowano żel Tris-acetate oraz metodę transferu półsuchego. Barwienie HE wykazało poprawę histopatologii u psów leczonych morfoliną. Włókna jądrowe (CNF) są oznaką niezdrowych mięśni i reprezentują cykle degeneracji i regeneracji mięśni. Psy leczone morfoliną CXMD wykazały zmniejszenie odsetka CNF w porównaniu z psami nieleczonymi CXMD. Ocena kliniczna wykazała poprawę objawów, takich jak zwiększona zdolność chodzenia i biegania, u zwierząt leczonych morfoliną. Uważa się, że twardość mięśni odzwierciedla atrofię mięśni, dlatego została uwzględniona w schemacie klasyfikacji ⁵⁹. Oceniano twardość mięśni ud (kończyn tylnych); jednak wykluczyliśmy mięśnie sartoriusa czaszki, ponieważ mają one tendencję do wykazywania hipertrofii, a nie atrofii w CXMD. Leczone psy wykazywały niższe oceny i miały szybsze czasy w teście biegowym na 15 m. Lepsze czasy w teście 15 m wskazują na poprawę funkcji mięśni ⁴⁰. Wyższe ogólne wyniki oceny wskazują na zły stan zdrowia i zwiększony zanik mięśni.

Chociaż wyniki te są obiecujące, pomijanie wielu eksonów nadal wiąże się z wieloma wyzwaniami, które będą musiały zostać pokonane, zanim technika ta będzie miała zastosowanie kliniczne. Tkanka serca nadal wykazuje zmniejszony wychwyt AON, prawdopodobnie z powodu różnicy w transporcie komórkowym między tkanką sercową a tkanką szkieletową. Nie zaobserwowano żadnych skutków toksycznych u zwierząt przy obecnych schematach dawkowania; jednak należy wykonać więcej pracy w celu oceny toksyczności długoterminowej, zanim stosowanie koktajli AON będzie mogło przejść do badań klinicznych. Trudno jest uzyskać zgodę na leki koktajlowe AEN, ponieważ agencje regulacyjne definiują każdą sekwencję AON jako unikalny lek. Oznacza to, że każda sekwencja w koktajlu musiałaby być indywidualnie testowana pod kątem bezpieczeństwa, co wymagałoby więcej czasu i więcej pieniędzy. Kolejną przeszkodą w stosowaniu przeskakiwania wieloeksonów w warunkach klinicznych jest duża ilość pośrednich produktów białkowych wytwarzanych o nieznanych funkcjach. Białka te mogą potencjalnie prowadzić do nieprzewidywalnych skutków ubocznych, w zależności od indywidualnej mutacji ²². Ponadto wzorce mutacji dostępne w obecnych dystroficznych modelach psów są ograniczone. Istnieje niewiele naturalnie występujących mutacji i nie wszystkie mutacje są przydatne do badania pomijania wielu eksonów. Dystroficzny model świni zapowiada się na dobrą alternatywę dla przyszłych badań nad pomijaniem eksonów DMD ^{33, 34}.

Modele psów DMD mają pewne zalety w porównaniu z innymi modelami DMD. Ponieważ jest to większy model zwierzęcy, możliwa jest ocena kliniczna i rezonans magnetyczny, co pozwala na bardziej szczegółową analizę. Ponieważ psy są dużymi zwierzętami, są również bardziej odpowiednie do badań toksykologicznych i lepiej reprezentują chorobę człowieka w porównaniu z modelem mysim. Modele psów mają również sekwencje genów DMD , które są bardziej podobne do ludzi ^{23, 34, 45}.

Chociaż jest to technicznie trudne, podejście polegające na pomijaniu wielu eksonów może ostatecznie przynieść korzyści >90% pacjentów z DMD ²⁴. To sprawia, że jest to znacznie lepsza alternatywa dla pomijania pojedynczego eksonu, ponieważ pomijanie pojedynczego eksonu ma zastosowanie tylko do niewielkiej podgrupy pacjentów. Ponadto pomijanie wielu eksonów pozwoli nam wybrać wzorce delecji, które optymalizują funkcjonalność skróconych białek dystrofiny. Na przykład delecja eksonów DMD 45 - 55 wiąże się z wyjątkowo łagodnymi objawami lub osobami bezobjawowymi ^14,19,60-63. Przeskakiwanie wielu eksonów eksonów 45 - 55 wykazano już w mysim modelu DMD z delecją eksonu 52 (mdx52) przy użyciu ogólnoustrojowych wstrzyknięć vPMO ^22,26. Stosowanie koktajlowych vPMO wykazano również w innych postaciach dystrofii mięśniowej, takich jak wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy (FCMD). FCMD jest spowodowany uwięzieniem eksonów, w którym nieprawidłowy splicing mRNA jest spowodowany insercją retrotranspozonu. Wykazano, że vPMO ratują wzorzec splicingu zarówno w mysim modelu FCMD, jak i w ludzkich liniach komórkowych ⁶⁴. Chemie nowej generacji AON, wykazujące wyższą skuteczność i niższą toksyczność, ułatwiłyby skuteczne zastosowanie podejścia z pominięciem wielu eksonów do zastosowań klinicznych. Ponadto przeskakiwanie wielu eksonów może być potencjalnie stosowane w innych zaburzeniach genetycznych, takich jak dysferlinopatie ^{24, 65}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2'OMePS Transfekcja mioblastów psów
3 ml płytki 6-dołkowe	IWAKI	5816-006
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni (DMEM)	Gibco	11965-092
Surowica bydlęca płodu (FBS)	HyClone	SH30071.01
Penicylina	Sigma-Aldrich	P4333	200 U/ml
Lipofektyna	Invitrogen	18292-011	Całkowita objętość 100 ml w pożywce opti-MEM w stosunku 2:1 dla lipofektyny. 10 ml lipofektyny na 5 mg RNA.
2' OMePS	Eurogentec		Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) i Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).
Surowica dla koni	Gibco	16050-114	2%
streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333	200 μ g/ml
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Insulina
Transfekcja morfolino mioblastów psów Cały materiał z MePS Transfekcja mioblastów psów do hodowli
morfolinos antysensownych	Gene-tools		Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),  Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)                                                    Rozcieńczyć do końcowej objętości 100 l w pożywce opti-MEM.                                    120– 200 mg/kg morfoliny w stężeniu 32 mg/ml w soli fizjologicznej
Endo-Porter	Gene-tools
guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroform	Invitrogen	15596-018	1  ml/plate
RNA Ekstrakcja i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)
guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroform	Invitrogen	15596-018	1  ml/płytkę
Chloroform	Sigma-Aldrich	P3803	200 μ l
Probówki 1,5 ml	Eppendorf	22363204
Wirówka	Beckman-Coulter
75% Etanol	Sigma-Aldrich	34852
Starter do przodu w eksonie 5	Invitrogen		CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA                                                    1.5 μ l 10 μ M
Odwrócony starter w eksonie 10	Invitrogen		TGCTTCGGTCTCTCTCAATG                                                        1.5 μ l 10 μ M
dNTPs	Clontech	3040
Jednoetapowy zestaw RT-PCR	Qiagen	210210
Termocykler	Scinco
komplementarne sekwencjonowanie DNA (cDNA)
Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen	28704
Wirówka
Zestaw sekwencjonowania cyklu Terminator v3.1	Biosystemy stosowane	4337454
Zastrzyki domięśniowe lub otwarta biopsja mięśni
Narzędzia			Nożyczki, skalpel, igła, nić chirurgiczna
Maść weterynaryjna
Jodofory	webtextiles	12190-71-5
chloroheksydyna	Peridex	12134
Serwety chirurgiczne
Peelingi
Maseczka do twarzy
Rękawice chirurgiczne
Nakrycie głowy
Tiopental sodu	Mitsubishi Tanabe Pharma		20 mg/kg
Laboratoria Isoflurane	Abbott	05260-05	2-3%
Morfoliny antysensowne	Gene-tools		Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),  Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)                                                    Rozcieńczyć do końcowej objętości 100 l w pożywce opti-MEM.                                    120– 200 mg/kg morfolinosu w stężeniu 32 mg/ml w soli fizjologicznej
27  G Igły	TERUMO	SG3-2325
Strzykawka 50 ml	TERUMO	SG2-03L2225
			buprenorfiny
Depresor do języka
cefaleksyna		15 do 30 mg/kg
cefazolina		15 do 30 mg/kg
buprenorfina		0,01 mg/kg
chlorowodorku buprenorfiny	0,02 mg/kg
Zastrzyki ogólnoustrojowe
Pompa infuzyjna strzykawki	Muromachi
22  G Igły do montażu na miejscu	TERUMO	SG3-2225
27  G Igły	TERUMO	SG3-2325
Strzykawka 50 ml	TERUMO	SG2-03L2225
Saline	Ohtsuka-Pharmaceutical	28372
Kliniczna ocena psów
Kamera wideo
Stoper
Rezonans magnetyczny (MRI)
3 Tesla MRI l
			ludzkich o średnicy 18 cm/długości 18 cm
Pobieranie i przygotowanie mięśni (sekcja zwłok)Tiopental sodu
	Mitsubishi Tanabe Pharma		20 mg/kg
Laboratoria Isoflurane	Abbott	05260-05	2-3%
		tragakantowa	10-20 ml
Ciekły azot
Krążki korkowe	Iwai-kagaku	101412-806
Pęseta
do suchego lodu
Poli-L-lizyna– szkiełka powlekane	Fisher	22-037-216
Cryostat Microsystem	Leica		CM1900
Immunohistochemia
DYS1	Nowokastra	NCL-DYS1	Rozcieńczenia 1:150
DYS2	Nowokastra	NCL-DYS2	Rozcieńczenia 1:150
Alexa 594 koza antymysz IgG1	Invitrogen	A-21125	1:2,500 rozcieńczenia
Alexa 594 koza antymysz IgG2	Invitrogen	A-11005	1:2,500 rozcieńczenia
DAPI	Invitrogen	D1306	Zawiera środek montażowy
Kozia surowica	Komora wilgotnościowa Invitrogen	10000C	15%
PBS
	Laboratorium Naukowe	197-BL
Zjeżdżalnia komorowa	Laboratorium
154453 Okulary nakrywkowe	Fisher	12-540A
Hydrofobowy długopis barierowy
Mikroskop fluorescencyjny			594 nm przy 20-krotnym powiększeniu.
Western Blotting
woda destylowana
Homogenizator ręczny
2 razy; Bufor ładowania SDS Laemmli			0,1 mln Tris– HCl (pH 6,6), 2% (w/v) SDS, 2% (0,28  M) beta-merkaptoetanol, 20% glicerol, 0,01% błękit bromofenolowy
Żele SDS	Bio-Rad	161-1210	5% żele SDS o rozdzielczości 5%
	Invitrogen	Invitrogen, WG1601BOX	membrana 3-8%
PVDF	GE	10600021
do pracy metanolu
(10 razy;)			250 mM Tris-Base, 1,920 mM Glycine
Running Buffer (1&razy;)			10% 10&krotny bufor, 20% metanol
0,05% PBS/Animacja 20 (PBST)			2 000 ml                            3 razy; 200 ml do prania
PBST/5% mleka w proszku			100 ml
Zestaw do oznaczania białek	BCA	T9650
Tween 20	Sigma	P5927
Mocznik	Sigma	U5378
Beta merkaptoetanol	Millipore	ES-007-E
SDS	Sigma	L3771
Tris-Acetate	Sigma
Tris HCl	Sigma	T3253
Glicerol	Sigma	G8773
Bufor ładowania/próbki do Western blotting	NuPage Invitrogen	NP007
NaCl	Sigma	S3014
PMSF	Sigma	P7626
Inhibitor koktajlu proteazy
			mM Kwas 6-aminokapronowy + 20%
Bufor			0,03 M Tris Base + 20%
Metanol Skoncentrowany bufor			0,3 M Tris zasada + 20% metanol
przeciwciało desminy	Abcam	ab8592
DYS1	Nowokastra	NCL-DYS1	Rozcieńczenia 1:150
Oprogramowanie