Artykuł metodologiczny

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53853

⸱

15 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Medical University of Innsbruck, 2Hertie Institute for Clinical Brain Research and Centre for Integrative Neuroscience, University of Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Streszczenie

Mikroskopia elektronowa z zamrażaniem i pękaniem jest główną techniką w badaniach ultrastrukturalnych od ponad 40 lat. Jednak brak skutecznych środków do badania składu molekularnego membran spowodował znaczny spadek jego stosowania. Ostatnio nastąpiło znaczne ożywienie w mikroskopii elektronowej zamrażania i pękania dzięki opracowaniu skutecznych sposobów ujawniania integralnych białek błonowych poprzez znakowanie immunozłotem. Jedna z tych metod jest znana jako rozpuszczalne w detergentach immunoznakowanie repliki zamrażalniczo-łamliwej (FRIL).

Połączenie techniki FRIL z optogenetyką pozwala na skorelowaną analizę strukturalnych i funkcjonalnych właściwości synaps centralnych. Dzięki temu podejściu możliwe jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie zarówno neuronów pre-, jak i postsynaptycznych na podstawie ich odpowiedniej ekspresji znakowanej rodopsyny kanałowej i specyficznych markerów molekularnych. Charakterystyczny wygląd specjalizacji błony postsynaptycznej synaps glutaminergiczny pozwala ponadto, po znakowaniu jonotropowych receptorów glutaminianu, na ilościowe określenie i analizę wewnątrzsynaptycznej dystrybucji tych receptorów. W tym miejscu podajemy krok po kroku opis procedur wymaganych do przygotowania sparowanych replik i sposobu ich znakowania immunologicznego. Omówimy również zastrzeżenia i ograniczenia techniki FRIL, w szczególności te związane z potencjalnymi błędami systematycznymi w próbkowaniu. Wysoka powtarzalność i wszechstronność techniki FRIL, w połączeniu z optogenetyką, oferuje bardzo skuteczne podejście do charakteryzowania różnych aspektów transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych mikroobwodach neuronalnych w mózgu.

Tutaj podajemy przykład, jak to podejście zostało wykorzystane do uzyskania wglądu w relacje struktura-funkcja synaps pobudzających w neuronach interkalowanych mas komórkowych ciała migdałowatego myszy. W szczególności zbadaliśmy ekspresję jonotropowych receptorów glutaminianu na zidentyfikowanych wejściach pochodzących z tylnych wewnątrzwarstwowych i przyśrodkowych jąder kolankowatych wzgórza. Wykazano, że synapsy te przekazują informacje sensoryczne istotne dla uczenia się strachu i ulegają zmianom plastycznym po warunkowaniu strachu.

Wprowadzenie

Definicja funkcjonalnej architektury biomembran w skali nanometrowej została w ostatnich latach zakwestionowana przez rozwój szeregu technik immunoznakowania odpowiednich dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Jednak techniki te, np. przed i po zatopieniu immunogold, mają szereg istotnych ograniczeń, do których należą słaba wykrywalność antygenów i/lub ograniczona ocena ilościowa białek związanych z błoną. Ograniczenia te stają się szczególnie istotne w badaniu subtelnej struktury układu nerwowego, który charakteryzuje się wysokim stopniem różnorodności komórek i niejednorodnością synaps. Ta niejednorodność wynika zarówno z różnorodności strukturalnej, jak i funkcjonalnej dyktowanej przez elementy pre- i postsynaptyczne oraz przez zróżnicowaną ekspresję, wzbogacenie lub interakcję białek sygnałowych, takich jak receptory, transportery i cząsteczki efektorowe.

Nowe podejście do bezpośredniego znakowania immunologicznego integralnych lub usieciowanych białek błonowych w replikach zamrażalniczo-łamanych (FRIL) zostało pierwotnie wprowadzone przez Fujimoto dwie dekady temu. Ta oryginalna metoda miała jednak kilka ograniczeń, tj. poważną fragmentację replik, która utrudniała znaczące korelacje znakowanych cząsteczek z indywidualnie zmapowanymi komórkami w złożonych tkankach, takich jak mózg. Około 10 lat temu Shigemoto i Fukazawa stopniowo ulepszali technikę 2. Równolegle z wysiłkami innej grupy naukowców z laboratoriów Boulder Uniwersytetu Stanowego Kolorado, którzy również znacznie udoskonalili tę technikę, w szczególności w zakresie badania połączeń szczelinowych 3.

Ulepszenie protokołów i maszyn do szczelinowania zamrażalniczego, a także wprowadzenie szybkiego zamrażania (pod wysokim ciśnieniem), pozwala teraz badaczom na tworzenie nieprzerwanych replik próbek o stosunkowo dużych rozmiarach i wysokiej jakości obrazach większości składników komórkowych bez ograniczeń i artefaktów wytwarzanych przez silne chemiczne utrwalenia.

Technika FRIL oferuje wielką zaletę wysoce ilościowej identyfikacji in situ jednego lub więcej białek (równocześnie) w histologicznie zmapowanych i cytologicznie zidentyfikowanych komórkach w złożonych tkankach, takich jak mózg, z dodatkową zaletą płaskiego widoku elementów pre- i postsynaptycznych w pojedynczej replice. W związku z tym, technika FRIL, pomimo wielu przeszkód technicznych, daje nadzieję na szereg bardzo istotnych przełomów naukowych, w szczególności w zakresie korelacji właściwości strukturalnych i funkcjonalnych poszczególnych synaps. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat uzyskano wiele informacji na temat struktury, składu molekularnego i funkcji fizjologicznych synaps; Jednak synapsy są morfologicznie i molekularnie bardzo zróżnicowane w zależności od pre i postsynaptycznych neuronów macierzystych 4. Do tej pory przeprowadzono badania struktury i funkcji tylko dla garstki typów synaps (5-7). Wynikało to głównie z ograniczeń technicznych, które uniemożliwiały precyzyjną identyfikację natury elementów pre- i postsynaptycznych.

Analiza ultrastrukturalna dostarczyła krytycznych informacji na temat zmienności specjalizacji błon postsynaptycznych w różnych kontaktach synaptycznych zarówno pod względem wielkości synaptycznej, jak i zawartości w receptorach neuroprzekaźników 6, co ma duży wpływ na siłę i plastyczność transmisji synaptycznej. Co więcej, wiele badań wskazuje, że liczba jonotropowych receptorów glutaminianu ulegających ekspresji w różnych typach synaps jest regulowana w sposób zależny od aferentności i celu.

Tutaj przedstawiono metodę, która pozwala na analizę struktury i składu receptorów specjalizacji błon postsynaptycznych ze zdefiniowanymi elementami i funkcją presynaptyczną. Podejście to wykorzystuje presynaptyczną ekspresję niedawno opracowanych wrażliwych na światło białek glonów, takich jak rodopsyna kanałowa2 (ChR2), oraz technikę FRIL do analizy wzorca postsynaptycznej ekspresji receptorów glutaminianu kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego (AMPA-Rs) i N-metylo-D-asparaginianu (NMDA-Rs). Widać to w synapsach utworzonych przez aksony pochodzące z tylnych jąder kolankowatych wzgórzowo-przyśrodkowych (PIN/MGn) na neuronach interkalowanych mas komórkowych ciała migdałowatego (ITC). Neurony ITC to małe kolczaste komórki GABA-ergiczne zorganizowane w klastry otaczające podstawno-boczny kompleks migdałowaty (BLA) 11, 12. Wiadomo, że neurony ITC odbierają bodźce pobudzające z głównych neuronów BLA i celują w jądro centralne (CeA), działając w ten sposób jako brama hamująca przepływ informacji między BLA a CeA 12-15.

Ostatnio wykazaliśmy, że neurony ITC zlokalizowane w środkowo-grzbietowym klastrze pomiędzy BLA i CeA otrzymują również bezpośrednie i zbieżne bodźce pobudzające z czuciowych obszarów wzgórza i kory skroniowej, które są modyfikowane podczas uczenia się strachu podczas warunkowania słuchowego Pawłowa 16. Warunkowanie strachu jest jedną z najlepiej poznanych form uczenia się asocjacyjnego pod względem mechanizmów mózgowych. W warunkowaniu strachu początkowo neutralny bodziec warunkowy (CS, np. ton) jest sparowany z awersyjnym bodźcem bezwarunkowym (US, np. łagodny wstrząs stopą), co skutkuje skojarzeniem CS-US i warunkową reakcją strachu 17, 18. Wiadomo, że bodźce pobudzające zarówno z obszaru wzgórza, jak i kory nowej, które przenoszą informacje reprezentujące odpowiednio CS i US, zbiegają się w neuronach piramidowych bocznego jądra ciała migdałowatego (LA) i ulegają plastyczności 19. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że informacje sensoryczne są również równolegle przekazywane do neuronów ITC 16.

Jako pierwszy krok w kierunku mechanistycznej analizy molekularnej poszczególnych synaps sensorycznych na neuronach ITC, użyliśmy wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do ekspresji ChR2 oznaczonego żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). AAV został wstrzyknięty do PIN / MGn, a zakończenia aksonów zostały zidentyfikowane na podstawie ich ekspresji ChR2-YFP. Wykorzystaliśmy obie twarze wygenerowane techniką FRIL do oceny gęstości postsynaptycznych AMPA-R i NMDA-Rs w synapsach utworzonych z neuronami ITC przez zakończenia aksonów PIN / MGn.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Regierungspraesidium Tübingen, land Badenia-Wirtembergia, Niemcy, oraz przez Austriacką Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach i były zgodne z dyrektywą UE dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach.

1. Stereotaktyczne iniekcje AAV-Channelrhodopsin2-YFP

UWAGA: Iniekcje stereotaktyczne zostały wykonane zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem 20.

  1. Przygotować sterylne narzędzia, ogrzewając je w temperaturze 180 ºC przez 1,5 hr.
  2. Wytworzyć ostre (średnica ~50 µm) szklane pipety do iniekcji za pomocą poziomego wyciągacza mikroelektrod ustawionego na następujące parametry: Heat = wartość Ramp - 20, Pull = 0, Velocity = 100, Time = 200, Pressure = 200.
    UWAGA: Wartość Ramp musi zostać określona dla każdej partii zakupionych szklanych pipet zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta wyciągacza mikropipet.
  3. Wymieszać 1 µl roztworu wirusa i 0,2 µl 0,1% roztworu fast green (w celu lepszej widoczności roztworu w szklanej pipecie) w sterylnym soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Napełnić szklaną pipetę, używając pipety 10 µl i końcówek gel-fil. Jako konstrukt wirusowy należy zastosować rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotyp 2/9).
  4. Zznieczulić mysz za pomocą urządzenia do znieczulania małych zwierząt (3% izofluranu w tlenie do indukcji). W tym badaniu należy wykorzystać 3 myszy typu dzikiego w wieku ~6 tygodni.
  5. Ogolić głowę między uszami a oczami i zdezynfekować roztworem na bazie powidonu jodowego.
  6. Nanieść maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia. Wstrzyknąć myszy podskórnie środek przeciwbólowy (na bazie meloksykamu, 0,1 ml roztworu 5 mg/ml).
  7. Umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym i utrzymać znieczulenie za pomocą urządzenia do znieczulania gazowego (2% izofluranu w tlenie do podtrzymania). Przed kontynuacją sprawdzić głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu cofania kończyny.
  8. Jak najlepiej utrzymać sterylne warunki podczas całej procedury chirurgicznej. Należy nosić jednorazową maseczkę ochronną, fartuch chirurgiczny i rękawiczki.
  9. Wyciąć nacięcie skóry o długości około 1 cm na szczycie głowy za pomocą nożyczek 20. Delikatnie odsunąć skórę na bok za pomocą pęsety tępej, przymocować klamrami, aby odsłonić powierzchnię czaszki, a następnie oczyścić czaszkę za pomocą H2O2.
  10. Zaznaczyć miejsca iniekcji na czaszce za pomocą cienkopisu permanentnego z cienką końcówką. Wywiercić w czaszce mały otwór (średnica około 1 mm) w zaznaczonym miejscu. W przypadku jednostronnej iniekcji do PIN/MGn w tym badaniu należy zastosować następujące współrzędne: od bregma (mm): posterior 3,0, lateral ±1,8, ventral 3,8.
  11. Zamontować napełnioną szklaną pipetę w aparacie stereotaktycznym połączonym z urządzeniem do iniekcji ciśnieniowej i doprowadzić pipetę do pozycji bregma.
  12. Odłamać końcówkę szklanej pipety za pomocą cienkiej pęsety o prostych końcach. Upewnić się, że końcówka pipety jest drożna, aplikując kilka impulsów ciśnienia i obserwując wypływanie kropel roztworu wirusa.
  13. Przejść do pożądanych współrzędnych iniekcji i wstrzyknąć połowę zawartości pipety (~0,5 µl), stosując następujące ustawienia urządzenia do iniekcji ciśnieniowej: ciśnienie 20 psi, średnia długość impulsu 30 ms, średnia liczba impulsów 50.
  14. Pozostawić pipetę w miejscu przez ~1 min przed jej powolnym (1 mm/min) wycofaniem.
  15. Oczyścić czaszkę za pomocą PBS (pH 7,4) i usunąć klamry. Delikatnie zbliżyć brzegi skóry i zaszyć nacięcie (3 - 4 węzły). Nanieść środek dezynfekujący (na bazie powidonu jodowego) wokół rany.
  16. Przerwać znieczulenie i nie pozostawiać myszy bez nadzoru, dopóki całkowicie się nie obudzi. Utrzymywać myszy w pojedynczych klatkach. Po operacji kontynuować monitorowanie stanu zdrowia; w razie potrzeby podać środek przeciwbólowy.
  17. Utrzymywać zwierzęta przez 4 tygodnie przed utrwaleniem mózgu, aby zapewnić odpowiedni poziom ekspresji wirusa.

2. Przygotowanie preparatu

  1. Fiksacja mózgu
    1. Przygotowanie utrwalacza
      1. Aby przygotować 1 L utrwalacza, odważ 10 g paraformaldehydu i dodaj go do 300 ml oddejonizowanej H2O. Podgrzewaj do 55 - 60 ºC przez ok. 10 min przy ciągłym mieszaniu.
      2. Wyłącz ogrzewanie i dodaj 7 - 8 kropli 4 N NaOH. Roztwór powinien stać się klarowny w ciągu ok. 10 min.
      3. Pozostaw do ochłodzenia do RT, dodaj 150 ml nasyconego roztworu kwasu pikrynowego i uzupełnij objętość do 500 ml oddejonizowaną H2O.
      4. Dodaj 500 ml 0.2 M buforu fosforanowego (PB). Przefiltruj przez papier filtracyjny. Dostosuj pH do 7.4 za pomocą NaOH.
      5. Schłodź utrwalacz do 6 ºC i przechowuj w ciemnych szklanych butelkach nie dłużej niż jeden dzień w temperaturze 6 ºC.
    2. Perfuzja transkardiakalna
      1. Zanieczul myszy poprzez domięśniowy zastrzyk tiopentalu (120 mg/kg masy ciała). Upewnij się, że zwierzę znajduje się w głębokiej narkozie, sprawdzając odruch wycofania łapy, który powinien być nieobecny. Połóż zwierzę na plecach na stole do perfuzji z unieruchomionymi czterema kończynami.
      2. Rozetnij podłużnie ścianę brzucha nożyczkami tępymi i wykonaj dwa dodatkowe cięcia boczne wzdłuż brzusznej krawędzi klatki piersiowej, aby odsłonić przeponę. Wycięcie przeponę i przetnij ścianę klatki piersiowej na granicy kostno-chrzestnej po obu stronach. Unieś tylny koniec centralnej części ściany klatki piersiowej zawierającej mostek, aby odsłonić serce.
      3. Usuń osierdzie, wykonaj małe, precyzyjne cięcie w szczycie lewej komory, aby wprowadzić kaniulę aparatu do perfuzji. Użyj kaniuli tępej o średnicy wewnętrznej 0.6 mm. Delikatnie wprowadź kaniulę przez komorę, aż jej końcówka pojawi się w aorcie wstępującej, a następnie zabezpiecz kaniulę zaciskiem. Aby umożliwić odpływ krwi i perfuzytów z krwiobiegu, wykonaj cięcie w prawym przedsionku.
      4. Przeprowadź perfuzję transkardiakalną myszy przy użyciu pompy perystaltycznej przy szybkości przepływu 5 ml/min, najpierw PBS (25 mM, 0.9% NaCl, pH 7.4) przez około 1 min, a następnie schłodzonym na lodzie utrwalaczem przez 7 min.
      5. Po fiksacji oddziel głowę myszy za pomocą nożyczek, a następnie rozetnij skórę wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa. Usuń mięśnie, aby w pełni odsłonić czaszkę.
      6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj podłużne cięcie przez kości potyliczne i międzoparietalne, zaczynając od otworu wielkiego. Używając precyzyjnej pęsety, usuń te kości, aby odsłonić cały móżdżek. Następnie wykonaj kolejne podłużne cięcie przez kości ciemieniowe i czołowe aż do kości nosowej i usuń je pęsetą, aby odsłonić cały mózg.
      7. Za pomocą szpatułki usuń mózg, nie uszkadzając go, i umieść go w lodowatym 0.1 M PB.
  2. Sekcjonowanie i przycinanie próbek
    1. Wycięcie żyletkami bloku koronalnego o grubości około 5 - 6 mm zawierającego obszar zainteresowania. Przyklej go do uchwytu wibroslicera za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Zorientuj blok tkanki tak, aby neokora była skierowana w stronę wibrującego ostrza. Wykonaj przekroje koronalne zawierające ciało migdałowate o grubości 140 µm za pomocą wibroslicera (Rycina 1A) w lodowatym 0.1 M PB i zbierz je w płytce 6-dołkowej w tym samym buforze.
    2. Pod stereomikroskopem wytnij z przekroju obszar zainteresowania (tutaj: przyśrodkowo-grzbietowy klaster parakapsularny ITC, patrz Rycina 1B). Wykonaj to w płytce Petriego powlekanej elastomerem silikonowym i wypełnionej 0.1 M PB, używając skalpela oftalmologicznego. Upewnij się, że przycięte bloki mieszczą się w otworze dystansera (około 1.5 mm) (Rycina 1B).
    3. Przenieś przycięte bloki do roztworu krioprotekcyjnego (30% glicerolu w 0.1 M PB) na noc (O/N) w temperaturze 6 ºC.

3. Mrożenie pod wysokim ciśnieniem

UWAGA: Metoda FRIL składa się z 6 kluczowych etapów (Rysunek 2): 1) Szybkie zamrażanie preparatu pod wysokim ciśnieniem (przy 2,300 - 2,600 bar). 2) Rozłamanie preparatu. Płaszczyzna przełomu zazwyczaj przebiega wzdłuż centralnego rdzenia hydrofobowego zamrożonych błon, dzieląc je na dwie połówki warstwy błonowej: połowę przylegającą do protoplazmy (twarz P) oraz połowę przylegającą do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub egzoplazmatycznej (twarz E). 3) Replikacja preparatu poprzez naparowanie platyny i węgla w próżni. 4) Trawienie tkanki detergentem. 5) Znakowanie immunozłotem. 6) Analiza repliki przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

  1. Przygotowanie nośników miedzianych
    UWAGA: Aby móc przeprowadzić próbki przez kolejne etapy procedury FRIL, muszą one zostać zamocowane na metalowych (złotych lub miedzianych) nośnikach. Nośniki te różnią się rozmiarem i konstrukcją w zależności od trybu pękania oraz rodzaju zastosowanych maszyn. W niniejszym przypadku wykorzystano nośniki miedziane (Rycina 1B,E) oraz zawiasowy „podwójny stół do replikacji” (patrz Rycina 3B), co po otwarciu powoduje pęknięcie rozciągające w poprzek zamrożonej próbki (Rysunek 2). Pozwala to na zachowanie i powielenie obu stron pękniętej próbki.
    1. Polerowanie miedzianych nośników przy użyciu środka do usuwania nalotu i arkusza skóry chamois.
    2. Umieść nośniki w szklanym naczyniu i oczyść dwukrotnie niejonowym detergentem (pH ~1,5) w wodnej kąpieli ultradźwiękowej, następnie przemyj obficie wodą z kranu, a potem wodą dejonizowaną i na koniec dwukrotnie opłucz etanolem.
    3. Sonicuj nośniki miedziane w acetonie przez 15 min.
    4. Umieść nośniki na papierze filtracyjnym w celu osuszenia.
    5. Przyklej pierścień dwustronnej taśmy do miedzianego nośnika (Rysunek 1C), który będzie służył jako dołek utrzymujący przyciętą kostkę (nośnik utrzymujący).
  2. Zamrażanie preparatu
    UWAGA: Należy obchodzić się z ciekłym azotem z zachowaniem ostrożności i w odpowiednich okularach ochronnych.
    1. Włącz urządzenie do mrożenia pod wysokim ciśnieniem (Rycina 1F) co najmniej 1,5 godziny przed rozpoczęciem zamrażania preparatu.
    2. Rozpocząć ogrzewanie, naciskając przycisk „AIR HEATER”, a następnie przeprowadzić wypalanie przez 50 min. Ustawić temperaturę powietrza na 80 °C.
    3. Podłącz zbiornik z azotem do jednostki mrożenia wysokociśnieniowego i naciśnij przycisk „NITROGEN”, aby napełnić wewnętrzny naczynie Dewara ciekłym azotem. Zapali się kontrolka „NITROGEN LEVEL”. Rozpocznij chłodzenie, naciskając przycisk „Cooling”.
    4. Naciśnij przycisk „DRIVE IN”, gdy zgaśnie wskaźnik „NITROGEN LEVEL”. Sprawdź, czy system hydrauliczny przesuwa tłok w przód i w tył 3 razy.
    5. Należy nacisnąć przycisk „AUTO” oraz przycisk „NITROGEN”. Gdy zapali się kontrolka „READY”, urządzenie do mrożenia pod wysokim ciśnieniem jest gotowe do pracy.
    6. Umieść przycięty blok w otworze dwustronnej taśmy (Rycina 1B) przy użyciu pętlą z drutu platynowego, która została wtopiona w szklaną pipetę.
    7. Usuń nadmiar roztworu krioprotekcyjnego za pomocą papieru filtracyjnego lub pędzelka.
      UWAGA: Procedura ta jest również istotna w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, które mogą powstać wokół tkanki i doprowadzić do zniekształcenia jej kształtu i/lub ultrastruktury.
    8. Pod stereomikroskopem przykryj nośnik ustalający drugim nośnikiem w taki sposób, aby blok tkankowy znalazł się pomiędzy oboma nośnikami.
    9. Włóż nośnik w układzie kanapkowym do uchwytu na próbki w urządzeniu do mrożenia pod wysokim ciśnieniem (Rycina 1D). Włóż uchwyt na próbkę do jednostki mrożenia wysokociśnieniowego (końcówką w dół) i zabezpiecz go, przykręcając uchwyt na próbkę.
    10. Rozpocznij cykl mrożenia, naciskając przycisk „Jet-Auto”. Działając tak szybko, jak to możliwe, wyjmij uchwyt z próbką i zanurz końcówkę z ciekłym azotem w izolowanym pojemniku. Zanurz końcówki dwóch par pęset w ciekłym azocie w celu ich schłodzenia.
    11. Ostrożnie wyjmij nośnik-kanapkę (carrier-sandwich) z uchwytu na próbkę i umieść go w schłodzonej wcześniej krioprobówce. Upewnij się, że do manipulowania nośnikami używa się wyłącznie pęset chłodzonych ciekłym azotem. Krioprobówki powinny być perforowane, aby umożliwić odpływ azotu z probówki (Rysunek 1G).
    12. Powtórz kroki od 3.2.6 do 3.2.11, aż wszystkie wymagane próbki zostaną zamrożone. W jednej probówce można przechowywać wiele kanapek nośnikowych zawierających ten sam typ próbki.
    13. Przechowywać krio probówki zawierające nośniki w kriozamrażarce do czasu replikacji (Rysunek 1H).

Kriostat w mikrotomii, narzędzia do przygotowania próbek, obrazy mikroskopowe, systemy przechowywania kriogenicznego, konfiguracja laboratorium.
Rysunek 1. Przygotowanie tkanki i mrożenie pod wysokim ciśnieniem. (A) Vibroslicer używany do sekcjonowania tkanki. (B) Wynikowy koronalny przekrój mózgu myszy zawierający ciało migdałowate, pokazany obok miedzianego nośnika z naklejonym pierścieniem dwustronnej taśmy. Przerywana ramka wskazuje obszar zainteresowania zawierający przyśrodkowy klaster parakapsularny ITC. Średnica otworu w dwustronnej taśmie wynosi około 1,5 mm. (C) Narzędzia do przygotowania miedzianych nośników. Od górnego lewego rogu zgodnie z ruchem wskazówek zegara: dwustronna taśma, pęseta, wycinak, miedziane nośniki i nożyczki. (D) Wkładanie „kanapki nośnikowej” do uchwytu próbek do mrożenia pod wysokim ciśnieniem. Kanapka nośnikowa jest umieszczana w otworze uchwytu próbek. (E) Miedziane nośniki bez i z pierścieniem dwustronnej taśmy oraz „kanapka nośnikowa”. (F) Urządzenie do mrożenia pod wysokim ciśnieniem z ciśnieniowym zbiornikiem doprowadzającym ciekły azot. (G) Krioprobetka do przechowywania zamrożonych tkanek. Zwróć uwagę na otwory w górnej części probówki, które umożliwiają odpływ gazowego azotu z probówki (głowica strzałki). (H) Kriozbiornik do przechowywania zamrożonej tkanki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Mrożenie, łamanie i replikacja

  1. Przygotowanie działek wiązki elektronowej
    1. Przed włożeniem działek wiązki elektronowej należy zdjąć osłonę z „płytką odchylającą”. Przez dolną osłonę katody do uchwytu zaciskowego należy włożyć „przeciag ustawczy” do centrowania włókna.
      UWAGA: Końcówka przeciagu ustawczego o większej średnicy jest przeznaczona do działki węglowej, natomiast końcówka o mniejszej średnicy do działki platynowej.
    2. Nasunąć nowe włókno na przeciag, aż „blaszki dociskowe” będą mogły zacisnąć końce włókna, upewniając się, że zwoje włókna nie leżą pod kątem.
    3. Wyjąć przeciag ustawczy i włożyć pręt węglowy. Przymocować go, dokręcając uchwyt zaciskowy trzymacza pręta parownika, upewniając się, że koniec pręta znajduje się na wysokości środka drugiego zwoju od dołu. W przypadku działki platynowej koniec pręta platynowego powinien znajdować się na wysokości środka drugiego zwoju włókna od góry.
    4. Założyć płytkę odchylającą i włożyć działki do jednostki mroźnego łamania. Po użyciu należy wyczyścić działki za pomocą piaskarki.

Schemat procesu mrożenia i frakturowania: fraktura błony, replikacja, solubilizacja, znakowanie, analiza.
Rycina 2. Ilustracja kluczowych etapów techniki FRIL.
Schemat różnych etapów wymaganych do przygotowania i analizy repliki. (1) Zamrażanie tkanki pod wysokim ciśnieniem. (2) Frakturowanie. Podczas frakturowania zamrożonej tkanki dwuwarstwa lipidowa błon plazmatycznych zostaje rozdzielona na dwie połowy na granicy hydrofobowej. Białka w błonie plazmatycznej zostają przydzielone albo do błony egzoplazmatycznej (E-face), albo protoplazmatycznej (P-face). (3) Replikacja. Parowanie węgla (C) więzi lipidy i białka na powierzchni sfrakturowanej tkanki. Materiał jest powlekany 2 nm platyną/węglem w celu cieniowania pod kątem 60°, a następnie kolejną 15 nm warstwą węgla, która wzmacnia strukturę repliki (warstwa C, cieniowanie Pt). (4) Solubilizacja. Tkanka, która nie została uwięziona przez membranę repliki, jest następnie solubilizowana roztworem SDS. (5) Znakowanie. Interesujące białka można zwizualizować na replice za pomocą kompleksu złożonego ze specyficznych przeciwciał pierwotnych (Primary Ab) i przeciwciał wtórnych (Secondary Ab) sprzężonych z cząsteczką złota (Au). Zastosowanie cząsteczek złota o różnych rozmiarach pozwala na detekcję więcej niż jednego białka na tej samej replice. (6) Po immunoznakowaniu repliki są zbierane na miedziane siatki i analizowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy 80 - 100 kV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie urządzenia do mrożenia i fraktury
    1. Włącz urządzenie do mrożenia i fraktury (Rysunek 3A), ustawiając przełącznik MAINS na 1. Szczegółowy opis procedur mrożenia, fraktury i replikacji znajduje się w instrukcjach obsługi dostarczonych przez producenta.
    2. Przed schłodzeniem urządzenia do mrożenia i fraktury przeprowadź wypalanie całego układu chłodzenia za pomocą ciepłego powietrza. Naciśnij przycisk „Thawing” w urządzeniu MTC 010 (układ sterowania temperaturą) (Rysunek 3A) i pozostaw proces wypalania na 45 min.
    3. Uruchom stację próżniową. Urządzenie do mrożenia i fraktury zazwyczaj pracuje w zakresie próżni od ~10-6  do 10-7 mbar.
    4. Napełnij zbiornik azotem i podłącz go do urządzenia do mrożenia i fraktury. Sprawdź, czy uchwyt zaworu jest suchy, oraz oczyść wlot zbiornika przed włożeniem uchwytu zaworu (wilgoć może zakłócić próżnię i wskaźnik napełnienia zbiornika N2).
    5. Rozpocznij chłodzenie, ustawiając temperaturę na -115 °C. Chłodzenie trwa około 45 min.
    6. Włóż działa wiązki elektronów i dostosuj natężenie oraz napięcie, aby uzyskać następujące parametry naparowania:
      Działo węglowe: obrót włączony, pozycja 90°, szybkość osadzania węgla 0,1 - 0,2 nm/sec
      Działo węglowo-platynowe: obrót wyłączony, pozycja 60°, szybkość osadzania 0,06 - 0,1 nm/sec
      UWAGA: Jeśli działo jest używane po raz pierwszy po wymianie pręta węglowego lub platynowego, przeprowadź odgazowanie przez 3 min przed użyciem.
  2. Fraktura i replikacja
    1. Włóż zamrożone kanapki nośne do stołu replikacji podwójnej, upewniając się, że wszystkie czynności są wykonywane w ciekłym azocie.
    2. Przenieś stół replikacji podwójnej do naczynia typu Dewara i zamocuj go w odbiorniku stolika z preparatem pod kątem 45°. Poziom ciekłego azotu powinien być zawsze powyżej stołu replikacji podwójnej.
    3. Pobierz stół replikacji podwójnej za pomocą manipulatora i włóż go do urządzenia do mrożenia i fraktury na stolik chłodzący. Odczekaj około 20 min, aby temperatura stołu replikacji podwójnej ustabilizowała się na poziomie -115 °C.
    4. Sprawdź, czy próżnia jest poniżej 10-6 mbar, a temperatura wynosi -115 °C.
    5. Wykonaj frakturę tkanki poprzez ręczny obrót koła przeciwzegarowo, które jest połączone z osłoną umieszczoną nad stołem replikacji podwójnej. Obrót osłony wymusza otwarcie stołu replikacji podwójnej, co prowadzi do fraktury tkanki.
    6. Naciśnij przycisk „High tension” w urządzeniu EVM 030 (układ sterowania naparowaniem wiązką elektronów) urządzenia do mrożenia i fraktury (Rysunek 3A).
    7. Wykonaj replikację odsłoniętych powierzchni sfrakturowanej tkanki (Rysunek 3C) poprzez naparowanie węgla (z obrotem) za pomocą działa wiązki elektronów ustawionego pod kątem 90° do grubości 5 nm, a następnie jednokierunkowe cieniowanie platyną i węglem pod kątem 60° do grubości 2 nm. Na koniec nałóż warstwę węgla o grubości 15 nm pod kątem 90° (z obrotem).
    8. Do naparowania zastosuj następujące parametry:
      1. węgiel: obrót włączony, pozycja 90°; prędkość 0,1 - 0,2 nm/sec; 5 nm
      2. węgiel-platyna: pozycja 60°; prędkość 0,06 - 0,1 nm/sec; 2 nm
      3. węgiel: obrót włączony, pozycja 90°; prędkość 0,3 - 0,5 nm/sec; 15 nm
    9. Wyjmij zreplikowane preparaty z urządzenia do mrożenia i fraktury i przenieś je do ceramicznej płytki 12-dołkowej (Rysunek 4A) wypełnionej TBS (roztwór soli buforowanej Trisem, pH 7,4).
    10. Za pomocą platynowej pętli z drutu usuń zreplikowaną tkankę z nośnika preparatu (Rysunek 4A).
    11. Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.10, aż wszystkie próbki zostaną zreplikowane.

System do naparowania wiązką elektronów, z opisanymi jednostkami sterującymi, do osadzania i pomiaru cienkich warstw.
Rysunek 3. Mrożenie-trawienie i replikacja.
(A) Urządzenie do mrożenia-trawienia. Maszyna zawiera kilka jednostek sterujących oraz monitor. Próbki wprowadza się do komory przez port znajdujący się po lewej stronie komory. Do urządzenia do mrożenia-trawienia podłączony jest zbiornik z ciekłym azotem pod ciśnieniem w celu chłodzenia stolika. Obrazy poniżej przedstawiają powiększone widoki dwóch jednostek (UPC 010 i MDC 010) oraz monitor wyświetlający parametry podczas naparowania drugiej warstwy węgla. (B) Widok otwartego (lewo) i zamkniętego (prawo) stolika do podwójnej replikacji. „Kanapki nośne” (carrier-sandwiches) wkłada się do szczelin w stoliku (wskazane strzałkami). Małe ramiona zapobiegają wypadnięciu „kanapek nośnych” podczas manipulacji. (C) Przetrawiona i zreplikowana próbka. Repliki widoczne są jako cienkie czarne błony na powierzchni przetrawionej tkanki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Trawienie repliki w SDS
    1. Przenieś replikę do 4 ml szklanej fiolki wypełnionej 1 ml buforu do trawienia w SDS (2,5% Sodium Lauryl Sulfate, 20% sacharozy w 15 mM Tris, pH 8,3). Traw przez 18 hr w 80 °C przy wstrząsaniu (45 stroke/min).
    2. Przenieś repliki do nowej probówki wypełnionej buforem do trawienia w SDS i przechowuj w RT.

5. Immunoznakowanie

UWAGA: Wszystkie inkubacje są przeprowadzane w RT przy delikatnym wstrząsaniu, z wyjątkiem inkubacji z przeciwciałami.

  1. Przemywać replikę przez 10 min w świeżym buforze do trawienia SDS.
  2. Przemyć replikę raz w 2,5% BSA (albuminie surowicy bydlęcej) w TBS przez 5 min, a następnie 3 x 10 min w 0,1% BSA w TBS.
  3. Zablokować nieswoiste miejsca wiązania w TBS z 5% BSA przez 1 h.
  4. Nanieść przeciwciała pierwotne rozcieńczone w 2% BSA-TBS. Inkubacje przeprowadzać w kropli 30 µl (Rycina 4B) w komorze wilgotnej w temperaturze 15 °C przez 72 h (Rycina 4C).
    1. W niniejszym badaniu opracować obie repliki z tkanki frakcjonowanej. Jedną replikę inkubować z poliklonalnym przeciwciałem świni morskiej skierowanym przeciwko aminokwasom 717–754 mysiego GluR1 wspólnego dla wszystkich podjednostek AMPA-R (rozcieńczenie: 1:200) lub mysim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko rekombinowanemu białku fuzyjnemu obejmującemu aminokwasy 660–811 podjednostki NR1 receptora NMDA-R (rozcieńczenie: 1:500) oraz króliczym przeciwciałem poliklonalnym skierowanym przeciwko zielonemu białku fluorescencyjnemu (rozcieńczenie: 1:300).
    2. Drugą replikę inkubować z króliczym przeciwciałem poliklonalnym skierowanym przeciwko syntetycznemu peptydowi odpowiadającemu aminokwasom 384–398 szczurzego receptora µ-opioidowego (rozcieńczenie: 1:500).
  5. Przemyć w TBS z 0,05% BSA (3 x 5 min.).
  6. Nanieść przeciwciała wtórne. W niniejszym badaniu zastosować przeciwciała sprzężone ze złotem (5 nm dla jonotropowych receptorów glutaminianu, 10 nm dla receptorów µ-opioidowych i/lub 15 nm dla ChR2-YFP) rozcieńczone w TBS z 2% BSA. Rozcieńczyć przeciwciała wtórne 1:30 i inkubować w kropli 30 µl w temperaturze 15 °C przez noc (O/N).
  7. Przemyć 3 x 5 min w 0,05% BSA-TBS w temperaturze pokojowej (RT).
  8. Przemyć 2 x 5 min w wodzie ultrapurej.
  9. Zamocować replikę na siatce z 100 równoległymi prętami powleczoną formvarem (Rycina 4D).

6. Analiza replik

  1. Wykonaj obrazy replik przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) przy napięciu 80 lub 100 kV. Pozyskaj obrazy cyfrowe za pomocą kamery CCD (charge-coupled device).
  2. W trybie offline znajdź odpowiadające sobie obszary na obrazach z obu replik, wykorzystując punkty orientacyjne (Ryc. 4E). Przeanalizuj obrazy cyfrowe w programie Image J. Wyznacz powierzchnię postsynaptyczną oraz liczbę cząsteczek znakowanych immunozłotem skierowanych przeciwko analizowanemu receptorowi.

Przygotowanie i analiza próbek polimerowych; obejmuje sprzęt laboratoryjny, suszarkę, obrazowanie powierzchni SEM.
Rycina 4. Immunoznakowanie repliki.
(A) Narzędzia do manipulacji i płukania replik. Ceramiczna płytka 12-dołkowa (prawy górny róg) oraz 2 rodzaje pipet szklanych (lewy górny róg). Pipeta szklana z okrągłą końcówką (lewy dolny róg) służy do przenoszenia repliki, a pipeta z platynowym prętem (środek na dole) do rozkładania replik. Replika w buforze do płukania (prawy dolny róg). (B) Immunoznakowanie replik przeprowadza się w kroplach (30 µl) umieszczonych na małym kawałku parafilmu w dołku płytki hodowlanej 6-dołkowej. Zauważ, że replika jest przykryta kroplą buforu zawierającego przeciwciała. Aby zapobiec odparowaniu, wokół wewnętrznej krawędzi dołka umieszcza się zwilżony kawałek papieru tkankowego. (C) Inkubator do etapu immunoznakowania. Inkubacje przeprowadzane są w temperaturze 15 °C. (D) Replika zamocowana na siatce z równoległymi prętami 100-liniowymi powleczonymi formvarem. (E) Mikrofotografie przy niskim powiększeniu z pary replik. Kropkowane kwadraty wskazują trzy typowe punkty orientacyjne służące do identyfikacji lokalizacji w odpowiadających im replikach. Pasek skali: 10 µm. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Technika FRIL w połączeniu z ekspresją optogenetycznych aktuatorów pochodzenia mikrobiologicznego 21, t.j. kanałów zintegrowanych z błoną plazmatyczną i efektywnie transportowanych anterogradnie wzdłuż aksonów, pozwala na ilościowe badanie postsynaptycznej ekspresji AMPA-Rs i NMDA-Rs w określonej podgrupie synaps. Zostało to tutaj zaprezentowane dla aksonów pochodzących z różnych jąder wzgórza (np. PIN/MGn) do neuronów ITC w ciele migdałowatym. Podejście to umożliwia analizę molekularną pojedynczych synaps wejścia sensorycznego do neuronów ITC – grupy komórek, które do tej pory pozostawały oporne na szczegółową charakterystykę anatomiczną i molekularną.

Cztery tygodnie po stereotaktycznym wstrzyknięciu rAAV-ChR2-YFP do PIN/MGn, aksony dodatnie pod kątem ChR2-YFP gęsto unerwiły LA, obszar przejścia ciała migdałowatego do prążkowia (Astria) oraz przyśrodkowy paracapsularny klaster ITC w ciele migdałowatym, co jest wzorcem w pełni zgodnym z poprzednimi badaniami tracingowymi 16, 22. Wykryliśmy również intensywne złote znakowanie immunologiczne ChR2-YFP na powierzchni P aksonów i zakończeń w replikach mrożenia-trawienia od myszy, którym wstrzyknięto rAAV-ChR2-YFP (Rysunek 5A), czego nie zaobserwowano w replikach od myszy niewstrzykniętych. Specjalizację błony postsynaptycznej synaps glutaminergicznych w replice można zaobserwować jako skupisko cząsteczek wewnątrzmembranowych (IMPs) na powierzchni E błony plazmatycznej 2, 23, czemu często towarzyszy powierzchnia P jej presynaptycznej błony plazmatycznej 7 (Rysunek 5B-C). Cechy te pozwoliły na identyfikację specjalizacji postsynaptycznej synaps glutaminergicznych utworzonych przez zakończenia aksonalne PIN/MGn (Rysunek 5 i 6). Znakowaliśmy AMPA-Rs przeciwciałem rozpoznającym wszystkie cztery podjednostki (GluA1-4), natomiast NMDA-Rs wykrywano przy użyciu przeciwciała przeciwko niezbędnej podjednostce NR1.

Ze względu na brak narzędzi pozwalających na wykrycie w obrębie tej samej repliki, czy synapsy te powstały na kolcach dendrytycznych czy na trzonach neuronów ITC, wybarwiliśmy odpowiadającą im powierzchnię repliki pod kątem receptorów µ-opioidowych, ponieważ neurony ITC wykazują postsynaptyscznie wysoki poziom tych receptorów 24. Wymagało to identyfikacji tych samych profili postsynaptycznych w dwóch replikach (Rycina 5C-F oraz Rycina 6A-D) przy użyciu strategii wykorzystującej punkty orientacyjne (Rycina 4E).

EM mrożenia i frakturowania, fuzja pęcherzyków synaptycznych, PSD, powierzchnia E, powierzchnia P, wyniki mikroskopii elektronowej.
Rycina 5. Detekcja ChR2-YFP i jonotropowych receptorów glutaminianowych na replice za pomocą cząsteczek immunozłota. (A) Poprzecznie sfrakturowany terminal aksonalny (jasnoniebieski) i niewielkie fragmenty jego powierzchni P znakowane 15 nm cząsteczkami złota wykrywającymi ChR2-YFP. Wewnątrz terminala widoczne są błony licznych pęcherzyków synaptycznych (sv). Zwróć uwagę na specyficzność immunoznakowania, ograniczone w dużej mierze do błony plazmatycznej. Znakowanie ChR2 identyfikuje terminal jako pochodzący z PIN/MGn. Terminal tworzy asymetryczną synapsę z kolcem dendrytycznym. Specjalizacja błony postsynaptycznej (PSD) na powierzchni E wykazuje charakterystyczny skupisk cząsteczek wewnątrz błonowych i jest znakowana 5 nm cząsteczkami złota ujawniającymi AMPA-Rs. (B) Powierzchnia P aksonu wykazującego ekspresję ChR2 (znakowana 15 nm cząsteczkami złota) sąsiaduje z dwoma dendrytami, z których jeden posiada dwa PSD znakowane 5 nm cząsteczkami złota ujawniającymi NMDA-Rs. (C-D) Przeciwległe powierzchnie błon przed- i postsynaptycznych synapsy PIN/MGn-ITC. (C) Powierzchnia P terminala wykazuje ekspresję ChR2 (znakowana 15 nm cząsteczkami złota) i rozciąga się nad powierzchnią E dwóch trzonów dendrytycznych, z których jeden zawiera dwa PSD znakowane pod kątem AMPA-Rs (5 nm cząsteczki złota). (D) Odpowiadająca im powierzchnia P dwóch dendrytów jest znakowana pod kątem receptorów µ-opioidowych (10 nm cząsteczki złota). (E-F) Powiększenia obszarów ograniczonych przerywanymi liniami. Paski skali: 500 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Immunocząsteczki dla AMPA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC znaleziono w całym klastrze IMP, co sugeruje jednorodny rozkład w obrębie specjalizacji postsynaptycznej (Rycyna 5E). Znacznie wyższą (test t nieparzysty p<0,018) gęstość znakowania AMPA-R zaobserwowano w synapsach PIN/MGn na kolcach ITC (715±38 cząsteczek złota/µm2, n = 32) w porównaniu do synaps na dendrytach ITC (590±44 cząsteczek złota/µm2, n = 32). Ogólnie gęstość AMPA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC wykazała stosunkowo niską wariancję (współczynnik zmienności, CV = 0,37), co jest zgodne z jednorodnym rozkładem.

Cząstki immunozłota dla NMDA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC często wykazywały nierównomierny rozkład w obrębie postsynaptycznych klastrów IMP (Ryc. 5B). Gęstość znakowania NMDA-R była podobna (nieparzysty test t p=0,39) pomiędzy synapsami PIN/MGn na kolcach ITC (1070±153 cząstek złota/µm2, n=8) a dendrytami ITC (812±183 cząstek złota/µm2, n=9). W przeciwieństwie do obserwacji dla AMPA-Rs, gęstość NMDA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC była wysoce zmienna (CV = 0,54).

Mikroskopia elektronowa pokazująca struktury synaptyczne z cząsteczkami złota, schematy wykresów analizy danych.
Rycina 6. Immunoznakowanie AMPA-Rs i NMDA-Rs w zidentyfikowanych synapsach PIN/MGn-ITC.
(A-B) Przeciwległe strony membran presynaptycznej i postsynaptycznej synapsy PIN/MGn-ITC utworzonej na kolcu dendrytycznym, w której strona P terminala wykazuje ekspresję ChR2 (znakowana 15 nm cząsteczkami złota), a PSD na kolcu dendrytycznym jest znakowana pod kątem AMPA-Rs (5 nm cząsteczki złota). (C-D) Powiększone widoki obszarów zaznaczonych linią przerywaną. Obszary te zostały obrócone o około 45° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby umożliwić lepszą obserwację PSD. (E) Wykresy rozrzutu liczby cząsteczek AMPA-R w zależności od powierzchni synaptycznej w kolcach i dendrytach ITC. W obu strukturach zaobserwowano korelację dodatnią. (F) Wykresy rozrzutu liczby cząsteczek NMDA-R w zależności od powierzchni synaptycznej w kolcach i dendrytach ITC. Istotna korelacja dodatnia została wykryta tylko w kolcach dendrytycznych. Paski skali: 500 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ponieważ powierzchnia P presynaptycznej błony plazmatycznej często częściowo nakładała się na postsynaptyczny klaster IMP, byliśmy w stanie oszacować powierzchnię synaptyczną jedynie w 30% synaps (kolce: średnia powierzchnia 0,032 µm2, zakres: od 0,007 do 0,063 µm2, n = 8; dendryty: 0,047 µm2, zakres: od 0,024 do 0,166 µm2, n = 11). Wartości te mieściły się w podobnym zakresie co wcześniej analizowane glutaminergiczne synapsy telencefaliczne 25.

Zarówno w kolcach, jak i w dendrytach, liczba złotych immunocząsteczek dla receptorów AMPA (AMPA-Rs) w poszczególnych synapsach była dodatnio skorelowana z powierzchnią synaptyczną (Spearman, kolce: r = 0.88, dendryty: r = 0.60, p<0.0001) (Rysunek 6E). W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że liczba złotych immunocząsteczek dla receptorów NMDA (NMDA-Rs) korelowała z powierzchnią synaptyczną w kolcach (Spearman, kolce: r = 0.90, p<0.002), ale nie w dendrytach (r = 0.21, p = 0.29) (Rysunek 6F).

Dyskusja

Mikroskopia elektronowa z zamrażaniem i pękaniem jest główną techniką w badaniach ultrastrukturalnych od ponad 40 lat. Jednak brak skutecznych środków do badania składu molekularnego membran spowodował znaczny spadek jego stosowania. Ostatnio nastąpiło znaczne ożywienie w mikroskopii elektronowej z zamrażaniem i pękaniem ze względu na opracowanie skutecznych sposobów ujawniania integralnych białek błonowych poprzez znakowanie immunozłotem 1, 2, a mianowicie technikę FRIL.

Technika FRIL ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami ultrastrukturalnymi immunogold. Po pierwsze, białka są łatwo dostępne dla przeciwciał, co zwiększa ich czułość. Po drugie, naświetlenie dużej części specjalizacji błony plazmatycznej, takich jak błona postsynaptyczna, na dwuwymiarowej powierzchni repliki pozwala na kontrolę rozkładu przestrzennego i fizycznej styczności cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania bez pracochłonnej i czasochłonnej rekonstrukcji seryjnych ultracienkich odcinków. Po trzecie, dostępność obu połówek błony plazmatycznej zwiększa liczbę białek, które można znakować dla każdej pojedynczej struktury, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie przeciwciała. Po pęknięciu hydrofobowa powierzchnia rozszczepionej błony jest pokryta węglem i platyną, która okopuje domeny białkowe pozostające na pękniętej powierzchni. Zapobiega to dostępowi przeciwciał do antygenów w tych domenach. Na przykład na powierzchni P repliki tylko epitopy skierowane w przestrzeń protoplazmatyczną mogą być wykryte przez przeciwciała, podczas gdy na powierzchni E tylko epitopy skierowane w przestrzeń egzoplazmatyczną mogą być wiązane przez przeciwciała (patrz ryc. 2).

Z drugiej strony, technika FRIL również cierpi z powodu pewnych ograniczeń 2. Ponieważ złamania występują losowo, może być trudno celować w określone komórki lub struktury. Może to również prowadzić do błędu systematycznego próbkowania, np. w zbieraniu synaps, biorąc pod uwagę różne prawdopodobieństwo pęknięcia wzdłuż błony struktur o różnej krzywiźnie (np. kolce kontra trzony). Co więcej, alokacja białek błonowych do jednej z dwóch ścian jest nieprzewidywalna. Dlatego dystrybucja białka do powierzchni P lub E, szczególnie w przypadku badań ilościowych, powinna być dokładnie zbadana przy użyciu przeciwciał reagujących na domeny wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Wreszcie, identyfikacja w replice niektórych struktur, takich jak presynaptyczne zakończenia aksonów, może być trudna, gdy opiera się tylko na cechach morfologicznych. Jednak zastosowanie specyficznych przeciwciał dla białek markerowych lub transdukcja znakowanych integralnych białek lub kanałów błonowych za pomocą wektorów wirusowych oferuje dodatkowe narzędzia ułatwiające identyfikację pękniętych błon. Na przykład w badaniu tym wykorzystano transdukcję ChR2-YFP w neuronach wzgórzowych w celu zidentyfikowania ich aksonalnych eferentów w ciele migdałowatym lub znakowania receptorów μ-opioidowych w celu odsłonięcia błon postsynaptycznych neuronów ITC.

Aby skutecznie wykonać technikę FRIL, należy zwrócić szczególną uwagę na utrwalenie tkanek. Silne utrwalenie tkanek (> 2% paraformaldehydu) może skutkować wysokim wskaźnikiem złamań krzyżowych i zmniejszeniem czułości znakowania. Z drugiej strony, słabe fiksacje utrudniają obchodzenie się z tkankami i ich przygotowanie (np . wycinanie skrawków). Ważne jest również, aby kontrolować, czy grubość przyciętych klocków odpowiada grubości taśmy dwustronnej. Jeśli grubość próbki jest mniejsza niż grubość taśmy, powierzchnie tkanki mogą nie przylegać do powierzchni dwóch metalowych nośników, w związku z czym zamrożona próbka nie zostanie pęknięta. Jeśli tkanka jest grubsza, zostanie ściśnięta z nieuniknionymi zniekształceniami strukturalnymi, gdy zostanie wykonana kanapka dwóch miedzianych nośników. Temperatura, w jakiej dochodzi do złamania egzemplarza (w tym protokole -115 °C) odgrywa również ważną rolę w budowie repliki. Wyższe temperatury mogą powodować większą szybkość artefaktów, takich jak kondensacja pary wodnej na powierzchni tkanki przed lub podczas parowania. Niższe temperatury (< -125 °C) mogą zwiększać ryzyko oderwania się materiału podczas szczelinowania. Materiał ten może spaść na powierzchnię próbki lub pozostać z nią połączony. Te płatki materiału są również powlekane i kontrastowane, tworząc ciemne plamy na obrazie. Pękanie w niższych temperaturach może również wpływać na częstotliwość pęknięć krzyżowych, szczególnie w przypadku małych drobnych struktur, takich jak kolce dendrytyczne. Kolejnym krytycznym krokiem w przygotowaniu replik jest trawienie detergentem. Jeśli trawienie jest niekompletne, niestrawiona tkanka pojawia się jako ciemne plamy na replice, co zakłóca analizę struktury w TEM. Co więcej, niestrawiona tkanka może niespecyficznie wychwytywać lub wiązać przeciwciała, zwiększając znakowanie tła. Z drugiej strony, stosowanie detergentów do trawienia tkanek może denaturować cząsteczki związane z repliką, zmieniając ich drugorzędowe i trzeciorzędowe struktury. Dlatego w przypadku niektórych antygenów może być konieczne stopniowe rozcieńczanie stężenia SDS za pomocą dodatkowych etapów mycia.

W przypadku znakowania immunologicznego dostępność różnych rozmiarów cząsteczek złota sprzężonych z przeciwciałami drugorzędowymi pozwala na wykrycie w tym samym czasie, ale tylko jakościowo, wielu białek, nawet w określonych mikrodomenach błony komórkowej, takich jak specjalizacja postsynaptyczna. Jednak ze względu na przeszkodę steryczną, badania ilościowe są na ogół ograniczone do wykrycia tylko jednej cząsteczki. Wielkość cząsteczki złota może również wpływać na skuteczność etykietowania.

W celu interpretacji znakowania w FRIL należy pamiętać, że cząstka immunozłota może znajdować się w dowolnym miejscu na półkuli o promieniu 20-25 nm od antygenu ze względu na elastyczny kompleks utworzony przez przeciwciało pierwszorzędowe i wtórne 26. W celu uzyskania dalszych informacji na temat teorii i praktyki FRIL i technik pokrewnych odsyłamy czytelnika również do innych artykułów metodologicznych 27, 28.

Technika FRIL została ostatnio wykorzystana do wysokorozdzielczych analiz ilościowych lokalizacji receptora glutaminianu w różnych populacjach synaps 29, 30. Co więcej, czułość wykrywania techniki FRIL dla AMPA-R oszacowano na poziomie jednej cząsteczki immunozłota na jeden funkcjonalny kanał AMPA-R 29. Tak więc podejście to jest ogólnie bardzo przydatne do ilościowego określania i analizowania wzorca postsynaptycznej ekspresji AMPA-R i NMDA-R w centralnych synapsach. Tutaj wykazaliśmy jego zastosowanie w synapsach PIN/MGn-ITC, miejscu najprawdopodobniej ważnym dla przekazywania informacji amerykańskich podczas warunkowania strachu. Używając przeciwciała podniesionego przeciwko wysoce konserwatywnym zewnątrzkomórkowym resztom aminokwasowym podjednostek receptora AMPA GluA1-GluA4, znaleźliśmy równomierny rozkład cząstek złota w klastrach IMP odpowiadających specjalizacji błony postsynaptycznej. Gęstość AMPA-R w kolcach ITC była istotnie wyższa w porównaniu z synapsami trzonu, do których kierowane są aferenty wzgórzowe PIN/MGn. Zarówno w synapsach kręgosłupa, jak i trzonu wykryto dodatnią korelację między znakowaniem AMPA-Rs a obszarem postsynaptycznym, co jest cechą wspólną dla innych synaps glutaminergiczne25. Niska wariancja gęstości AMPA-R w synapsach PIN/MGn-ITC wskazuje na jednorodną dystrybucję podobną do innych synaps utworzonych przez eferenty wzgórzowe 7, ale różną od synaps korowych 25. I odwrotnie, gęstość NMDA-Rs była bardziej zmienna i nie różniła się między synapsami kręgosłupa i trzonu, co sugeruje inną regulację niż AMPA-R. W przyszłości wysoka odtwarzalność techniki FRIL nie tylko pozwoli na ocenę podstawowego składu molekularnego centralnych synaps, ale może również ułatwić wykrywanie zmian w liczbie jonotropowych receptorów glutaminianu i dystrybucji subsynaptycznej po uczeniu się strachu, uzupełniając zapisy ex-vivo pre- i postsynaptycznych właściwości tych danych wejściowych.

Podsumowując, podejście to może być wykorzystane przez innych badaczy w celu uzyskania wglądu w relacje struktura-funkcja synaps pobudzających specyficznych dla danych wejściowych w wielu innych obwodach neuronalnych, w których rozwikłanie pochodzenia danych wejściowych oraz natury i składu elementów postsynaptycznych jest kluczowe, ale problematyczne.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Finansowanie zostało zapewnione przez grant FWF Austriackiego Funduszu Naukowego nr P-22969-B11 dla F. Ferraguti, a także przez Charitable Hertie Foundation i Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience oraz przez DFG (CIN-Exc. 307) dla I. Ehrlicha.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ramka Surgery
StereotaktycznaStoelting, USA51670może być zastąpiona inną ramką stereotaktyczną dla myszy
Adapter myszy stereotaktycznejStoelting, USA51625
Maska do znieczulenia gazowego dla myszyStoelting, USA50264już niedostępna, zastąpiona przez nr artykułu 51609M
Urządzenie do wstrzykiwania ciśnienia, Toohey SpritzerToohey Company, USAT25-2-900można stosować inne urządzenia do wtrysku ciśnieniowego (np. Picospritzer)
Kapilary szklane Kwik FillWorld Precision Instruments, Niemcy1B150F-4
Aparat anestezjologiczny, IsoFloEickemeyer, Niemcy213261
Regulator temperatury DC i poduszka grzewczaFHC, USA40-90-8D
Poziomy ściągacz do mikropipet model P-1000Sutter Instruments, USAP-1000
Sterylizator narzędzi chirurgicznych, Sterylizator 75Melag, Niemcy08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotyp 2/9)Penn Vector Core, USAAV-9-26973P
fast greenRoth, Niemcy0301.1
Izofluran znieczulający, Isofuran CP (1 ml/ml)CP Pharma, Niemcy
Antyseptyczny, Betadine (prowidon-jod)Purdure Products, USABSOL32można zastąpić innymi środkami dezynfekującymi
Przeciwbólowe, Metacam Roztwór (5 mg/ml meloksykamu)Boehringer Ingelheim, Niemcyzastąpić innymi środkami przeciwbólowymi
Maść do oczu BepanthenBayer, Niemcy0191można zastąpić innymi maściami do oczu
Wiertło NM3000 (SNKG1341 i SNIH1681)Nouvag, Szwajcaria
Sutranox Igła do szwówFine Science Tools, Niemcy12050-01
Pleciony jedwabny szewFine Science Tools, Niemcy18020-60
Nazwa>FirmaNumer katalogowyUwagi
Przygotowanie tkanki
Paraformaldehyde EM gradeAgar Scientific Ltd., Wielka BrytaniaAGR1018
Nasycony roztwór kwasu pikrynowegoSigma-Aldrich, USAP6744-1GA
Na2HPO4-2H20Merck Millipore, Niemcy1065860500
NaH2PO4-2H2O Merck Millipore, Niemcy1063451000
NaClMerck Millipore, Niemcy1064041000
4N NaOHCarl Roth, NiemcyT198.1
ThiopentalSandoz, Austria5,133
GlicerolSigma-Aldrich, USAG5516-500ML
System ultraczystej wody GenPureThermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone
Pompa perystaltycznaISMATEC, NiemcyISM 930C
MACHEREY-NAGEL, NiemcyMN 615 1/4
, VT1000SLeica Microsystems, Austria
Skalpel okulistycznyAlcon Laboratories, USAmożna zastąpić innymi skalpelami okulistycznymi
Kaniula perfuzyjnaVieweg, NiemcyF560088-1mogą być zastąpione podobnymi przedmiotami innych firm
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
High-pressure  Nośniki miedzi < / mocne>
MiedzianeBiuro Konstrukcyjne M. Wohlwend, CH528
Sidol PolskiHenkel, Niemcymożna zastąpić tym samym produktem innych firm
Skóra irchowaSklep
Dziurkacz, 1,5mmStubai, Austriamożna zastąpić tym samym artykułem innych firm
Denaturowany etanolDonauchem, Austriamożna zastąpić tym samym artykułem innych firm
AcetonRoth, Niemcy9372.5UWAGA!
Wysokociśnieniowa zamrażarka HPM 010BalTec, CH; teraz Leica MicrosystemsHPM010nie jest już produkowany, zastąpiona przez LeicaEM HPM100
Stereo-mikroskopOlympus, JaponiaSZX10
Ciekły azotUWAGA!
Fiolki kriogeniczneRoth, NiemcyE309.1można zastąpić tym samym artykułem innych firm
CryoCaneNalge Nunc International, USA5015-0001można zastąpić tym samym produktem innych firm
CryoSleeveNalge Nunc International, USA5016-0001można zastąpić tym samym produktem innych firm
Zbiornik do przechowywania ciekłego azotuCryopal, FrancjaGT38można zastąpić tym samym produktem innych firm
Detergent niejonowy (Lavocid)Werner & Mertz Professional, Niemcy
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1JOKE Joisten & Kettenbaum, NiemcySANDURET 2-Kmożna zastąpić tym samym artykułem innych firm
Węglik krzemu SIC 360, wielkość ziarna 25 - 21 i mikro;ŻART Joisten & Kettenbaum, Niemcy955932
System do pękania zamrażalniczego BAF 060BalTec, CH; teraz Leica MicrosystemsBAF060
Ceramiczna płytka 12-dołkowaGrö pel, Austria14511może być zastąpiony przez ten sam artykuł od innych firm
Trizma baseSIGMA, USAT1503może być zastąpiony przez ten sam produkt od innych firm
Chlorowodorek TrizmaSIGMA, USAT3253może być zastąpiony przez ten sam artykuł innych firm
Chlorek soduMerck, Niemcy1 064 041 000można zastąpić tym samym artykułem innych firm
SDS, Laurylosiarczan soduRoth, Niemcy5136.1UWAGA! ;   może być zastąpiony tym samym artykułem z innych firm
SacharozaMerck, Niemcy1,076,871,000może być zastąpiony tym samym artykułem z innych firm
TRISRoth, Niemcy5429.3może być zastąpiony tym samym artykułem z innych firm
Uniwersalne spoiwodo pieców hybrydyzacyjnych7001-0050można zastąpić tym samym artykułem innych firm
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Immunolabelling
BSASIGMA, USAA9647można zastąpić tym samym artykułem innych firm
Sondy molekularneprzeciwciała anty-GFPA11122
Przeciwciało anty-pan-AMPARFrontier Institute, Japoniapan AMPAR-GP-Af580-1
Przeciwciało anty-NMDAR1, klon 54.1Merck Millipore, NiemcyMAB363
Przeciwciało przeciwko receptorowi opioidowemu Mu (MOR)ImmunoStar, USA24216
EM kozia świnka morska, 5 nm; przeciwciało drugorzędoweBBInternational, Wielka BrytaniaEM. GAG5
EM kozioł anty-królik, 15 nm; przeciwciało drugorzędoweBBInternational, Wielka BrytaniaEM. GAR15
Osioł anty-królik, 10nm, przeciwciało wtórneAURION, HolandiaDAR 10nm
Siatki miedziane, 100 Parallel Bar  Agar scientific, UKG2012C
IncubatorMajor Science, USAMO-RCmożna zastąpić tym samym produktem innych firm
Pioloform Powder  Agar scientific, UKR1275
ChloroformRoth, Niemcy3313.1UWAGA! ;   można zastąpić tym samym przedmiotem z innych firm
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EM analiza
Philips CM120 TEMKamera CCD Philips/FEI
MoradaMiękkie systemy obrazowania, Niemcy
iTEM Ver. 5.2, oprogramowanie do obrazowaniaSoft Imaging Systems, Niemcy
można 50131235 Bibuła filtracyjna Krajalnica wibracyjna z artykułami gospodarstwa domowego, Niemcy , USA

Bibliografia

  1. Fujimoto, K. SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application. Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).
  2. Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).
  3. Rash, J. E., Yasumura, T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis. Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).
  4. Emes, R. D., Grant, S. G. Evolution of synapse complexity and diversity. Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).
  5. Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  6. Rollenhagen, A., Lübke, J. H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function. Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).
  7. Tarusawa, E., et al. Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses. J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).
  8. Nusser, Z., et al. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).
  9. Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus. Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).
  10. Nicholson, D. A., Geinisman, Y. Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).
  11. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
  12. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
  13. Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala. Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).
  14. Duvarci, S., Pare, D. Amygdala microcircuits controlling learned fear. Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).
  15. Jüngling, K., et al. Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala. Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).
  16. Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
  17. Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).
  18. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  19. Sigurdsson, T., et al. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
  20. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. J. Vis. Exp. (110), e53628(2016).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  22. Bienvenu, T. C. M., et al. Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information. J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).
  23. Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes. Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).
  24. Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction. Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).
  25. Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).
  26. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  27. Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).
  28. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).
  29. Tanaka, J., et al. Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum. J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).
  30. Mansouri, M., et al. Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex. Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie optogenetycznemikroskopia elektronowaprzekaźnictwo synaptyczneekspresja kanałrodopsyny-2znakowanie immunozłotemplastyczność synaptycznajonotropowe receptory glutaminianu
Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.