Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53900

⸱

27 maja 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje możliwość przeprowadzenia profilowania miRNA w egzosomach, uwalnianych w osoczu pacjentów z NSCLC, za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji egzosomów z terapią proteinazą K i RNAza, w celu uniknięcia zanieczyszczenia krążącymi miRNA i oceny ich cech biomarkerów w NSCLC.

Streszczenie

Odkrycie zmian w genach EGFR i ALK, między innymi, w NSCLC przyczyniło się do rozwoju terapii lekami celowanymi z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI). Aby zoptymalizować wykorzystanie tych TKI, konieczne jest odkrycie nowych biomarkerów do wczesnego wykrywania i progresji choroby. Te izolowane plazmą egzosomy mogą być stosowane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i monitorowania tych biomarkerów. Jako źródło egzosomów wykorzystano jeden ml osocza od 12 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, z różnymi mutacjami i leczeniem (oraz 6 zdrowych dawców jako grupę kontrolną). Po potraktowaniu RNAza, w celu degradacji krążących miRNA, egzosomy wyizolowano za pomocą komercyjnego zestawu i ponownie zawieszono w określonych w celu dalszej analizy. Egzosomy scharakteryzowano za pomocą western blot dla ALIX i TSG101 oraz za pomocą analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), standardowych technik uzyskiwania danych biochemicznych i wymiarowych tych nanopęcherzyków. Ekstrakcję całkowitego RNA przeprowadzono za pomocą komercyjnego zestawu o wysokiej wydajności. Ze względu na ograniczoną zawartość miRNA w egzosomach zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie retrotranskrypcji PCR przy użyciu indywidualnego testu dla każdego wybranego miRNA. Panel miRNA (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), wszystkie skorelowane z chorobą NSCLC, przeanalizowano przy użyciu niezwykłej czułości i swoistości analizy Real-Time PCR; mir-1228-3p zastosowano jako kontrolę endogenną, a dane przetworzono według wzoru 2-ΔΔct 13. Wartości kontrolne zastosowano jako wartość wyjściową, a wyniki przedstawiono w skali logarytmicznej.

Wprowadzenie

Niski wskaźnik przeżycia u pacjentów z NSCLC (niedrobnokomórkowym rakiem płuca) wynika głównie z ograniczonej skuteczności leczenia w zaawansowanej chorobie i słabego wczesnego wykrywania1. Wiadomo, że mutacje aktywujące w genie EGFR, które odkryto w subpopulacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, nadają wrażliwość na inhibitory kinazy tyrozynowej (TKI). Niestety, u większości pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR rozwija się opornośćna TKI 2. Szczególnie w tym kontekście prawidłowa diagnoza jest obowiązkowa. Ogólnie rzecz biorąc, ze względu na lokalizację guzów, uzyskanie tkanki biopsyjnej w NSCLC nie zawsze jest możliwe. Dlatego prowadzonych jest kilka badań, które wykorzystują metody nieinwazyjne w celu uzyskania tych danych biologicznych. Egzosomy są opisywane jako płynne składniki biopsji, które można badać w celu uzyskania wartości diagnostycznych i prognostycznych za pomocą technik nieinwazyjnych3.

Egzosomy to nanopęcherzyki (o średnicy 40 - 100 nm) pochodzenia endocytarnego, które są uwalniane przez różne typy komórek, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych4. Mogą przenosić białka, lipidy, mRNA i mikroRNA. Co więcej, kilka badań sugeruje plejotropową rolę egzosomów pochodzących z guza, które mogą wpływać na wzrost i przeżycie komórek nowotworowych, angiogenezę, przebudowę zrębu i macierzy zewnątrzkomórkowej oraz opornośćna leki 5.

MicroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA, które biorą udział w regulacji potranskrypcyjnej, wiążąc 3′-UTR docelowych mRNA i prowadząc mRNA do degradacji lub do braku translacji6. Opisano selektywne sortowanie miRNA na egzosomy. W tym kontekście, niedawno wykazano, in vitro i in vivo, selektywne pakowanie miR-21 (dobrze znanego miRNA o działaniu onkogennym) w egzosomy uwalniane przez linie komórkowe przewlekłej białaczki szpikowej po leczeniu kurkuminą7.

Egzosomalny profil miRNA jest podobny do profilu miRNA pierwotnego nowotworu i ta cecha może być wykorzystana we wczesnej diagnostyce i rokowaniu3. W szczególności istnieje możliwość scharakteryzowania, za pomocą real-time PCR, wybranych miRNA skorelowanych z profilem molekularnym choroby, np. mutacji EGFRm.in. 8.

Tutaj opisana jest analiza wybranego panelu korelowanych z NSCLC miRNA8-9, które zostały wyizolowane z egzosomów uwolnionych we krwi pacjentów z NSCLC. Po uzyskaniu raportu o świadomej zgodzie od pacjentów, przeanalizowano osocze 12 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca i 6 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Izolację egzosomu wykonano za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Przed izolacją egzosomów próbki osocza potraktowano RNAzą w celu degradacji krążących zanieczyszczeń miRNA. Zdecydowaliśmy się na wykonanie tej analizy za pomocą komercyjnego zestawu ze względu na ograniczoną standaryzację innych technik (np. ultrawirowania), co jest szczególnie ważne podczas pracy z próbkami klinicznymi. Ten zestaw zawiera leczenie proteinazą K, która degraduje RNAzę, a tym samym zmniejsza ryzyko degradacji egzosomalnych miRNA po lizie egzosomalów. Analizę mikroRNA przeprowadzono za pomocą czułej i specyficznej analizy Real-Time PCR; mir-1228-3p zastosowano jako kontrolę endogenną, a dane znormalizowano zgodnie ze wzorem 2-ΔΔct. Wartości kontrolne są używane jako linia bazowa, a wyniki są przedstawiane w skali logarytmicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja egzosomów

Uwaga: Izolacja egzosomów z próbek osocza została przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta i poprzez dodanie leczenia RNAza: (wszystkie te kroki muszą być wykonane przy użyciu środków ochrony osobistej i środowiska oraz zgodnie z określoną procedurą prawną dotyczącą manipulacji próbkami biologicznymi).

  1. Pobrać 1 ml osocza z każdej próbki, przechowywanej w temperaturze -80 °C, i umieścić ją na lodzie.
  2. Odwirować próbkę o masie 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej; przejście to jest obowiązkowe w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.
  3. Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować nową probówkę o masie 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 100 ng/ml RNAzy do supernatantu i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu degradacji krążących RNA.
  7. Przenieść całe leczone osocze do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 0,5 objętości 1x PBS.
  8. Odwirować próbkę w celu wymieszania roztworów.
  9. Dodać 0,05 objętości roztworu proteinazy K (dołączonego do zestawu) do próbki.
  10. Wzniecić próbkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  11. Dodać 0,2 objętości buforu wytrącającego egzosomy do próbki i wymieszać roztwory przez inwersję.
  12. Inkubować próbkę w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 30 minut, a następnie odwirować próbkę w temperaturze 10 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Odessać i wyrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane egzosomy.
  14. Dodaj wybrany bufor do osadu egzosomu w celu ponownego zawieszenia egzosomów. Dobór bufora zależy od planowanej dalszej analizy, w tym przypadku:
    1. Dodać 100 μl 1x PBS w celu przeprowadzenia analizy TEM.
    2. Dodaj 346,5 μl specyficznego buforu do lizy do ekstrakcji RNA (z zestawu komercyjnego) (UWAGA: zagrożenie chemiczne).
    3. Dodać 100 μl buforu do lizy do ekstrakcji białek (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprotinin 10 μg/ml) w celu przeprowadzenia analizy Western Bloting. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).
  15. Zawieszone egzosomy należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Charakterystyka egzosomów za pomocą analizy Western Blot

Uwaga: W celu scharakteryzowania wyizolowanych nanopęcherzyków, zaleca się western blot z przeciwciałami przeciwko ALIX i TSG101 (dobrze znane markery egzosomalne).

  1. Po ponownym zawieszeniu osadu egzosomu w buforze do lizy należy umieścić go na lodzie na 1 godzinę w celu rozpuszczenia błony egzosomalnej.
  2. Odwirować lizat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki bez naruszania osadu.
  3. Określ ilościowo całkowitą zawartość białka egzosomalnego za pomocą testu Bradforda lub innych metod i załaduj 50 μg białek na studzienkę w żelu Tris/Glycine SDS - 8% poliakrylamidowym. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).
  4. Oddzielić białka (i odpowiedni marker masy cząsteczkowej) w 8% elektroforezie żelowej SDS-PAGE z buforem do biegania (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS) przez 1 godzinę i 30 minut przy 120 V. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).
  5. Przenieść białko do membrany nitrocelulozowej przez elektroblotty z buforem do zimnego transferu o temperaturze 4 °C (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu) przez 1 godzinę przy stałym napięciu 50 V. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).
  6. Zablokuj membranę na 1 godzinę w powolnym mieszaniu z 5% beztłuszczowym suchym mlekiem w 1x TBS -Tween 0,1%.
  7. Umyj membranę 4 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1%.
  8. Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko ALIX i TSG101 (po jednym na błonę) do odpowiedniego buforu (zgodnie z kartą katalogową przeciwciał producenta) i inkubować błonę O/N w powolnym mieszaniu.
  9. Umyj membranę 5 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1% w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
  10. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do odpowiedniego buforu (zgodnie z kartą katalogową przeciwciał producenta) i inkubować błonę przez 1 godzinę w powolnym mieszaniu.
  11. Umyj membranę 5 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1% w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
  12. Wykryj wybrane białko za pomocą analizy chemiluminescencyjnej 11.

3. Charakterystyka egzosomów za pomocą analizy TEM

Uwaga: W celu wizualizacji izolowanych egzosomów przeprowadzono analizę TEM (Transmission Electron Microscopy).

  1. Umieść ~ 10 μg (wcześniej oznaczone ilościowo za pomocą testu Bradforda) próbki nienaruszonych egzosomów zawieszonych w 1x PBS na parafilmie i umieść na próbce kroplę formvar pokrytej węglem siatki niklowej na 1 godzinę.
  2. Umyj kratkę 3 razy, umieszczając ją na trzech kroplach 40 μl 1x PBS.
  3. Umyj kratkę 5 razy, umieszczając ją na pięciu kroplach ultraczystej wody o pojemności 30 μl.
  4. Utrwal próbkę, dodając kroplę 2,5% aldehydu glutarowego (UWAGA: zagrożenie chemiczne) przez 10 minut.
  5. Umyj kratkę 3 razy, umieszczając ją na trzech kroplach 40 μl 1x PBS.
  6. Dodaj kroplę 2% octanu uranylu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i umieść na niej siatkę na 15 minut w celu kontrastu próbki.
  7. Osadź próbkę na kropli 0,13% metylocelulozy (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i 0,4% octanu uranylu i inkubuj siatkę na wierzchu kropli przez 10 minut.
  8. Delikatnie usuń nadmiar płynu papierem absorpcyjnym i susz kratkę przez 5 minut powlekaną stroną do góry.
  9. Zbadaj siatkę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego12.

4. Ekstrakcja i kwantyfikacja egzosomalnego RNA

Uwaga: Zdecydowaliśmy się przeprowadzić całkowitą ekstrakcję RNA z próbek egzosomalnych za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta: (UWAGA: zagrożenia chemiczne, zapoznaj się z protokołem i wytycznymi producenta).

  1. Po ponownym zawieszeniu osadu egzosomu w 346,5 μl buforu do lizy, dodać 3,5 μl β-merkaptoetanolu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i energicznie wirować; to przejście jest obowiązkowe w celu zniszczenia błon lipidowych.
  2. Dodać lizat do kolumny myjącej w probówce zbiorczej i odwirować przy 11 000 × g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić kolumnę i przenieść filtrat do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.
  3. Dodaj 350 μl 70% etanolu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i mieszaj przez wirowanie przez 5 sekund.
  4. Załadować lizat do kolumny rozdzielczej i odwirować przez 30 sekund w temperaturze 8 000 × g. Po odwirowaniu odrzucić przepływający płyn i przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej.
  5. Załadować 350 μl buforu odsalającego i odwirować o stężeniu 11 000 × g przez 1 min. Po odwirowaniu odrzucić przepływowy przepływ i wrzucić kolumnę z powrotem do tej samej probówki zbiorczej.
  6. Dodać 95 μl mieszaniny reakcyjnej DNazy I (10 μl odtworzonej DNazy I + 90 μl buforu DNazy dla każdej próbki) na membranę krzemionkową kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. (UWAGA: zagrożenie chemiczne)
  7. Dodać 200 μl buforu płuczącego (UWAGA: zagrożenie chemiczne) do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 1 min. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej.
  8. Dodać 600 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 1 min. Po odwirowaniu odrzucić przepływ i umieścić kolumnę w tej samej probówce zbiorczej.
  9. Dodać 250 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 2 min. Umieścić kolumnę w probówce o pojemności 1,5 ml bez RNAz.
  10. Eluuj RNA w 40 μl wody wolnej od RNAzy i odwiruj przy 11 000 × g przez 1 minutę, aby uzyskać wysokie stężenie RNA w tej małej objętości.
  11. Natychmiast umieścić eluowany RNA na lodzie, aby zapobiec potencjalnej degradacji lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
  12. Określ ilościowo zawartość RNA. Uwaga: W tym przypadku kwantyzację RNA przeprowadzono przy użyciu 1 μl próbki za pomocą spektrofotometru.

5. Retrotranskrypcja egzosomalnych miRNA

Uwaga: Ze względu na opisaną ograniczoną ilość zawartości miRNA w egzosomach, zdecydowano się przeprowadzić odwrotną transkrypcję wybranych miRNA za pomocą komercyjnego zestawu przy użyciu indywidualnego testu dla każdego miRNA, zgodnie z protokołem producenta. Dla każdej próbki wybrano 8 miRNA skorelowanych ze statusem NSCLC (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222; i miR-1228-3p jako kontrola endogenna).

  1. Przygotuj główny miks z odwrotną transkrypcją (RT mix). Dla każdej reakcji należy przygotować 7 μl mieszanki RT, zgodnie z opisem w Tabela 1 (kliknij tutaj, aby pobrać). (UWAGA: zagrożenie chemiczne)
    Uwaga: W tym eksperymencie dla każdej próbki przygotowano 9 różnych mieszanek RT.
  2. Delikatnie wymieszaj i przechowuj mieszankę RT na lodzie. Dodać 7 μl mieszanki RT na probówkę reakcyjną.
  3. Dodać 5 μl próbki RNA (10 μg całkowitego RNA) do probówki reakcyjnej i delikatnie wymieszać.
  4. Dodaj 3 μl 5x starterów odwrotnej transkrypcji (UWAGA: zagrożenie chemiczne) z każdego zestawu testów do odpowiedniej probówki reakcyjnej.
  5. Mieszaj powoli, zamknij probówkę i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
  6. Załadować rurkę reakcyjną do termocyklera i rozpocząć reakcję odwrotnej transkrypcji, stosując następujące wartości parametrów (UTRZYMAĆ w temperaturze 16 °C przez 30 min; Utrzymać w temperaturze 42 °C przez 30 min; Utrzymać w temperaturze 85 °C przez 5 minut; UTRZYMAĆ ∞ 4 °C).

6. Analiza egzosomalnych miRNA metodą PCR w czasie rzeczywistym

Uwaga: Ta analiza została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu do Real Time PCR (qPCR), z trzema biologicznymi i technicznymi powtórzeniami na próbkę.

  1. Do każdej reakcji należy przygotować 17,67 μl mieszanki Real Time PCR (10 μl PCR Master Mix + 7,67 μl wody wolnej od nukleaz), wymieszać i wyłożyć na lód. (UWAGA: zagrożenie chemiczne)
  2. Dodać 1 μl, na każdą probówkę, 20x starterów qPCR (UWAGA: zagrożenie chemiczne).
  3. Umieścić 18,67 μl mieszanki qPCR w każdej płytce dołka.
  4. Dodać 1,33 μl produktu odwrotnej transkrypcji do odpowiedniej płytki dołkowej.
  5. Zamknij płytkę i zakręć nią (300 g x 5 sek.).
  6. Umieścić płytkę w systemie Real Time PCR i rozpocząć przebieg w następujących warunkach PCR: UTRZYMAĆ w temperaturze 95°C przez 10 minut; 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95°C i 60 sekund w temperaturze 60°C. Przetwarzać i normalizować dane zgodnie ze wzorem 2-ΔΔct 13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przetworzono łącznie 12 próbek osocza od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) oraz 6 próbek od zdrowych osób kontrolnych, wykorzystując komercyjny zestaw do izolacji egzosomów z osocza. Każda próbka została poddana analizie metodą Western Blot w celu oceny markerów egzosomalnych ALIX (96 kDa) i TSG101 (43 kDa). Przykład tych wyników dla 3 próbek przedstawiono w Rysunek 1co wskazuje, że izolacja egzosomów z próbek osocza jest możliwa przy zastosowaniu ninie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzięki temu połączonemu protokołowi możliwe było przeprowadzenie egzosomalnej analizy miRNA z osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Dane te mogą odzwierciedlać stan choroby, ale musi to zostać potwierdzone przez dalsze badania.

Protokół zastosowany w tym artykule został oparty na komercyjnym zestawie do izolacji egzosomów. Powodem było to, że inne znane procedury izolacji (np. ultrawirowanie w gradionym gradiencie gęstości) wymagają więcej procedur ręcznych, co prowadzi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie zostało również sfinansowane przez grant MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 2014.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do całkowitej izolacji egzosomów (z osocza)  Invitrogen4484450Użyj leczenia proteinazą K
Rybonukleaza ASigma-AldrichR4875-100MG
Przeciwciało ALIX (3A9)Sygnalizacja komórkowa2171S
Przeciwciało TSG-101 (C-2)SantaCruz BiotecnologySC-7964 
Przeciw myszom HRP 1 ml   Sygnalizacja komórkowa7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50GE HealthCare25-0500-71
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqmanLife Technologies4366596
has-miR-1228-3p Test mikroRNA TaqManTechnologies002919
has-miR-30b Test mikroRNA TaqManLife Technologies000602
has-miR-30c Test mikroRNA TaqManTechnologies000419
has-miR-122 Test mikroRNA TaqManLife Technologies002245
has-miR-195 Test mikroRNA TaqManLife Technologies000494
has-miR-203 Test mikroRNA TaqManTechnologies000507
has-miR-103 Test mikroRNA TaqManTechnologies
has-miR-221 Test mikroRNA TaqManLife Technologies000524
has-miR-222 Test mikroRNA TaqManLife Technologies002276
TaqMan Universal Master Mix II, bez UNGLife Technologies4440043
Life Life Life Life 000439

Bibliografia

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Egzosomy plazmyanaliza qPCRizolacja egzosomówWestern blotanaliza TEMRT-PCRbiomarkery miRNA
Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.