Artykuł metodologiczny

Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów

19.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53776

⸱

24 maja 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Department of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pomijanie eksonów jest obecnie najbardziej obiecującą opcją terapeutyczną dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Aby rozszerzyć możliwości zastosowania u pacjentów z DMD i zoptymalizować stabilność/funkcję powstałych skróconych białek dystrofiny, opracowano podejście z pominięciem wielu eksonów przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych i zademonstrowaliśmy ogólnoustrojowe ratowanie dystrofiny w modelu psów.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest jedną z najczęstszych śmiertelnych chorób genetycznych na świecie, spowodowaną mutacjami w genie dystrofiny (DMD). Przeskakiwanie eksonów wykorzystuje krótkie cząsteczki podobne do DNA/RNA zwane oligonukleotydami antysensownymi (AON), które przywracają ramkę odczytu i wytwarzają krótsze, ale funkcjonalne białka. Terapia z pominięciem eksonów napotyka jednak dwie poważne przeszkody: ograniczoną możliwość zastosowania (tylko 13% pacjentów może być leczonych pojedynczym lekiem AEN) oraz niepewną funkcję skróconych białek. Problemy te zostały rozwiązane za pomocą podejścia koktajlowego AON. Podczas gdy około 70% pacjentów z DMD może być leczonych przez pomijanie pojedynczych eksonów (wszystkie eksony łącznie), można potencjalnie leczyć ponad 90% pacjentów z DMD, jeśli można zrealizować pomijanie wielu eksonów za pomocą koktajlowych leków antysensownych. Psi model psiej dystrofii sprzężonej z chromosomem X (CXMD), którego fenotyp jest bardziej podobny do ludzkich pacjentów z DMD, został wykorzystany do przetestowania skuteczności ogólnoustrojowej i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów w eksonach 6 i 8. Model psa CXMD zawiera mutację miejsca splicingu w intronie 6, co prowadzi do braku eksonu 7 w mRNA dystrofiny. Aby przywrócić ramkę odczytu w CXMD, wymagane jest pominięcie wielu eksonów 6 i 8; dlatego CXMD jest dobrym średniej wielkości modelem zwierzęcym do testowania skuteczności i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów. W obecnym badaniu zaprojektowano koktajl antysensownych morfolinos ukierunkowanych na ekson 6 i ekson 8, który przywrócił ekspresję dystrofiny w mięśniach szkieletowych na całym ciele. Przedstawiono metody transfekcji/iniekcji oligonukleotydów koktajlowych oraz ocenę skuteczności i bezpieczeństwa przeskakiwania wieloeksonowego w modelu psa CXMD.

Wprowadzenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest recesywną chorobą mięśni sprzężoną z chromosomem X, charakteryzującą się postępującym osłabieniem mięśni, po raz pierwszy opisaną przez dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD jest powszechną chorobą genetyczną dotykającą około 1 na 3500 chłopców na całym świecie, przy czym każdego roku rodzi się około 20 000 dotkniętych nią dzieci 2,3. Rozwój motoryczny jest opóźniony, a zaburzenia chodu obserwuje się we wczesnym dzieciństwie 4, a następnie uzależnienie od wózka inwalidzkiego około wczesnych nastolatków. Śmierć zwykle następuje w wieku od 20 do 30 lat z powodu niewydolności oddechowej lub serca 5-8 lat. Obecnie nie ma lekarstwa na DMD. Leczenie glikokortykosteroidami może do pewnego stopnia spowolnić postęp zwyrodnienia mięśni, ale wiąże się ze znaczącymi skutkami ubocznymi, w tym otyłością i cukrzycą 2,7,8. DMD wynika z mutacji w genie dystrofiny (DMD), co prowadzi do utraty funkcjonalnego białka dystrofiny. DMD jest niezwykle dużym genem z ponad 2 milionami par zasad i 79 eksonami 9,10. Mutacje delecji, nonsensu i duplikacji prowadzące do mutacji poza ramką są najczęstszą przyczyną fenotypu DMD. Regiony eksonów 3 - 9 i eksonów 45 - 55 są określane jako "hotspoty mutacji", ponieważ większość pacjentów ma mutacje delecyjne w tych częściach genu, co prowadzi do niefunkcjonalnej dystrofiny u pacjentów z DMD 3,9,11-16. Dystrofina funkcjonuje w kompleksie dystrofina-glikoproteina (DGC), który odgrywa główną rolę w stabilizacji błony mięśniowej. N- i C-końce są najważniejszymi domenami dla funkcji, podczas gdy centralna domena pręcików odgrywa mniej ważną rolę 3,9,17. Obserwacja łagodnego fenotypu związanego z dystrofią mięśniową Beckera (BMD), która wynika głównie z mutacji w obrębie genu DMD, zainspirowała zastosowanie pomijania eksonów w leczeniu DMD. Pacjenci z BMD mają skrócone, ale funkcjonalne białko dystrofiny, które utrzymuje oba końce 3,6,18. Teoretycznie przeskakiwanie eksonów może przywrócić ramkę odczytu, co skutkuje skróconymi, ale funkcjonalnymi białkami dystrofiny podobnymi do tych obserwowanych w BMD 3,19.

Wiele typów antysensownych oligonukleotydów (AON) zostało przetestowanych w badaniach klinicznych, w tym 2'O-metylowane fosforotioniany(2'OMePS) i oligomery morfolino-oligomerów fosforodiamidanu (PMO). Zbadano pomijanie eksonów 51 i 53 przy użyciu tych AON i chociaż wyniki są obiecujące, pomijanie pojedynczych eksonów ma ograniczone zastosowanie, ponieważ jest specyficzne dla mutacji 3, 19, 20,21, 22-26. Pozostają również pytania o stabilność powstałych skróconych białek dystrofiny wytwarzanych z pominięcia pojedynczego eksonu 22,23. Ponadto niektórzy pacjenci wymagają pominięcia więcej niż jednego eksonu w celu przywrócenia ramki odczytu 3. Chociaż technicznie trudniejsze, pomijanie wielu eksonów jest jedną z metod, która może rozwiązać te problemy 3,19. Przeskakiwanie wielu eksonów zostało wcześniej wykazane w dystroficznym liniach komórkowych psów i ludzi in vitro. Dodatkowo, mysie i psie modele dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X (CXMD) mdx52 zostały wykorzystane w badaniach in vivo 22,24-27. Użyto tutaj psów rasy beagle z dystrofią mięśniową sprzężoną z chromosomem X (CXMDJ), ponieważ ramka odczytu CXMDJ może zostać przywrócona przez pominięcie wielu eksonów eksonów 6 i 8 lub dodatkowych eksonów (np. eksonów 3 - 9) (ryc. 1). CXMD oparty na beagle ma ten sam wzorzec mutacji, co model dystrofii mięśniowej Golden Retriever (GRMD), ale beagle są mniejsze i tańsze w utrzymaniu ze względu na ich rozmiar ciała, co stanowi użyteczny model dla DMD 28,29. Psy z CXMD bardziej naśladują ludzki fenotyp DMD niż mniejsze modele zwierzęce, takie jak gryzonie, i są bardziej wiarygodne w ocenach toksykologicznych 3,22,30,31 (Figura 2). Psy z CXMD wykazują postępujący rozpad mięśni, zaburzenia chodu oraz problemy z sercem i układem oddechowym podobne do tych obserwowanych w DMD. W porównaniu z pomijaniem pojedynczych eksonów, pomijanie wielu eksonów ma zastosowanie do znacznie większego odsetka pacjentów. Spośród trzech najczęstszych typów mutacji (delecje, nonsens i duplikacje), 80 - 98% pacjentów może być leczonych poprzez pomijanie wielu eksonów 14,32,33, podczas gdy 45% wszystkich pacjentów z DMD może odnieść korzyści ze specyficznego pomijania egzonów 45 - 55 3,19,22,34.

Wraz z rozwojem modyfikowanych morfolinów, poprawiła się skuteczność koktajli AON w ułatwianiu pomijania eksonów. Bogate w argininę, penetrujące komórki, sprzężone z peptydami PMO (PPMO) i vivo-morpholinos (vPMO) to substancje chemiczne AEN, które znacznie poprawiły zdolność i stabilność przenikania do komórek 3,35-38. Utrzymują się obawy dotyczące długoterminowej toksyczności AEN; Poczyniono jednak znaczne postępy. Modyfikacje chemiczne wprowadzone do morfolinosów znacznie zmniejszają efekty niezamierzone, a badania przedkliniczne nie wykazały znaczących skutków toksycznych 3,22,39,40. Pozostałym wyzwaniem dla pomijania wielu eksonów jest obecny wymóg, aby każdy pojedynczy AON był testowany pod kątem toksyczności samodzielnie, jako pojedynczy lek, a nie razem jako koktajl 3,19,22,41,42. W badaniach DMD obejmujących zarówno jedno-, jak i wieloeksonowe pomijanie ukierunkowane na serce, nastąpiła niewielka poprawa w dystroficznej tkance serca. Uważa się, że skuteczność morpholinos w sercu jest niska ze względu na słabą zdolność przenikania do komórek. PPMO sprzężone z peptydami poprawiły zdolność AON-ów do przenikania do komórek serca, zwiększając ilość funkcjonalnego białka dystrofiny uratowanego w sercu 3,19,38.

Tutaj nasze podejście do koktajli AON jest szczegółowo omówione, w tym projektowanie sekwencji AON za pomocą oprogramowania ESEfinder 43. Opisano również protokoły eksperymentów na psach z przeskakiwaniem wieloeksonowym. Beagle CXMDJ zostały użyte do eksperymentów z pominięciem eksonów 6 i 8. Przeskakiwanie wielu eksonów w modelu CXMD u psów daje obiecujące wyniki, ale nadal istnieją wyzwania, które należy pokonać, zanim będą miały zastosowanie kliniczne.

Protokół

Wszystkie wymienione poniżej protokoły są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami określonymi przez Narodowe Centrum Neurologii i Psychiatrii (NCNP) w Japonii. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NCNP.

1. Konstrukcja antysensownych oligonukleotydów

  1. Użyj programów ratunkowych ESE i ESEfinder do wykrywania witryn ESE 44, 45-47.
  2. Zaprojektuj sekwencje 25 par zasad (bp), które są antysensowne w stosunku do eksonów, które mają być celowane. Docelowe eksony 6 i 8 w modelu psa (ryc. 1).
    1. Stosować sekwencje 25 - 30 pz dla PMO (Tabela 1) lub 25 pz dla 2'OMePS. Aby zaprojektować sekwencje o długości 25 pz, wybierz sekwencje, które znajdują się w regionie docelowym. Weź pod uwagę strukturę drugorzędową, unikanie heterodimerów, motywy wzmacniające splot eksonów i zawartość GC, aby stworzyć stabilne sekwencje 43. Ataki AON powinny być ukierunkowane na co najmniej jedną z lokalizacji ESE zidentyfikowanych przez wyżej wymienione oprogramowanie.
    2. Wybierz AON, których zawartość GC jest mniejsza niż 65%, z mniej niż 4 kolejnymi literami "G" i nie zawierają sekwencji samouzupełniających. Użyj oprogramowania NCBI Blast, aby przewidzieć niewłaściwe miejsca wyżarzania 22,48,49.
  3. Wybierz odpowiednią chemię szkieletu AAN. Do eksperymentów in vitro należy stosować 2'O-metylowe oligonukleotydy (2'OMePS) lub morfolinosy. Do eksperymentów in vivo należy użyć 2'OMePS, morpholinos lub vPMOs. 3,19,48,50

2. Eksperymenty in vitro (przeskakiwanie eksonów 6 i 8 w modelu CXMD)

  1. 2'OMePS Transfekcja mioblastów psów
    1. Hodowla mioblastów CXMD w 3 ml pożywki wzrostowej na płytkach 6-dołkowych. Nasiona 1 - 5 x 103 komórki/cm2 z 0,5 ml/cm2 pożywki dla mioblastów. Jako pożywkę wzrostową należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) 40.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do uzyskania 60 - 80% konfluencji. Trwa to około 12 do 24 godzin.
    3. Rozcieńczyć kationowy środek transfekcyjny liposomów do łącznej objętości 100 μl w zredukowanej pożywce surowicy (środek transfekcyjny w stosunku 2:1: AONs, np. 10 μl lipofektyny vs. 5 μg AONs). Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 - 45 minut.
    4. Rozcieńczyć AON (2'OMePS lub morpholinos) do końcowej objętości 100 μl w zredukowanym pożywce surowicy.
    5. Połączyć rozcieńczony środek transfekcyjny z rozcieńczonymi AON i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
    6. Podczas gdy mieszanina środka transfekcyjnego/AON znajduje się w temperaturze pokojowej, usuń stare media z komórek poprzez aspirację i umyj komórki pożywką.
    7. Dodać 0,8 ml pożywki do mieszaniny środka do transfekcji/AON, a następnie dodać cały roztwór do świeżo umytych komórek. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    8. Po inkubacji zastąp pożywkę pożywką różnicującą (DM); Różnicowanie może potrwać do 10 dni. Sprawdź, czy zróżnicowanie nastąpiło począwszy od około 3 dnia. Pożywką różnicującą jest DMEM z 2% surowicą końską, 200 U/ml penicyliny, 200 mg/ml streptomycyny i 10 μg/ml insuliny.
  2. Transfekcja morfolino mioblastów psów
    1. Hodowla mioblastów CXMD w pożywce wzrostowej, jak opisano w kroku 2.1.
    2. Przełącz się na pożywkę różnicującą (DM) i dodaj 0,1 mM podstawowej morfoliny do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Podgrzewać morfoliny koktajlowe w temperaturze 65 °C przez 10 minut przed transfekcją lub wstrzyknięciem, aby uniknąć agregacji AEN. Dodać odczynnik dostarczający peptyd 39,51 i dostosować do końcowego stężenia 3-6 μM.
    3. Po 16 - 48 godzinach inkubacji zbierz komórki do ekstrakcji RNA. Dodać 1 ml kwaśnego tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu do komórek, aby oderwać komórki od płytki. Po tym kroku wykonaj ekstrakcję RNA.
      1. Alternatywnie, dodać trypsynę tak, aby pokryła wszystkie komórki i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
        Uwaga: Jeśli zamierzasz przeprowadzić immunochemię, do hodowli należy użyć szkiełek z komorą. Po różnicowaniu komórki można utrwalić za pomocą paraformaldehydu (PFA) (4% przez 10 min).
  3. Ekstrakcja RNA i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)
    1. Po różnicowaniu komórek w miotuby, usunąć pożywkę i dodać 1 ml kwaśnego tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu; inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml. Połączyć z 200 μl chloroformu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aż będą widoczne trzy oddzielne warstwy. Trzy warstwy od góry do dołu to: warstwa RNA, warstwa DNA i warstwa białka.
    3. Wirować w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć górną warstwę supernatantu i umieścić w probówce z 500 μl izopropanolu (w przypadku zatrzymania się na tym miejscu należy przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C). Odwirować supernatant w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; po odwirowaniu zachowaj powstały osad RNA i wyrzuć supernatant.
    4. Przemyć granulat etanolem i odwirować przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odparować resztki etanolu, odwracając rurkę na 15 minut, a następnie dodać 15 - 30 μl wody wolnej od RNaz. Określić ilościowo całkowite stężenie RNA za pomocą spektroskopii US/VIS przy długości fali 260 nm.
    5. Połącz odczynniki wymagane do reakcji RT-PCR: 1,5 μl 10 μM startera do przodu, 1,5 μl 10 μM startera odwrotnego, 1 μl dNTP, 5 μl jednoetapowego buforu zestawu PCR, 0,7 μl inhibitora RNazy, 1 μl mieszaniny enzymów z jednoetapowego zestawu PCR i 200 ng RNA. Po ich wymieszaniu dodać wodę do końcowej objętości 25 μl.
    6. Umieść mieszaninę w termocyklerze. Uruchom 30-minutowy cykl w temperaturze 50 °C, 15-minutowy cykl w temperaturze 95 °C, następnie 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, 60 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę. Na koniec uruchom 10-minutowy cykl w temperaturze 72 °C. Produkt PCR należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C lub -20 °C
  4. Sekwencjonowanie komplementarnego DNA (cDNA)
    1. Zidentyfikuj prążki pominięte w eksonie 6 - 9 za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załadować 5 μl każdej próbki do studzienek z 1,5% żelem agarozowym, przepuścić 135 V przez żel przez 5 minut, a następnie 120 V przez 20 minut. Następnie inkubować żel w barwieniu żelu DNA w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wizualizacja pasm za pomocą oprogramowania do obrazowania.
    2. Wytnij pasmo zainteresowania za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
      1. Wyciąć fragment DNA i rozpuścić plasterek żelu przy użyciu 200 μl żelu NTI/100 mg. Pozostaw na 5 do 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Następnie przenieś do rurki z membraną krzemionkową.
      2. Wirować przy 11 000 x g przez 30 sek. Przemyć dwukrotnie 700 μl buforu NT3 przed ponownym odwirowaniem przy 11 000 x g przez 30 sek.
      3. Wysuszyć membranę krzemionkową przez odwirowanie przy 11 000 x g przez 1 min.
      4. Dodać 15 - 30 μl buforu NE i pozostawić na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować przy 11 000 x g przez 1 minutę. Usuń żel krzemionkowy i trzymaj zawartość w tubce.
    3. Użyj zestawu do sekwencjonowania, aby określić sekwencję zgodnie z protokołem producenta.

3. Zastrzyki domięśniowe lub otwarta biopsja mięśni

  1. W celu utrzymania sterylnych warunków podczas operacji przeżycia należy usunąć włosy za pomocą maszynki do strzyżenia w obszarze otaczającym miejsce operacji (kończyna tylna). Użyj jodoforów lub chloroheksydyny jako środka dezynfekującego. Używaj sterylnych obłożeń na miejsce operacji, umieszczając je i zabezpieczając na całym zwierzęciu i stole operacyjnym.
    1. Na salę operacyjną należy nosić czyste fartuchy, maseczki na twarz, nakrycie głowy, sterylne rękawiczki i specjalne obuwie na salę operacyjną52,53.
  2. Wstrzyknąć psom z CXMD 20 mg/kg tiopentalu sodu w celu znieczulenia. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
  3. Stosować 2-3% inhalację izofluranu w celu utrzymania znieczulenia ogólnego (ryc. 3). Sprawdź odruchy mięśniowe i monitoruj tętno i częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia. Normalna częstość oddechów (RR), tętno (HR) i SpO2 w znieczuleniu ogólnym są następujące: RR: 10 - 20 oddechów/min; SpO2: 95 - 100%, HR: 80 - 120 uderzeń na minutę (bpm).
  4. Za pomocą skalpela przeciąć skórę nad kością piszczelową czaszki (CT), znaną również jako piszczel przednia (TA), i wykonać pojedyncze cięcie około 5 cm wzdłuż (dla młodych dorosłych psów). Aby oznaczyć miejsca wstrzyknięć, należy zszyć powięź głęboką za pomocą igły chirurgicznej i nici chirurgicznej i wykonać dwa znaczniki ściegu w odstępach co 2 cm.
  5. Wstrzyknąć pożądane stężenie AON do mięśnia za pomocą igły 27 G. Pożądane stężenie różni się w zależności od warunków leczenia. W przypadku tomografii komputerowej należy podać dwa wstrzyknięcia o objętości 1 ml każde, co daje łącznie 1,2 mg PMO w postaci koktajlu (0,4 mg każdy PMO) lub 0,4 mg vPMO w postaci koktajlu (po 0,13 mg każdy vPMO). W przypadku mięśnia kończyny przedniej prostownika nadgarstka łokciowego (ECU) należy wstrzyknąć dwie objętości po 0,5 ml każda, co daje łącznie 1,2 mg PMO koktajlu (0,4 mg każdy PMO) lub 0,4 mg koktajlowych vPMO (0,13 mg każdy vPMO). Pozostaw igłę na 1 minutę. Użyj równej ilości każdego AON do koktajlu.
  6. Wykonaj otwartą biopsję mięśni, usuwając kawałek tkanki mięśniowej o długości około 2 cm z mięśnia CT za pomocą skalpela chirurgicznego.
  7. Przejdź do kroku 6.5, aby przygotować próbkę mięśni.
  8. Za pomocą igły należy podać domięśniowo wstrzyknięcie 0,02 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny przed przebudzeniem ze znieczulenia ogólnego. Połóż powięź mięśniową i skórę z powrotem na mięśniu i zszyj je za pomocą nici wchłanialnej 3-0 i nici nylonowej 3-0 odpowiednio do powięzi mięśniowej i zamknięcia skóry.
  9. Trzymając usta otwarte, ustal, czy odruch wymiotny powrócił; gdy odruch wymiotny powrócił, ekstubuj psa.
  10. Podawać od 15 do 30 mg/kg cefazoliny lub cefaleksyny (antybiotyki) przez okres do 3 dni we wstrzyknięciu dożylnym lub domięśniowym, aby zapobiec zakażeniu.
  11. Usuń szwy w ciągu siedmiu dni. Nie pozostawiaj psa bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i nie pozwalaj psu na interakcję z innymi zwierzętami, dopóki nie nastąpi pełne wyzdrowienie. Utrzymuj rurki dotchawicze na miejscu tak długo, jak to możliwe i wyjmij je, gdy zwierzę zacznie żuć lub połykać. Monitoruj tętno, oddech i nawodnienie zwierzęcia, aby upewnić się, że są stabilne i mieszczą się w normalnych granicach.
  12. W przypadku opieki pooperacyjnej należy zapewnić znieczulenie przez 3 dni (np. buprenorfina 0,01 mg/kg) i wsparcie w pielęgnacji, w tym ciche, ciemne miejsce odpoczynku, odpowiednią pielęgnację ran i bandaży, miękką powierzchnię spoczynkową, nawodnienie płynami doustnymi lub pozajelitowymi oraz powrót do normalnego karmienia poprzez stosowanie bardzo smacznych pokarmów lub smakołyków. Jeśli jakiekolwiek zwierzęta wymagają dodatkowego leku, Wykonać domięśniowe wstrzyknięcie 0,3 mg/kg winianu butorfanolu w zależności od objawów bólowych.
    Uwaga: Psy odczuwające ból mogą gryźć, drapać lub strzec bolesnych obszarów, a jeśli są dotykane, mogą być niezwykle lękliwe lub agresywne. Ponadto ból w jednej kończynie zwykle powoduje utykanie lub trzymanie się chorej kończyny przy próbach jej użycia. W takich sytuacjach należy wykonać wstrzyknięcie domięśniowe w postaci 0,02 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny co 6 - 8 godzin.

4. Zastrzyki ogólnoustrojowe

Uwaga: Ta procedura może być powtarzana co tydzień lub co dwa tygodnie przez żądaną liczbę tygodni.

  1. Unieruchamiaj psy ręcznie i delikatnie, zmuszając psa do położenia się, a następnie ułóż ręce na ramionach i biodrach, aby utrzymać psa na miejscu przez cały zabieg.
  2. wstrzykiwanie AONs; 120 - 240 mg/kg koktajlowe PMO (40 - 80 mg każdy AON) za pomocą igły do zamieszkania żylnego do żyły kończyny (znanej jako żyła głowowa lub odpiszczelowa). Ilość wstrzykiwanego AON zależy od warunków doświadczalnych. Użyj równej ilości każdego AON do koktajlu.
  3. Za pomocą pompy infuzyjnej lub sterownika strzykawkowego wstrzyknąć łącznie 50 ml z szybkością 2,5 ml/min przez 20 minut, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Powtarzaj wstrzyknięcia co tydzień lub co dwa tygodnie (co dwa tygodnie) co najmniej 5 razy, ponieważ ekspresja dystrofiny będzie się kumulować przy wielokrotnych wstrzyknięciach.
  4. Wykonuj badania krwi co tydzień w celu zbadania toksyczności.
    1. Za pomocą igły pobrać 3 ml krwi — 0,5 ml w przypadku pełnej morfologii krwi (CBC) i 2,5 ml w przypadku innych — z jednej z żył podskórnych kończyny przedniej lub tylnej. Uwzględnij morfologię krwi, gamma-glutamylotransferazę (GGT), aminotransferazę asparaginianową (AST), azot mocznikowy we krwi (BUN), aminotransferazę alaninową (ALT), kinazę kreatynową (CK) i kreatyninę podczas badania pobranej krwi, postępując zgodnie z instrukcjami producenta z zestawów do badania krwi. Kategoria 40,54
      2. TGL

5. Klasyfikacja kliniczna psów

  1. Skonfiguruj kamerę wideo i nagrywaj zachowanie i chód psa. Nagraj całe spotkanie z psem, ponieważ będzie to służyć jako odniesienie podczas oceniania psa; Oznacza to, że każdy film będzie miał inną długość w zależności od umiejętności i chęci psa. Użyj domyślnych parametrów nagrywania. Filmowanie tworzy zapis oceny, dzięki czemu można go przejrzeć w późniejszym terminie.
  2. Stopień chodu i zaburzenia ruchu.
    1. W przypadku zaburzeń chodu i ruchu należy stosować następujące stopnie:
      Stopień 1 = brak, stopień 2 = siedzenie z wysuniętą tylną kończyną, stopień 3 = królicze skoki z tylnymi kończynami, stopień 4 = chód szurający i stopień 5 = niezdolność do chodzenia.
    2. W przypadku zaburzeń ruchomości użyj następujących stopni: stopień 1 = brak, stopień 2 = leżenie więcej niż normalnie, stopień 3 = niezdolność do skakania na tylnych kończynach, stopień 4 = rosnące trudności w poruszaniu się i stopień 5 = niezdolność do wstawania i poruszania się.
  3. Zmierz czas, ile czasu zajmuje psu przebiegnięcie 15 m. Odmierz 15 m, umieść psa na linii startu i zachęć go do biegu do znaku 15 m.
  4. Określ zanik mięśni kończyny za pomocą następującej skali ocen:
    Stopień 1 = brak, stopień 2 = podejrzana twardość, stopień 3 = wyczuwalna twardość lub wydaje się cienka, ocena 4 = między ocenami 3 i 5, a klasa 5 = wyjątkowo cienka lub twarda.
  5. Ocena ślinienia się przy użyciu następującej skali: stopień 1 = brak, stopień 2 = od czasu do czasu kapie śliną podczas siedzenia, stopień 3 = trochę śliny podczas jedzenia i picia, stopień 4 = struny śliny podczas jedzenia lub picia, a stopień 5 = ciągłe ślinotok.
  6. Stopień przerostu języka (makroglosja) w następującej skali: stopień 1 = brak, stopień 2 = nieznacznie powiększony, stopień 3 = rozszerzone uzębienie zewnętrzne, stopień 4 = powiększony i nieznacznie pogrubiony, a stopień 5 = powiększony i pogrubiony.
  7. Oceń zdolność psa do połykania za pomocą następującej skali: stopień 1 = brak trudności, stopień 2 = wymaga czasu i wysiłku w przyjmowaniu pokarmu, stopień 3 = trudność w pobieraniu pokarmu z talerza, stopień 4 = trudności w żuciu, połykaniu lub piciu, a stopień 5 = niezdolność do jedzenia.
  8. Oblicz łączną ocenę, dodając wyniki z każdej kategorii (z wyjątkiem testu biegowego na 15 m) 55,
    Uwaga: Badania powinny być zaślepione, aby nie wprowadzać stronniczości.

6. Rezonans magnetyczny (MRI)

  1. Użyj rezonansu magnetycznego o natężeniu 3 Tesli (3T) i cewki kończyn ludzkich o średnicy 18 cm/długości 18 cm, aby uzyskać obrazy kończyn tylnych ważone T2.
  2. Znieczulać zwierzęta, wstrzykując psom CXMD 20 mg/kg tiopentalu. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Stosować 2-3% inhalację izofluranu w celu utrzymania znieczulenia ogólnego.
    1. Sprawdź odruchy mięśniowe i monitoruj tętno i częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia. Normalna częstość oddechów (RR), tętno (HR) i SpO2 w znieczuleniu ogólnym są następujące: RR: 10 - 20 oddechów/min, SpO2: 95 - 100%, HR: 80 - 120 uderzeń na minutę (bpm).
  3. Użyj następujących ustawień, aby uzyskać obrazy ważone T2: TR/TE = 4 000/85 ms, grubość warstwy = 6 mm, odstęp warstwy = 0 mm, pole widzenia = 18 cm x 18 cm, rozmiar matrycy = 256 x 256 i liczba akwizycji = 3 podczas szybkiego echa wirowania (rysunek 4).

7. Pobieranie i przygotowanie mięśni (sekcja zwłok)

Uwaga: Próbki mięśni powinny być pobrane tydzień lub dwa po ostatnim wstrzyknięciu AEN.

  1. Wstrzyknąć psom 20 mg/kg tiopentalu sodu w celu znieczulenia. Stosuj maść weterynaryjną na oczy podczas znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
  2. Stosować 2 - 3% inhalacji izofluranu w celu utrzymania znieczulenia. Sprawdź odruchy mięśniowe i monitoruj tętno i częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia. Normalna częstość oddechów (RR), częstość akcji serca (HR) i SpO2 w znieczuleniu ogólnym są następujące: RR: 10 - 20 oddechów/min; SpO2: 95 - 100%, HR: 80 - 120 uderzeń na minutę.
    1. Eutanazja psów przez wykrwawienie w znieczuleniu ogólnym (tylko do sekcji zwłok). Stosuj wykrwawianie w głębokim znieczuleniu ogólnym, aby uniknąć skutków spowodowanych przez czynniki pochodzenia krwi w analizie molekularnej (np. mięsień sercowy).
  3. Przeanalizuj następujące mięśnie (ryc. 5): CT, prostownik palca długiego (EDL), mięsień brzuchaty łydki, płaszczkowaty, mięsień dwugłowy uda, mięsień prosty uda, biceps brachii, triceps brachii, deltoid, ECU, prostownik nadgarstka promieniowego (ECR), zginacz nadgarstka łokciowego (FCU), zginacz nadgarstka promieniowego (FCR), gracilis, mięśnie międzyżebrowe, mięśnie brzucha, przepona, boczny grzbiet, przełyk, mostek obojczykowo-sutkowy i serce. Aby zbadać toksyczność, należy pobrać próbki nerek i wątroby. Użyj Evansa i Alexandra de Lahunty (2009) jako odniesienia dla techniki preparacji 56.
  4. Przeciąć CT, EDL, mięśnie brzuchate łydki, płaszczkowaty, mięsień dwugłowy uda, mięsień prosty uda, mięsień dwugłowy ramienia, mięsień trójgłowy ramienia, naramienny, ECU, ECR, FCU, FCR, gracilis, mięśnie międzyżebrowe, mięśnie brzucha, boczny grzbiet, przełyk, mostek obojczykowo-sutkowy, serce, nerki i wątrobę na małe odcinki o długości około 1 - 1,5 cm. Zwiń membranę, a następnie pokrój ją na odcinki 1 - 1,5 cm 56.
  5. Ułóż gumę tragakantową tak, aby miała grubość około 0,5 - 1 cm na krążkach korkowych. Oznacz krążki z identyfikacją zwierzęcia i nazwą mięśnia po przeciwnej stronie gumy tragakantowej.
  6. Umieść mięśnie tak, aby ich oś podłużna była prostopadła do korka w gumie tragakantowej.
  7. Umieść korki w pojemniku z izopentanem, który znajduje się w ciekłym azocie. Przesuwaj go stale pęsetą przez 1 minutę lub do całkowitego zamrożenia. Przechowywać mięśnie na korkach w fiolkach w temperaturze -80 °C. Podczas transportu fiolki należy umieścić na suchym lodzie.
  8. Przygotuj szkiełka podstawowe z etykietą identyfikującą zwierzę / nazwą mięśnia i datą.
  9. W kriostacie schłodzonym do temperatury -25 °C zamontuj korek na stojaku. Ustaw grubość przekroju na żądany poziom. Użyj 8 μm do barwienia immunohistochemicznego i 12 μm do barwienia hematoksyliną i eozyną (HE). Do próbek Western blot należy użyć 15 μm. Przytnij około jednej czwartej mięśnia, aby uzyskać płaski mięsień do prawidłowego pobierania próbek mięśni.
  10. Wycinając jedną sekcję mięśnia na raz, umieść co 6sekcję na tym samym szkiełku, jeśli planujesz użyć próbek do immunohistochemii lub barwienia HE. W przypadku stosowania próbek do plam zachodnich, umieścić 30 - 40 odcinków w probówce i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  11. Po przygotowaniu szkiełek należy pozostawić je do wyschnięcia na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.

8. Immunohistochemia

  1. Wyjmij przygotowane szkiełka z magazynu i umieść je w komorze wilgotnościowej, aby utrzymać szkiełka oddzielnie i utrzymać wilgoć. Napełnij komorę wilgotnościową tak, aby dno było pokryte wodą (około 1 mm wody).
  2. Suszyć na powietrzu przez 0,5 godziny. Narysuj kwadrat otaczający próbkę mięśni na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
  3. Dodać 15% surowicy koziej do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować przez 2 godziny w odczynniku blokującym RT In.
  4. Dodaj mysie pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne anty-dystrofiny (DYS-1) lub C-końcowe przeciwciało monoklonalne (DYS-2) do barwienia dystrofiny u psa (rozcieńczenie 1:150). Rozcieńczyć za pomocą środka blokującego w 1,25 ml PBS. Inkubować O/N w lodówce w temperaturze 4 °C.
  5. Myć PBS przez 5 minut, powtórzyć trzy razy. Dodaj przeciwciało drugorzędowe Alexa 594 kozie przeciwciało przeciwko mysiej IgG1 (dla DYS-2) lub IgG2 (dla DYS-1) (1:2,500). Rozcieńczyć odczynnikiem blokującym w PBS zawierającym 0,1% etoksylowany oktylofenol. Inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Myć PBS przez 5 minut, trzy razy. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia. Dodać 1-2 krople (3 ng/ml) roztworu montażowego 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI). Za pomocą pęsety umieść szklaną szkiełko na górnej części sekcji, unikając pęcherzyków.
  7. Zobacz włókna dodatnie dystrofiny (DYS-1/DYS-2) pod mikroskopem fluorescencyjnym przy długości fali 594 nm przy 20-krotnym powiększeniu.

9. Western Blotting (zachodnia plama)

  1. Pobrane skrawki mięśni z kriosekcji dodać do 150 μl buforu do próbki na lodzie.
  2. Za pomocą homogenizatora ręcznego krótko homogenizować próbki białek. Podgrzewać próbki w probówce o pojemności 1,5 ml w inkubatorze z blokiem grzewczym w temperaturze 95 °C przez 3–5 minut. Odwirować przy 16 500 × g przez 15 minut i zebrać supernatant.
  3. Przechowywać podwielokrotności supernatantu w temperaturze -70 °C. Użyć wody destylowanej do rozcieńczenia do 100 razy.
  4. Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Dodać 2x Laemmli bufor ładujący SDS do próbek i podgrzewać przez 3 minuty w temperaturze 95 °C.
  5. Załaduj próbki do 3-8% żelu tris-octanowego przed uruchomieniem go na 3 godziny przy napięciu 150 V. Dołącz kilka rozcieńczonych próbek typu dzikiego (WT) (np. 1%, 10% i 50%) w celu oceny ilościowej. Za pomocą tej metody należy wykryć mniej niż 1% poziom dystrofiny WT.
  6. Umieść żel w buforze katodowym na 20 minut. W tym czasie weź dziewięć kawałków bibuły filtracyjnej i umieść je w transferowych (odpowiednio 3 bibuły w buforze katodowym [+], buforze anodowym ([-] i skoncentrowanym buforze anodowym [--]). Opisuje to metodę transferu półsuchego, która zwiększa czułość (ryc. 6).
  7. Namocz membranę PVDF w metanolu na 20 sekund, a następnie umieść w buforze anodowym.
    Ustaw żel z membraną do transferu półsuchego i pozwól mu pracować przez 1,5 godziny przy 400 mA w temperaturze pokojowej lub w chłodni.
  8. Umyj membranę PBS. Inkubować błonę w mieszaninie PBS z Tween 20 (PBST) i 5% mleka w proszku przez 2 godziny.
  9. Rozcieńczyć DYS-1 (przeciwciało pierwszorzędowe) w mieszaninie PBST i 5% mleka w proszku do rozcieńczenia 1:100. Dodaj go do błony i pozwól mu inkubować przez co najmniej 1 godzinę. Przemyć trzy razy 100 ml PBST przez 15 minut każdy.
  10. Dodać 65 μl/pas sprzężonego z HRP przeciwciała drugorzędowego (anty-mysie IgG2a dla DYS1) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 1 godzinę w RT w ciemnym obszarze. Następnie przemyć trzykrotnie 200 ml PBST przez 20 minut. Wymieszaj roztwory z zestawu do wykrywania zgodnie z zaleceniami. Inkubować przez 1 minutę.
  11. Wywołaj film do wykrywania pasm i analizy za pomocą oprogramowania ImageJ 48,57,58.

Wyniki

Badania In Vitro

Mioblasty poddano transfekcji w różnych warunkach traktowania 2'OMePS, aby porównać skuteczność każdego AON. Przeprowadzono traktowanie pojedynczymi AON w stężeniu 60 nM dla każdego z: Ex6A, Ex6B, Ex8A lub Ex8B, a także traktowanie koktajlem zawierającym 60 nM każdej z 4 sekwencji AON. Próbki RNA pobrano cztery dni po transfekcji. Po reakcji RT-PCR próbki z każdego traktowania naniesiono na żel wraz z próbkami nietraktowanymi (NT). Prążki położone wyżej na żelu reprezentują produkty DMD z przesunięciem ramki odczytu; prążki te zaobserwowano w mioblastach NT, traktowanych Ex8A oraz Ex8B. Mioblasty traktowane Ex6A, Ex6B, Ex8A oraz koktajlem wykazały produkty w ramce odczytu. W przypadku koktajlu oraz Ex6A/B uzyskano 10% produktów w ramce, podczas gdy dla Ex8A uzyskano jedynie 30% produktów w ramce (Rysunek 7). W celu potwierdzenia pominięcia eksonu i przywrócenia ramki odczytu przeprowadzono sekwencjonowanie cDNA; wyniki wykazały, że eksony 6–9 zostały rzeczywiście pominięte (Rysunek 7). Immunohistochemia wykazała, że psy traktowane AON miały zwiększoną liczbę włókien dystrofina-dodatnich w porównaniu z próbkami NT (Rysunek 8).

Badania in vivo

Aby porównać efektywność różnych warunków terapii AON, psom rasy CXMD (w wieku od 0,5 do 5 lat) podano jednorazowo wstrzyknięcie 1,2 mg Ex6A lub koktajl Ex6A, Ex6B i Ex8A w różnych dawkach. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu pobrano próbki mięśni i zabarwiono je przeciwciałem DYS-1, aby porównać liczbę włókien dystrofinowych dodatnich. Wszystkie próbki traktowane koktajlem wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z próbkami NT. Liczba włókien dystrofinowych dodatnich wzrastała wraz z dawką AON (Rysunek 9). Po systemowym wstrzyknięciu próbki mięśni psów typu dzikiego (WT), NT oraz psów CXMD traktowanych koktajlem zabarwiono DYS-1 (Rysunek 10). Psy CXMD traktowane koktajlem wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z psami NT CXMD, zarówno w próbkach mięśnia CT, jak i mięśnia sercowego. Jednak w mięśniach szkieletowych (CT) traktowanych AON stwierdzono znacznie wyższą ekspresję dystrofiny niż w traktowanym mięśniu sercowym. Analiza immunoblottingowa porównująca mięśnie WT, NT oraz mięśnie traktowane różnymi koktajlami morfolino doprowadziła do tych samych wniosków. W traktowanych próbkach mięśni szkieletowych zaobserwowano również szeroki zakres ekspresji dystrofiny (Rysunek 10). Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) wykazało, że traktowane psy CXMD wykazywały poprawę histopatologiczną, ze znacznym spadkiem liczby włókien z jądrem centralnym (CNF) w porównaniu z psami NT CXMD (Rysunek 1). Wskazuje to na intensywniejsze procesy degeneracji/regeneracji u psów NT, co jest objawem patologii mięśni dystroficznych. Ponadto traktowane psy osiągały szybsze czasy biegu i lepsze wyniki w klinicznej skali oceny. Psy CXMD traktowane uzyskały lepsze wyniki niż psy NT CXMD we wszystkich kategoriach (Rysunek 12).

Schemat splicingu mRNA; prawidłowe i dystroficzne mRNA psa oraz proces pomijania eksonu po zastosowaniu AO.
Rysunek 1. Wzorzec mutacji psa z CXMD oraz strategie pomijania eksonów 6–8 z użyciem koktajlu antysensownego. Psy z CXMD posiadają punktową mutację w eksonie 6, co prowadzi do utraty eksonu 7 w mRNA dystrofiny u tych psów. Skutkuje to przesunięciem ramki odczytu mRNA i utratą produkcji białka dystrofiny. Zaprojektowano krótkie sekwencje AON, które wiążą się z eksonami 6 i 8, co prowadzi do skutecznego pominięcia eksonów 6–8 podczas splicingu mRNA. Szary pasek u psów traktowanych koktajlem AON reprezentuje krótkie sekwencje AON. Ekson 9 koduje domenę zawiasową i czasami jest spontanicznie wycinany podczas splicingu przy zastosowaniu AON przeciwko eksonom 6 i 8. Powstałe mRNA koduje białka dystrofiny, które są krótsze, ale funkcjonalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie objawów dystrofii mięśniowej u beagli typu dzikiego i CXMD w wieku jednego roku, schemat.
Rysunek 2. Główne objawy kliniczne u rocznego psa z wrodzoną dystrofią mięśniową sprzężoną z chromosomem X (CXMD). Przedstawiono rocznego psa rasy beagle typu dzikiego oraz psa z CXMD. Zajęcie mięśni proksymalnych, kończyn oraz mięśni skroniowych jest zazwyczaj obserwowane od 2. miesiąca życia. Przykurcze stawowe i przemieszczenie miednicy są widoczne od 4. miesiąca życia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Weterynaryjny zabieg chirurgiczny, przygotowanie do znieczulenia, narzędzia chirurgiczne, konfiguracja opieki nad zwierzęciem.
Rysunek 3. Znieczulenie ogólne psa. A) Iniekcje domięśniowe i biopsje mięśni wykonuje się w narkozie ogólnej z użyciem izofluranu. B) Unieruchomienie zwierzęcia do iniekcji systemowych. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Skany MRI porównujące rozwój mózgu myszy w zależności od genotypu w czasie; WT, NT, 2703MA, 201MA.
Rysunek 4. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) osobników typu dzikiego, nieleczonych CXMD oraz leczonych CXMD. Obrazy MRI kończyny tylnej w 3. i 5. miesiącu życia u psów WT oraz NT z CXMD. Przedstawiono dwa przykładowe obrazy MRI kończyny tylnej psów z CXMD przed (1 tydzień przed pierwszą iniekcją) i po iniekcji AON. Pies 2703MA był leczony 7 razy w tygodniu dawką 20 mg/kg koktajlu morfolino. Pies 201MA był leczony poprzez 5 iniekcji dożylnych w tygodniu w dawce 120 mg/kg koktajlu morfolino. Psy z grupy kontrolnej i leczonej były dopasowane pod względem wieku. U psów leczonych obserwuje się zmniejszenie sygnałów T2. Obrazy opracowano za zgodą Yokoty. i wsp. (copyright 209, John Wiley & Synowie) 40 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Procedura chirurgiczna kończyny psa w celu pobrania tkanek; obejmuje nacięcie oraz przygotowanie próbek.
Rysunek 5. Procedura biopsji mięśnia u psa. A) Kończyna dolna jest unieruchomiona w celu wykonania biopsji mięśnia. B) Kończynę dolną przytrzymuje się za pomocą pęsety. C) Odsłonięto mięsień CT. W celu pobrania próbek mięśni z miejsc wstrzyknięcia zastosowano technikę biopsji otwartej. Do zabezpieczenia próbek biopsyjnych użyto nici. D) Próbki mięśni na gumie tragakantowej po sekcji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat układu transferu białek, przedstawiający warstwowe materiały do Westernu w polu elektrycznym.
Rysunek 6. Metoda transferu półsuchego. Przedstawiono schemat półsuchej metody transferu w technice Western blotting. Trzy arkusze papieru nasączone stężonym buforem anodowym umieszcza się przy terminalu ujemnym; na nich układa się kolejne 3 arkusze nasączone buforem anodowym. Membranę PVDF namaczano w metanolu, a następnie w buforze anodowym, po czym położono ją na wierzchu sześciu arkuszy papieru. Żel, uprzednio namoczony w buforze katodowym, delikatnie kładzie się na membranie PVDF. Na koniec na żelu układa się 3 arkusze papieru nasączone buforem katodowym. Na górze umieszcza się terminal dodatni. Przez 1 godzinę przez układ przepuszczany jest prąd o natężeniu 40 mA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wyniki elektroforezy PCR i chromatogram sekwencjonowania; analiza edycji genów; dopasowanie eksonów.
Rysunek 7. Pomijanie eksonów w mioblastach CXMD. Mioblasty CXMD przetransfekowano samymi sekwencjami Ex6A, Ex6B, Ex8A lub Ex8B albo koktajlem wszystkich czterech. W przypadku pojedynczych sekwencji zastosowano stężenie 60 nM, natomiast dla koktajlu użyto 60 nM każdej z sekwencji. A) Leczenie 2'OMePS w psich mioblastach CXMD. Próbki traktowane Ex6A, Ex6B oraz koktajlem wykazują silne prążki w oczekiwanej pozycji transkryptów z pominiętym eksonem w ramce odczytu. Ex8A wykazuje prążek o średnim natężeniu, Ex8B wykazuje słaby prążek, a NT nie wykazuje prążka w pozycji zgodnej z ramką odczytu. B) Sekwencjonowanie cDNA z próbek traktowanych samą sekwencją Ex6A, 4 dni po transfekcji. Ilustracje opracowano za zgodą Yokoty. i in. (copyright 209, John Wiley & Synowie) 40. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna porównująca wzrost komórek w grupach WT, Cocktail, Ex6A oraz NT; skala 50 μm.
Rycina 8. Zwiększona ekspresja dystrofiny w mioblastach CXMD po transfekcji 2'-ometylowanym fosforotioanem (2'OMePS). Mioblasty CXMD poddano transfekcji samym Ex6A lub koktajlem 2'OMePS. Przedstawiono barwienie DYS-2 (czerwone) i DAPI (niebieskie). Mioblasty poddane działaniu preparatu porównano z mioblastami typu dzikiego (WT) oraz niepoddanymi działaniu preparatu (NT). Obrazy zostały opracowane za zgodą Yokoty. i in. (prawa autorskie 209, John Wiley & Synowie) 40Skala = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna próbek tkanek; WT, NT, Ex6A, koktajl. Porównanie morfologii komórek.
Rycina 9. Przywrócenie ekspresji dystrofiny za pomocą domięśniowych zastrzyków z morfolinami u psów CXMD. Do mięśni CT psów CXMD wstrzyknięto albo sam Ex6A, albo koktajl składający się z Ex6A, Ex6B i Ex8A. Przedstawiono barwienie dystrofiny (DSY-1) u psów typu dzikiego (WT), psów CXMD nieleczonych (NT) oraz leczonych. Psy otrzymywały albo 1,2 mg samego Ex6A, albo 1,2 mg koktajlu. Obrazy opracowano za zgodą Yokoty. i inni (copyright 209, John Wiley & Synowie) 40Skala = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza tkanki mięśniowej u osobników typu dzikiego, CXMD oraz leczonych PMO; obejmuje obrazy mikroskopowe i wyniki elektroforezy żelowej.
Rycina 10. Zwiększona ekspresja dystrofiny po systematycznym leczeniu koktajlem morfolino u psów z zespołem CXMD. Do porównania ekspresji dystrofiny u psów typu dzikiego (WT) (kontrola pozytywna), nieleczonych (NT) (kontrola negatywna) oraz psów z CXMD leczonych koktajlem morfolino w dawce 120 mg/kg (po 40 mg/kg każdego AON) wykorzystano barwienie na dystrofinę (DYS-1). Koktajl morfolino zawierał Ex6A, Ex6B i Ex8A. Psy otrzymywały ten koktajl w zastrzykach dożylnych 5 razy w tygodniu. A) Porównanie ekspresji dystrofiny w mięśniach piszczelowych przednich (CT) psów WT, NT oraz psów leczonych. B) Porównanie ekspresji dystrofiny w tkance serca psów NT oraz psów leczonych koktajlem morfolino. C) Przedstawiono immunoblot dla dystrofiny z desminą jako kontrolą załadunku dla psów WT, NT oraz psów leczonych koktajlem morfolino. W przypadku psów leczonych pokazano następujące mięśnie: triceps ramienny (TB), biceps ramienny (BB), przeponę (DIA), przełyk (ESO), CT, mięsień przywodziciel (ADD), mięsień prostownik długi palców (EDL), mięsień żwacza (MAS) oraz serce. Obrazy zaadaptowano za zgodą Yokoty. i wsp. (prawa autorskie 209, John Wiley & Synowie) 40Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela porównawcza histologiczna tkanki nieleczonej i leczonej; zmiany w strukturze komórkowej po leczeniu.
Rycina 1. Poprawa obrazu histopatologicznego u psów z CXMD leczonych przez 7 tygodni koktajlem morfolinowym w dawce 240 mg/kg. Psom rasy CXMD w wieku od pół roku do pięciu lat wstrzykiwano dożylnie koktajl morfolinowy (Ex6A, Ex6B i Ex8A) w dawce 240 mg/kg raz w tygodniu przez 7 tygodni. Czternaście dni po ostatnim wstrzyknięciu pobrano mięśnie przełyku i wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Barwienie HE mięśni przełyku psów CXMD niepoddanych leczeniu (NT) oraz leczonych koktajlem morfolinowym (Treated) (obiektyw 40X). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Równowaga statyczna; wpływ iniekcji PMO na wynik gradacji; wykres liniowy; analiza badawcza.
Rycina 12. Poprawa wyników oceny klinicznej i czasu biegu na dystansie 15 m po zastosowaniu morfolino. Psy traktowane morfolinami porównano z nietraktowanymi (NT) psami z tego samego miotu. Słupki błędów na wykresie oznaczają SEM. A) Przed i po leczeniu obliczono całkowitą punktację w badaniu klinicznym, a następnie porównano zwierzęta traktowane z nietraktowanymi psami z tego samego miotu. B) Porównanie czasów przebiegnięcia dystansu 15 m u psów traktowanych oraz NT. C) Analogicznie jak w B, jednak wykorzystano młodsze psy. Ryciny zostały zaadaptowane za zgodą Yokoty. it al. (copyright 209, John Wiley & Synowie) 40. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Oligonukleotyd antysensowny Sekwencja nukleotydowa 
Ex6A GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG
Ex6BACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT
Ex8ACTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC

Tabela 1. Projektowanie oligonukleotydów antysensownych.

Dyskusja

Przeskakiwanie eksonów jest obiecującą techniką terapeutyczną w leczeniu DMD. Zarówno eksperymenty in vitro , jak i in vivo wykazały, że pomijanie wielu eksonów jest wykonalne. W tym miejscu omówiono zastosowanie modelu psa CXMD. Po pierwsze, AON zostały zaprojektowane przy użyciu programów Rescue-ESE i ESEfinder do celowania w eksony dystrofiny 6 - 8. Do transfekcji mioblastów CXMD wykorzystano chemię 2'OMePS AON, a do eksperymentów in vivo wybrano chemię szkieletu AON. vPMO są bardziej skuteczne niż niezmodyfikowane PMO, ale ze względu na ich wyższą toksyczność nie nadają się do wstrzykiwań ogólnoustrojowych. Ekstrakcję RNA, RT-PCR i sekwencjonowanie cDNA przeprowadzono na mioblastach CXMD. Psy, którym wstrzyknięto koktajl PMO, zostały ocenione klinicznie w celu oceny ewentualnej poprawy objawów klinicznych. Po humanitarnej eutanazji psów pobrano próbki mięśni i przygotowano je do kriosekcji. Uważa się, że okres półtrwania białka dystrofiny indukowany przez AON wynosi około 1 - 2 miesięcy. W tym badaniu wykorzystano młode dorosłe psy, chociaż eksperymenty te można przeprowadzić z nowonarodzonymi psami i starszymi psami (>5 lat). Przygotowane skrawki mięśni wykorzystano do oceny histopatologii i oceny ratowania białka dystrofiny przez Western blot i immunohistochemię48.

Ważne jest, aby upewnić się, że objętość roztworu PMO jest prawidłowa przed wstrzyknięciem; Niezastosowanie się do tego będzie miało znaczący wpływ na wyniki. Podczas wstrzyknięć domięśniowych wymagane jest wystarczające ciśnienie, aby dostać się do włókien mięśniowych. Monitorowanie stanu zdrowia psa i inspekcja miejsca operacji są ważne dla rozwiązywania problemów. W celu monitorowania stanu zdrowia zwierząt należy przeprowadzać cotygodniowe badania krwi i ważenie. Po eutanazji zwierzęcia i przygotowaniu próbek mięśni, krytycznym krokiem w celu zapewnienia czułości w wykrywaniu białka dystrofiny jest użycie zarówno żelu Tris-acetat, jak i metody półsuchego blottingu podczas procedury Western blot.

Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, mioblasty traktowane Ex6A, Ex6B, Ex8A i koktajlem (zawierającym Ex6A, Ex6B, Ex8A i Ex8B) wytwarzały produkty DMD w ramce. Ponieważ Ex8B nie wytwarzał produktów pomijanych przez egzony, nie był używany w kolejnych eksperymentach in vivo . Sekwencjonowanie cDNA wykazało, że nastąpiło przeskakiwanie eksonów 6 - 9, a immunocytochemia z barwieniem DYS-2 wykazała przywróconą ekspresję dystrofiny w leczonych próbkach. Psy leczone AON wykazały znaczny wzrost włókien dystrofinowo-dodatnich. Wskazuje to, że eksony 6 - 8 były pomijane i wytwarzano skrócone białko. Ilość włókien dystrofinowo-dodatnich wzrastała, gdy stosowano koktajl AON i była proporcjonalna do dawki AEN. Immunobloty wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny u psów leczonych morfoliną układową. Mięśnie szkieletowe miały zmienny poziom włókien dystrofiny; Jednak tkanka serca leczona morfoliną wykazała niewielką poprawę ekspresji dystrofiny. Ponieważ dystrofina ma wysoką masę cząsteczkową (427 kDa), wykrycie małych ilości dystrofiny może być trudne. Dla uzyskania najlepszych rezultatów zastosowano żel Tris-acetate oraz metodę transferu półsuchego. Barwienie HE wykazało poprawę histopatologii u psów leczonych morfoliną. Włókna jądrowe (CNF) są oznaką niezdrowych mięśni i reprezentują cykle degeneracji i regeneracji mięśni. Psy leczone morfoliną CXMD wykazały zmniejszenie odsetka CNF w porównaniu z psami nieleczonymi CXMD. Ocena kliniczna wykazała poprawę objawów, takich jak zwiększona zdolność chodzenia i biegania, u zwierząt leczonych morfoliną. Uważa się, że twardość mięśni odzwierciedla atrofię mięśni, dlatego została uwzględniona w schemacie klasyfikacji 59. Oceniano twardość mięśni ud (kończyn tylnych); jednak wykluczyliśmy mięśnie sartoriusa czaszki, ponieważ mają one tendencję do wykazywania hipertrofii, a nie atrofii w CXMD. Leczone psy wykazywały niższe oceny i miały szybsze czasy w teście biegowym na 15 m. Lepsze czasy w teście 15 m wskazują na poprawę funkcji mięśni 40. Wyższe ogólne wyniki oceny wskazują na zły stan zdrowia i zwiększony zanik mięśni.

Chociaż wyniki te są obiecujące, pomijanie wielu eksonów nadal wiąże się z wieloma wyzwaniami, które będą musiały zostać pokonane, zanim technika ta będzie miała zastosowanie kliniczne. Tkanka serca nadal wykazuje zmniejszony wychwyt AON, prawdopodobnie z powodu różnicy w transporcie komórkowym między tkanką sercową a tkanką szkieletową. Nie zaobserwowano żadnych skutków toksycznych u zwierząt przy obecnych schematach dawkowania; jednak należy wykonać więcej pracy w celu oceny toksyczności długoterminowej, zanim stosowanie koktajli AON będzie mogło przejść do badań klinicznych. Trudno jest uzyskać zgodę na leki koktajlowe AEN, ponieważ agencje regulacyjne definiują każdą sekwencję AON jako unikalny lek. Oznacza to, że każda sekwencja w koktajlu musiałaby być indywidualnie testowana pod kątem bezpieczeństwa, co wymagałoby więcej czasu i więcej pieniędzy. Kolejną przeszkodą w stosowaniu przeskakiwania wieloeksonów w warunkach klinicznych jest duża ilość pośrednich produktów białkowych wytwarzanych o nieznanych funkcjach. Białka te mogą potencjalnie prowadzić do nieprzewidywalnych skutków ubocznych, w zależności od indywidualnej mutacji 22. Ponadto wzorce mutacji dostępne w obecnych dystroficznych modelach psów są ograniczone. Istnieje niewiele naturalnie występujących mutacji i nie wszystkie mutacje są przydatne do badania pomijania wielu eksonów. Dystroficzny model świni zapowiada się na dobrą alternatywę dla przyszłych badań nad pomijaniem eksonów DMD 33, 34.

Modele psów DMD mają pewne zalety w porównaniu z innymi modelami DMD. Ponieważ jest to większy model zwierzęcy, możliwa jest ocena kliniczna i rezonans magnetyczny, co pozwala na bardziej szczegółową analizę. Ponieważ psy są dużymi zwierzętami, są również bardziej odpowiednie do badań toksykologicznych i lepiej reprezentują chorobę człowieka w porównaniu z modelem mysim. Modele psów mają również sekwencje genów DMD , które są bardziej podobne do ludzi 23, 34, 45.

Chociaż jest to technicznie trudne, podejście polegające na pomijaniu wielu eksonów może ostatecznie przynieść korzyści >90% pacjentów z DMD 24. To sprawia, że jest to znacznie lepsza alternatywa dla pomijania pojedynczego eksonu, ponieważ pomijanie pojedynczego eksonu ma zastosowanie tylko do niewielkiej podgrupy pacjentów. Ponadto pomijanie wielu eksonów pozwoli nam wybrać wzorce delecji, które optymalizują funkcjonalność skróconych białek dystrofiny. Na przykład delecja eksonów DMD 45 - 55 wiąże się z wyjątkowo łagodnymi objawami lub osobami bezobjawowymi 14,19,60-63. Przeskakiwanie wielu eksonów eksonów 45 - 55 wykazano już w mysim modelu DMD z delecją eksonu 52 (mdx52) przy użyciu ogólnoustrojowych wstrzyknięć vPMO 22,26. Stosowanie koktajlowych vPMO wykazano również w innych postaciach dystrofii mięśniowej, takich jak wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy (FCMD). FCMD jest spowodowany uwięzieniem eksonów, w którym nieprawidłowy splicing mRNA jest spowodowany insercją retrotranspozonu. Wykazano, że vPMO ratują wzorzec splicingu zarówno w mysim modelu FCMD, jak i w ludzkich liniach komórkowych 64. Chemie nowej generacji AON, wykazujące wyższą skuteczność i niższą toksyczność, ułatwiłyby skuteczne zastosowanie podejścia z pominięciem wielu eksonów do zastosowań klinicznych. Ponadto przeskakiwanie wielu eksonów może być potencjalnie stosowane w innych zaburzeniach genetycznych, takich jak dysferlinopatie 24, 65.

Oświadczenia

Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez Gene Tools, LLC.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Wydział Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberty, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, oraz Instytut Badań nad Zdrowiem Kobiet i Dzieci (WCHRI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2'OMePS Transfekcja mioblastów psów 
3 ml płytki 6-dołkoweIWAKI5816-006
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni (DMEM) Gibco11965-092
Surowica bydlęca płodu (FBS) HyCloneSH30071.01
Penicylina Sigma-Aldrich P4333 200 U/ml 
Lipofektyna Invitrogen 18292-011Całkowita objętość 100 ml w pożywce opti-MEM w stosunku 2:1 dla lipofektyny.
10 ml lipofektyny na 5 mg RNA. 
2' OMePSEurogentec Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) i Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC). 
Surowica dla koni Gibco16050-1142%
streptomycyna Sigma-AldrichP4333 200 μ g/ml
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Sigma-AldrichA9418 
Insulina
Transfekcja morfolino mioblastów psów
Cały materiał z MePS Transfekcja mioblastów psów do hodowli
morfolinos antysensownych Gene-toolsEx6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC
TCAGG),
Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG
AGCGTT), 
Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT
GCTCAC)                                                   
Rozcieńczyć do końcowej objętości 100 l w pożywce opti-MEM.                                   
120– 200 mg/kg morfoliny w stężeniu 32 mg/ml w soli fizjologicznej
Endo-PorterGene-tools
guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroformInvitrogen15596-0181  ml/plate
RNA Ekstrakcja i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)
guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroformInvitrogen15596-0181  ml/płytkę
ChloroformSigma-AldrichP3803200 μ l 
Probówki 1,5 ml Eppendorf22363204
Wirówka Beckman-Coulter
75% Etanol Sigma-Aldrich34852
 
Starter do przodu w eksonie 5 InvitrogenCTGACTCTTGGTTTGATTTGGA                                                   
1.5 μ l 10 μ M
Odwrócony starter w eksonie 10 InvitrogenTGCTTCGGTCTCTCTCAATG                                                       
1.5 μ l 10 μ M
dNTPsClontech3040
Jednoetapowy zestaw RT-PCR Qiagen 210210
TermocyklerScinco
komplementarne sekwencjonowanie DNA (cDNA) 
Zestaw do ekstrakcji żelu Qiagen 28704
Wirówka 
Zestaw sekwencjonowania cyklu Terminator v3.1 Biosystemy stosowane 4337454
Zastrzyki domięśniowe lub otwarta biopsja mięśni
NarzędziaNożyczki, skalpel, igła, nić chirurgiczna 
Maść weterynaryjna 
Jodofory webtextiles12190-71-5
chloroheksydynaPeridex12134
Serwety chirurgiczne 
Peelingi
Maseczka do twarzy 
Rękawice chirurgiczne 
Nakrycie głowy 
Tiopental sodu Mitsubishi Tanabe Pharma 20 mg/kg 
Laboratoria IsofluraneAbbott 05260-052-3%
Morfoliny antysensowne Gene-toolsEx6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC
TCAGG),
Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG
AGCGTT), 
Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT
GCTCAC)                                                   
Rozcieńczyć do końcowej objętości 100 l w pożywce opti-MEM.                                   
120– 200 mg/kg morfolinosu w stężeniu 32 mg/ml w soli fizjologicznej
27  G IgłyTERUMO SG3-2325 
Strzykawka 50 mlTERUMOSG2-03L2225
buprenorfiny
Depresor do języka 
cefaleksyna15 do 30 mg/kg 
cefazolina15 do 30 mg/kg 
buprenorfina 0,01 mg/kg
chlorowodorku buprenorfiny 0,02 mg/kg
Zastrzyki ogólnoustrojowe
Pompa infuzyjna strzykawki Muromachi 
22  G Igły do montażu na miejscuTERUMOSG3-2225 
27  G Igły TERUMO SG3-2325 
Strzykawka 50 mlTERUMOSG2-03L2225 
SalineOhtsuka-Pharmaceutical28372
Kliniczna ocena psów
Kamera wideo 
Stoper 
Rezonans magnetyczny (MRI) 
3 Tesla MRI l 
ludzkich o średnicy 18 cm/długości 18 cm
Pobieranie i przygotowanie mięśni (sekcja zwłok)Tiopental sodu 
Mitsubishi Tanabe Pharma 20 mg/kg 
Laboratoria IsofluraneAbbott 05260-052-3%
tragakantowa10-20 ml
Ciekły azot 
Krążki korkoweIwai-kagaku 101412-806
Pęseta
do suchego lodu
Poli-L-lizyna– szkiełka powlekaneFisher22-037-216
Cryostat Microsystem Leica CM1900 
Immunohistochemia 
DYS1 Nowokastra NCL-DYS1 Rozcieńczenia 1:150 
DYS2Nowokastra NCL-DYS2 Rozcieńczenia 1:150
Alexa 594 koza antymysz IgG1 InvitrogenA-211251:2,500 rozcieńczenia
Alexa 594 koza antymysz IgG2 InvitrogenA-110051:2,500 rozcieńczenia
DAPI InvitrogenD1306Zawiera środek montażowy
Kozia surowica Komora wilgotnościowa Invitrogen10000C15%
PBS
 Laboratorium Naukowe 197-BL
Zjeżdżalnia komorowa Laboratorium 
154453 Okulary nakrywkowe Fisher12-540A
Hydrofobowy długopis barierowy 
Mikroskop fluorescencyjny 594 nm przy 20-krotnym powiększeniu.
Western Blotting 
woda destylowana 
Homogenizator ręczny 
2 razy; Bufor ładowania SDS Laemmli 0,1 mln Tris– HCl (pH 6,6), 2% (w/v) SDS, 2% (0,28  M) beta-merkaptoetanol, 20% glicerol, 0,01% błękit bromofenolowy 
Żele SDS Bio-Rad 161-12105% żele SDS o rozdzielczości 5%
Invitrogen Invitrogen, WG1601BOXmembrana 3-8%
PVDF GE10600021
do pracy metanolu
(10 razy;) 250 mM Tris-Base, 1,920 mM Glycine
Running Buffer (1&razy;)10% 10&krotny bufor, 20% metanol 
0,05% PBS/Animacja 20 (PBST) 2 000 ml                           
3 razy; 200 ml do prania
PBST/5% mleka w proszku 100 ml
Zestaw do oznaczania białekBCAT9650
Tween 20 Sigma P5927
MocznikSigma U5378
Beta merkaptoetanol MilliporeES-007-E
SDSSigmaL3771
Tris-AcetateSigma
Tris HClSigmaT3253
GlicerolSigmaG8773
Bufor ładowania/próbki do Western blottingNuPage InvitrogenNP007
NaClSigmaS3014
PMSFSigmaP7626
Inhibitor koktajlu proteazy 
mM Kwas 6-aminokapronowy + 20%
Bufor0,03 M Tris Base + 20%
Metanol Skoncentrowany bufor0,3 M Tris zasada + 20% metanol
przeciwciało desminy Abcamab8592
DYS1 Nowokastra NCL-DYS1 Rozcieńczenia 1:150 
Oprogramowanie
Spektrometr UV chirurgiczne chlorowodorek Cewka kończyn Guma Bufor Bufor katodowy Roche 11836153001 0,025 M podstawa Tris + 40  anodowy metanolu anodowy ImageJ

Bibliografia

  1. Duchenne, A. The Pathology of Paralysis with Muscular Degeneration (Paralysie Myosclerotique), or Paralysis with Apparent Hypertrophy. Br Med J. 14 (2), 541-542 (1867).
  2. Zellweger, H., Antonik, A. Newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Pediatrics. 55 (1), 30-34 (1975).
  3. Echigoya, Y., Yokota, T. Skipping multiple exons of dystrophin transcripts using cocktail antisense oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 24, 57-68 (2014).
  4. Bushby, R. F., Birnkrant, D. J., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. The Lancet Neurology. 9 (1), 77-93 (2010).
  5. Eagle, M., Baudouin, S. V., Chandler, C., Giddings, D. R., Bullock, R., Bushby, K. Survival in Duchenne muscular dystrophy: improvements in life expectancy since 1967 and the impact of home nocturnal ventilation. Neuromuscul. Disord. 12 (10), 926-929 (2002).
  6. Heald, A., Anderson, L. V., Bushby, K. M., Shaw, P. J. Becker muscular dystrophy with onset after 60 years. Neurology. 44 (12), 2388-2390 (1994).
  7. Stöllberger, C., Finsterer, J. Worsening of heart failure in Becker muscular dystrophy after non-steroidal anti-inflammatory drugs. Med. J. 98 (4), 478-480 (2005).
  8. Passamano, L., et al. Improvement of survival in Duchenne Muscular Dystrophy: retrospective analysis of 835 patients. Acta Myol. 31 (2), 121-125 (2012).
  9. Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
  10. Koenig, M., et al. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell. 50 (3), 509-517 (1987).
  11. Takeshima, Y., et al. Mutation spectrum of the dystrophin gene in 442 Duchenne/Becker muscular dystrophy cases from one Japanese referral. JHG. 55 (6), 379-388 (2010).
  12. White, S. J., et al. Duplications in the DMD gene. Hum. Mutat. 27, 938-945 (2006).
  13. Yokota, T., Duddy, W., Echigoya, Y., Kolski, H. Exon skipping for nonsense mutations in Duchenne muscular dystrophy: too many mutations, too few patients. Expert Opin. Biol. Ther. 12 (9), 1141-1152 (2012).
  14. Yokota, T., Duddy, W., Partridge, T. Optimizing exon skipping therapies for DMD. Acta Myol. 26 (3), 179-184 (2007).
  15. Magri, F., et al. Genotype and phenotype characterization in a large dystrophinopathic cohort with extended follow-up. J Neurol. 258 (9), 1610-1623 (2011).
  16. Yoshida, H. H., Ishikawa-Sakurai, M. Biochemical evidence for association of dystrobrevin with the sarcoglycan- sarcospan complex as a basis for understanding sarcogly- canopathy. Hum. Mol. Genet. 9 (7), 1033-1040 (2000).
  17. Bies, R. D., Caskey, C. T., Fenwick, R. An intact cysteine-rich domain is required for dystrophin function. J. Clin. Invest. 90 (2), 666-672 (1992).
  18. Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
  19. Aoki, Y., Yokota, T., Wood, M. J. Development of multiexon skipping antisense oligonucleotide therapy for Duchenne muscular dystrophy. Biomed Res Int. 2013 (402369), (2013).
  20. Cirak, V. A. -G., Guglieri, M., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. The Lancet. 378 (9791), 595-605 (2011).
  21. Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 364 (16), 1513-1522 (2011).
  22. Echigoya, Y., et al. Long-term efficacy of systemic multiexon skipping targeting dystrophin exons 45-55 with a cocktail of vivo-morpholinos in mdx52 mice. Mol Ther Nucleic Acids. 4, (2015).
  23. Hoffman, E. P., et al. Restoring dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy muscle progress in exon skipping and stop codon read through. Am J Pathol. 179 (1), 12-22 (2011).
  24. Aartsma-Rus, A., et al. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet. 74 (1), 83-92 (2004).
  25. Aartsma-Rus, A., Kaman, W. E., Weij, R., Tden Dunnen, J., van Ommen, G. J., van Deutekom, J. C. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol. Ther. 14 (3), 401-407 (2006).
  26. Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
  27. McClorey, G., Iversen, P. L., Moulton , H. M., Fletcher, S., Wilton, S. D. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restores dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD. Gene Ther. 13 (19), 1373-1381 (2006).
  28. Sharp, N. J., et al. An error in dystrophin mRNA processing in golden retriever muscular dystrophy, an animal homologue of Duchenne muscular dystrophy. Genomics. 13 (1), 115-121 (1992).
  29. Shimatsu, Y., et al. Canine X-linked muscular dystrophy in Japan (CXMDJ). Exp Anim. 52 (2), 93-97 (2003).
  30. Nguyen, F., Cherel, Y., Guigand, L., Goubault Leroux, I., Wyers, M. Muscle lesions associated with dystrophin deficiency in neonatal golden retriever puppies. J Comp Pathol. 126 (2-3), 100-108 (2002).
  31. Nakamura, A., Takeda, S. Mammalian models of Duchenne Muscular Dystrophy: pathological characteristics and therapeutic applications. J Biomed Biotechnol. 2011 (184393), (2011).
  32. Yokota, T., et al. A renaissance for anti-sense oligonucleotide drugs in neurology: Exon-skipping breaks new ground. Arch. Neurol. 66, 32-38 (2009).
  33. Aartsma-Rus, A., et al. Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum. Mutat. 30 (3), 293-299 (2009).
  34. Yu, X., Bao, B., Echigoya, Y., Yokota, T. Dystrophin-deficient large animal models: translational research and exon skipping. Am. J. Transl. Res. 7 (8), 1214-1231 (2015).
  35. Yin, H., Moulton, H., Betts, C., Wood, M. CPP-directed oligonucleotide exon skipping in animal models of Duchenne muscular dystrophy. Methods Mol Biol. 683, 321-338 (2011).
  36. Moulton, H. M., Moulton, J. D. Morpholinos and their peptide conjugates: therapeutic promise and challenge for Duchenne muscular dystrophy. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (12), 2296-2303 (2010).
  37. Morcos, P. A., Li, Y., Jiang, S. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. BioTechniques. 45 (6), 613-614 (2008).
  38. Betts, C., et al. A New Generation of Peptide-oligonucleotide Conjugates With Improved Cardiac Exon Skipping Activity for DMD Treatment. Mol Ther Nucleic Acids. 14 (1), e38(2012).
  39. Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), e12239(2010).
  40. Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Ann Neurol. 65 (6), 667-676 (2009).
  41. Melacini, P., et al. Cardiac and respiratory involvement in advanced stage Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul. Disord. 6 (5), 367-376 (1996).
  42. Guncay, A., Yokota, T. Antisense oligonucleotide drugs for Duchenne muscular dystrophy: how far have we come and what does the future hold. Future Med. Chem. 7 (13), 1631-1635 (2015).
  43. Recognition and Alleviation of Pain and Distress in Laboratory Animals. National Research Council (US) Committee on Pain and Distress in Laboratory Animals. Distress in Laboratory Animals . , National Academic Press (US). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK32658 (1992).
  44. Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsPhysical Restraint. National Research Council (US) Institute for Laboratory Animal Research. , National Academic Press (US). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK54050 (1996).
  45. Fairbrother, W. G., Yeh, R. F., Sharp, P. A., Burge, C. B. Predictive identification of exonic splicing enhancers in human genes. Science. 297, 1007-1013 (2002).
  46. Cartegni, L., Wang, J., Zhu, Z., Zhang, M. Q., Krainer, A. R. ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res. 31, 3568-3571 (2003).
  47. Fairbrother, W. I. 11, Goldstein, P. RESCUE-ESE Web Server. MIT Burge Lab. , Available from: http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/ (2016).
  48. Yokota, T., Hoffman, E., Takeda, S. Antisense oligo-mediated multiple exon skipping in a dog model of duchenne muscular dystrophy. Methods Mol Biol. 709, 299-312 (2011).
  49. Jenuth, J. P. The NCBI. Publicly available tools and resources on the Web. Methods Mol Biol. 132, 301-312 (2000).
  50. Yokota, T., et al. Extensive and Prolonged Restoration of Dystrophin Expression with Vivo-Morpholino-Mediated Multiple Exon Skipping in Dystrophic Dogs. Nucleic Acid Ther. , (2012).
  51. Summerton, J. E. Endo-Porter: a novel reagent for safe, effective delivery of substances into cells. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1058, 62-75 (2005).
  52. Mangram, A. J., et al. Guideline for Prevention of Surgical Site Infection. Am J Infect Control. 27, 97-134 (1999).
  53. Reichman, D. E., Greenberg, J. A. Reducing Surgical Site Infections. A Review . Rev Obstet Gynecol. 2, 212-221 (2009).
  54. Mizuno, H., Nakamura, A., Aoki, Y., Ito, N., Kishi, S., Yamamoto, K., Sekiguchi, M., Takeda, S., Hashido, K. Identification of muscle-specific microRNAs in serum of muscular dystrophy animal models: promising novel blood-based markers for muscular dystrophy. PloS one. 6, (2011).
  55. Shimatsu, Y., et al. Major clinical and histopathological characteristics of canine X-linked muscular dystrophy inJapan, CXMDJ. Acta Myol. , 145-154 (2005).
  56. Evans, H., de Lahunta, A. Guide to the Dissection of the Dog. SAUNDERS. , (2009).
  57. Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (47), (2004).
  58. Bearer, E. L., et al. Overview of image analysis, image importing, and image processing using freeware. Current protocols in molecular biology. 14, (2003).
  59. Shimatsu, Y., et al. Major clinical and histopathological characteristics of canine X-linked muscular dystrophy inJapan, CXMDJ. Acta Myol. 24, 145-1454 (2005).
  60. Beroud, C., et al. Multiexon skipping leading to an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum Mutat. 28, 196-202 (2007).
  61. Ferreiro, V., et al. Asymptomatic Becker muscular dystrophy in a family with a multiexon deletion. Muscle Nerve. 39, 239-243 (2009).
  62. Nakamura, A., et al. Follow-up of three patients with a large in-frame deletion of exons 45-55 in the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene. J Clin Neurosci. 15, 757-763 (2008).
  63. Yokota, T., Pistilli, E., Duddy, W., Nagaraju, K. Potential of oligonucleotide-mediated exon-skipping therapy for Duchenne muscular dystrophy. Expert Opin Biol Ther. 7, 831-842 (2007).
  64. Taniguchi-Ikeda, M., et al. Pathogenic exon-trapping by SVA retrotransposon and rescue in Fukuyama muscular dystrophy. Nature. 478, 127-131 (2011).
  65. Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3, 144-176 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pominięcie eksonu 6pominięcie eksonu 8podejście z użyciem koktajlu AONekspresja dystrofinyanaliza RT-PCRwstrzyknięcie domięśniowebadanie toksyczności systemowej
Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.