Artykuł metodologiczny

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53916

⸱

10 maja 2016

 ,  , 
1University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Streszczenie

Zrozumienie procesów rozwojowych na poziomie molekularnym wymaga wglądu w regulację transkrypcji, a tym samym transkryptom, na poziomie poszczególnych typów komórek. Chociaż opisane tutaj metody mają ogólne zastosowanie do szerokiego zakresu gatunków i typów komórek, nasze badania koncentrują się na rozmnażaniu roślin. Uprawa roślin i produkcja nasienna ma kluczowe znaczenie w żywieniu ludzi i zwierząt. Szczegółowe zrozumienie sieci regulacyjnych, które regulują tworzenie się linii rozrodczej (linii rozrodczej) i ostatecznie nasion, jest warunkiem wstępnym ukierunkowanej manipulacji reprodukcją roślin. W szczególności inżynieria apomiksy (rozmnażania bezpłciowego przez nasiona) w roślinach uprawnych obiecuje ogromną poprawę, ponieważ prowadzi do powstania nasion klonalnych, które są genetycznie identyczne z rośliną mateczną. W związku z tym typy komórek żeńskiej linii zarodkowej mają ogromne znaczenie dla zrozumienia i inżynierii apomiksy. Ponieważ jednak odpowiadające im komórki są głęboko osadzone w tkankach kwiatowych, bardzo trudno jest uzyskać do nich dostęp do analiz eksperymentalnych, w tym transkryptomiki specyficznej dla typu komórki. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, skrawki pojedynczych komórek można wyizolować za pomocą mikrodysekcji wspomaganej laserem (LAM). Podczas gdy LAM w połączeniu z profilowaniem transkrypcyjnym umożliwia identyfikację genów i szlaków aktywnych w każdym typie komórki o wysokiej swoistości, ustalenie odpowiedniego protokołu może być trudne. W szczególności jakość RNA uzyskanego po LAM może być zagrożona, zwłaszcza gdy celem są małe, pojedyncze komórki. Aby obejść ten problem, ustaliliśmy przepływ pracy dla LAM, który w sposób powtarzalny zapewnia wysoką jakość RNA, która dobrze nadaje się do transkryptomiki, czego przykładem jest izolacja komórek żeńskiej linii zarodkowej w apomiktycznym Boechera. W protokole tym opisano procedury przygotowania tkanek i LAM, a także w odniesieniu do ekstrakcji RNA i kontroli jakości.

Wprowadzenie

W badaniach transkrypcyjnych przeprowadzanych na poziomie tkankowym, transkryptomy wysoce wyspecjalizowanych, ale rzadkich typów komórek są często maskowane przez liczniejsze otaczające komórki. Przykładem takich wysoce wyspecjalizowanych typów komórek są komórki żeńskiej linii rozrodczej (linii zarodkowej) roślin. Żeńska linia zarodkowa jest określona w rozwijających się zalążkach, prekursorach nasion wewnątrz gynoecium kwiatu 1,2. Komórka macierzysta megaspor (MMC) jest pierwszą komórką żeńskiej linii rozrodczej. Przechodzi mejozę, tworząc tetradę zredukowanych megaspor. Zazwyczaj tylko jedna z tych megaspor przeżywa i dzieli się mitotycznie bez cytokinezy, tj. w syncytium. Po tych mitozach następuje celularyzacja w celu utworzenia dojrzałego gametofitu, który zazwyczaj składa się z czterech typów komórek: trzech antypodali, dwóch komórek synergicznych, komórki jajowej i komórki centralnej. Komórka jajowa i komórki centralne to gamety żeńskie, które są zapładniane przez dwa plemniki podczas podwójnego zapłodnienia, aby dać początek zarodkowi i bielmu rozwijającego się nasienia 1,2. W systemie modelu płciowego Arabidopsis thaliana rozwija się tylko ~ 50 nasion na kwiat, podczas gdy około 50 - 80 nasion rozwija się na kwiat w blisko spokrewnionym rodzaju Boechera. Tak więc żeńska linia zarodkowa składa się tylko z kilku wysoce wyspecjalizowanych typów komórek, co czyni ją doskonałym modelem do badania procesów rozwojowych, takich jak specyfikacja i różnicowanie komórek.

Ponadto, wgląd w procesy regulacji genów rządzący rozmnażaniem roślin może być użyteczny. U roślin może wystąpić zarówno rozmnażanie płciowe, jak i bezpłciowe przez nasiona (apomixis). Podczas gdy rozmnażanie płciowe generuje różnorodność genetyczną w populacji, apomiksa prowadzi do powstania potomstwa klonów, które jest genetycznie identyczne z rośliną mateczną. Dlatego apomixis ma ogromny potencjał do zastosowań w rolnictwie i produkcji nasion, ponieważ nawet złożone genotypy matczyne mogą być utrzymywane w niezmienionym stanie przez kilka pokoleń 3,4,5. Ponieważ apomiksis nie występuje naturalnie w żadnym z głównych gatunków roślin uprawnych, inżynieria apomiksy w uprawach jest bardzo interesująca 3,4,5. Ten długoterminowy cel jest jednak trudny do osiągnięcia, ponieważ genetyczne i molekularne podstawy apomiksy nie są wystarczająco szczegółowo poznane 6.

Aby uzyskać wgląd w podstawy transkrypcji rządzącej rozmnażaniem apomiktycznym, profilowanie transkrypcyjne specyficzne dla typu komórki za pomocą laserowo wspomaganej mikrodysekcji (LAM) i sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stanowi bardzo skuteczne podejście 7,8. LAM został po raz pierwszy opracowany na potrzeby badań na zwierzętach i badań biomedycznych. W ciągu ostatnich kilku lat lam znalazł również zastosowanie w biologii roślin 6,9,10. W przeciwieństwie do innych metod pozwalających na profilowanie poszczególnych typów komórek i tkanek, LAM nie wymaga generowania linii markerowych 6,9,10. Dlatego może być stosowany do dowolnego typu komórki lub tkanki bez wcześniejszej wiedzy molekularnej. Kolejną zaletą LAM jest to, że można go zastosować do dowolnego typu ogniwa, o ile ogniwo można rozpoznać w suchych sekcjach na podstawie położenia i/lub cech strukturalnych. LAM ma dodatkową zaletę, że stosuje się utrwalone tkanki, co zapobiega zmianom profilu transkrypcyjnego podczas przetwarzania.

Tkanka będąca przedmiotem zainteresowania, np. tkanka kwiatowa, jest utrwalana w utrwalaczu bez sieciowania przed zatopieniem w wosku parafinowym. Zatapianie w wosku parafinowym można wykonać ręcznie, zgodnie z ustalonymi protokołami 9,11. Jednak zastosowanie automatycznego procesora tkanek do odwodnienia i infiltracji woskiem na ogół skutkuje wyższą odtwarzalnością pod względem zachowania jakości RNA i morfologii tkanki. Alternatywna strategia zatapiania tkanek w żywicy została również z powodzeniem wykorzystana do analiz specyficznych dla typu komórek za pomocą LAM 8. Jednak użycie automatycznego procesora tkanek do zatapiania w wosku jest bardzo efektywne czasowo, ponieważ wiele próbek może być przetwarzanych jednocześnie, co wymaga minimum czasu pracy. Podczas gdy zazwyczaj nie dochodzi do znaczącej utraty jakości RNA podczas utrwalania i zatapiania, przygotowanie cienkich skrawków za pomocą mikrotomu, a w szczególności montaż na szkiełkach ramowych stosowanych w LAM pozostaje kluczowym krokiem dla zachowania jakości RNA. Zostało to już wcześniej zauważone i opisano użycie systemu transferu taśmowego w celu uzyskania lepszej jakości RNA na tym etapie 12. Jest to jednak dodatkowy czasochłonny etap podczas przygotowywania preparatów, a także wymaga specjalnego sprzętu. Zoptymalizowany protokół opisany poniżej w sposób powtarzalny wytwarza RNA o jakości wystarczającej do profilowania transkrypcji za pomocą GeneCHIPs i metod sekwencjonowania nowej generacji (NGS) 7,11,13,14. Ponadto, przy użyciu mikroskopu laserowego do mikrodysekcji, rutynowo uzyskuje się wysoką czystość izolowanych typów komórek 7,11,13,14.

Rodzaj Boechera jest doskonałym modelowym systemem do badania kluczowych etapów rozmnażania apomiktycznego. U Boechera zidentyfikowano wiele różnych akcesji płciowych i apomiktycznych, które mogą być wykorzystane do analiz porównawczych 15,16,17. Porównując transkryptomy specyficzne dla typu komórki komórek z żeńskiej linii zarodkowej od płciowego rzodkiewnika pospolitego i apomiktycznego Boechera, zidentyfikowaliśmy geny i szlaki, które są różnie wyrażane, identyfikując w ten sposób nowe aspekty procesów regulacyjnych rządzących apomixis 7. Ponadto w badaniu tym zweryfikowano przydatność LAM do analiz transkrypcyjnych małych i rzadkich typów komórek specyficznych dla danego typu komórek. Używaliśmy już tego protokołu do analizy różnych typów komórek u różnych gatunków roślin, ale w niektórych przypadkach mogą być wymagane modyfikacje protokołu specyficzne dla danego gatunku i tkanki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Ten protokół opisuje przygotowanie tkanek, mikrodysekcję wspomaganą laserowo i ekstrakcję RNA w celu profilowania transkrypcji. Zawsze używaj rękawiczek na wszystkich etapach protokołu. Przestudiuj i rozważ instrukcje bezpieczeństwa dla każdej użytej substancji chemicznej. W szczególności należy pamiętać, że ksylol jest szkodliwy i może przenikać przez rękawice oraz że metanol jest toksyczny. W przypadku wszystkich używanych przyrządów należy zapoznać się z instrukcjami obsługi.

1. Usuwanie aktywności RNAzy ze szkła i innych urządzeń

  1. Przed użyciem zawiń wszelkie szklane naczynia w folię aluminiową przed pieczeniem przez ~ 8 godzin w temperaturze 180 °C, aby zapewnić jakość wolną od RNAzy.
  2. Wszelkie powierzchnie metalowe (np. pęseta), a także stół roboczy i płytę grzewczą należy potraktować odpowiednim roztworem do odkażania RNAzą. Następnie umyj powierzchnie wodą wolną od RNAse, aby usunąć roztwór odkażający. Następnie należy dodatkowo oczyścić powierzchnie za pomocą 70% EtOH.
  3. Używaj wszystkich plastikowych materiałów eksploatacyjnych (np. tub) fabrycznie nowych bez żadnej obróbki wstępnej. Jeśli to możliwe, używaj plastikowych materiałów eksploatacyjnych, które są certyfikowane jako wolne od RNAzy.

2. Utrwalenie tkanek

  1. Przygotować 10 ml utrwalacza farmerskiego (3:1; v/v etanol:kwas octowy) w świeżej probówce o pojemności 15 ml na lodzie. (Zawsze przygotuj świeży utrwalacz Farmer's przed użyciem). Jako alternatywę można zastosować niesieciowany utrwalacz etanol:kwas octowy (5:1; v/v) 18.
  2. Użyj cienkiej pęsety, aby zebrać pąki na interesującym nas etapie rozwoju. Natychmiast zanurz pąki w lodowatym utrwalaczu. Użyj 10 ml utrwalacza do utrwalenia ~ 20 pąków lub kwiatów Arabidopsis lub Boechera. Uwaga: W przypadku stosowania gatunków roślin o większych kwiatach zaleca się rozcięcie kwiatów żyletką, aby uzyskać mniejsze kawałki przed utrwaleniem.
    1. W celu uzyskania dojrzałych gametofitów należy wykastrować 2 - 3 największe pąki kwiatowe kwiatostanu na 2 dni przed zbiorem.
  3. Napełnij dno eksykatora lodem. Otwórz probówki zawierające próbki, np. kwiaty, i umieść je na lodzie, albo bezpośrednio wkładając je do lodu w taki sposób, aby nie mogły się przewrócić, albo używając odpowiedniego uchwytu. Infiltrować próżniowo przez 15 minut przed uwolnieniem próżni.
    1. Powtórz infiltrację próżniową raz przez 15 minut.
  4. Zwolnij próżnię i przechowuj przez noc (~ 12 godzin) na lodzie. Przykryj wiaderko z lodem pokrywką lub folią aluminiową i przechowuj wiadro w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C lub lodówce, aby zapobiec rozmrażaniu lodu. Uwaga: Nie zaleca się przedłużania czasu utrwalania.

3. Osadzanie tkanek, cienkie przekroje i montaż na prowadnicach dla LAM

  1. Osadzanie tkanek.
    1. Zamień utrwalacz na 70% etanol przygotowany z czystym etanolem i wodą wolną od RNAzy. Próbki należy pozostawić na lodzie do czasu dalszego przetwarzania. Osadzanie próbek należy rozpocząć tego samego dnia. W przypadku gdy nie jest dostępna żadna maszyna do przetwarzania tkanek, należy przejść do ręcznego zatapiania, jak opisano w innym miejscu 9.11 i kontynuować krok 3.1.11.
    2. Delikatnie przenieś próbki do kaset z zatopieniem tkanek za pomocą pęsety. Mocno zamknij kasety. ETAP KRYTYCZNY: Na tym etapie należy unikać nawet częściowego wysuszenia próbki. Unikaj ściskania próbek pęsetą.
      Uwaga: Do oznaczania kaset należy użyć ołówka, najlepiej pisząc na pochyłej powierzchni kasety.
    3. Przechowuj kasetę do zatapiania załadowaną pąkami lub kwiatami w 70% etanolu, aż cały materiał zostanie przeniesiony do kaset i będzie można załadować maszynę do zatapiania. W tym celu należy użyć szklanej korytki do barwienia wypełnionej 70% etanolem.
    4. Wyjąć kosz rozdrabniacza tkanek z retorty maszyny i przenieść kasety do zatapiania do kosza nachylonymi powierzchniami skierowanymi do góry i w tym samym kierunku. KRYTYCZNY KROK: Wykonaj to szybko, aby zapobiec wysuszeniu tkanek. W przypadku jednoczesnego przetwarzania wielu kaset do zatapiania, przed załadowaniem próbek należy umieścić kosz w odpowiednim pojemniku wolnym od RNAzy wypełnionym 70% etanolem.
    5. Załóż pokrywkę na kosz i włóż kosz z powrotem do retorty. Zamknij retortę.
      Uwaga: Procesor tkanek automatycznie odwadnia próbki, zmienia rozpuszczalnik na ksylol i przeprowadza infiltrację stopionym woskiem parafinowym. Zazwyczaj odbywa się to z dnia na dzień.
    6. Uruchom program procesora tkanek. Zalecane ustawienia standardowe to 1 godzina 70% EtOH, trzy razy 1 godzina 90% EtOH, trzy razy 1 godzina 100% EtOH, dwa razy 1 godzina 100% Xylol, jeden raz 1 godzina 15 min 100% Ksylol w temperaturze pokojowej, a następnie infiltracja woskiem parafinowym dwa razy przez 1 godzinę i jeden raz przez 3 godziny w temperaturze 56 °C 11,
      Uwaga: Aby upewnić się, że stacja blokująca jest gotowa z roztopionym woskiem, włącz maszynę na kilka godzin przed uruchomieniem lub użyj funkcji timera, aby wybrać przybliżony czas rozpoczęcia.
      Uwaga: W przypadku, gdy tkanka nie może być przetworzona natychmiast po zabiegu, możliwe jest wydłużenie czasu inkubacji w wosku parafinowym w temperaturze 56 °C zamiast 3 godzin w temperaturze 56 °C. Zapoznaj się z instrukcją obsługi urządzenia. Zazwyczaj kasety z tkankami automatycznie pozostają w stopionym wosku, dopóki nie zostanie zatwierdzone polecenie "pusta retorta". Jeśli wosk nie zostanie stopiony podczas uruchamiania procesora tkankowego, retorta jest napełniana 70% etanolem, a program pozostaje wstrzymany do momentu rozpoczęcia pracy.
    7. Opróżnić retortę i natychmiast przenieść próbki do łaźni parafinowej w temperaturze 56 °C w stacji blokującej. Zdejmij pokrywkę z kosza i przykryj pokrywką kąpiel parafinową stacji blokującej.
    8. Na powierzchni stacji blokującej nagrzanej do temperatury 56 °C należy ułożyć tyle świeżych tac do wyważania, ile jest kaset w koszu.
      Uwaga: Do oznaczenia dna tac balansujących można użyć markera permanentnego odpornego na etanol. Nie zaleca się stosowania markerów permanentnych odpornych na aceton.
    9. Za pomocą stacji blokującej napełnić wstępnie ogrzaną, świeżą plastikową tackę balansującą stopionym woskiem parafinowym w temperaturze 56 °C. Podnieść pokrywę kąpieli parafinowej, podnieść tylko jedną kasetę na raz i przenieść próbki z kaset do ciekłego wosku parafinowego w temperaturze 56 °C na tacy balansującej za pomocą pęsety.
      KRYTYCZNY KROK: Unikaj twardnienia wosku otaczającego próbkę podczas obsługi kasety, pracując szybko.
      1. Umieść wszystkie próbki zgodnie z potrzebami za pomocą igły do przygotowania przed utwardzeniem wosku. Zazwyczaj kilka kwiatów układa się na tacy do balansowania, indywidualnie rozmieszczonych w odległości około 1 cm w każdym kierunku.
      2. Powtarzać krok 3.1.9 aż do przeniesienia wszystkich próbek.
    10. Umieść kosz z powrotem w procesorze tkanek i wyczyść retortę za pomocą odpowiedniego programu (patrz instrukcja obsługi).
    11. Wyłączyć procesor tkanek i stację blokującą. Przejdź do kroku 3.1.13.
    12. W przypadku, gdy nie jest dostępna maszyna do infiltracji tkanek ani stacja zatapiania, należy użyć pieca grzewczego do stopienia wosku parafinowego w temperaturze 56 °C. Na stole napełnij stopiony wosk plastikowymi tackami do równoważenia, przenieś próbki do wosku i użyj igieł do przygotowania, aby ustawić próbki.
    13. Pozostawić wosk parafinowy do stwardnienia w temperaturze pokojowej przez ~ 1 - 3 godziny przed przechowywaniem próbek w temperaturze 4 °C. Próbki mogą być następnie przetwarzane w stanie świeżym lub przechowywane przez okres do kilku miesięcy.
  2. Przygotowanie cienkich przekrojów i prowadnic do lam.
    1. Na lekkim stole oświetlającym blok wosku od dołu usuń wosk parafinowy wraz z próbkami z otaczających plastikowych tacek. Wytnij kwadratowy blok wosku zawierający tkankę, np. pączek lub kwiat, za pomocą żyletki wolnej od RNA. W tym celu należy zawsze kierować próbki w stronę górnej części bloku wosku (zob. również rysunek 1).
      1. Należy przygotować bloki wosku ze wszystkich próbek, które mają być jednocześnie używane do produkcji MD.
    2. Zamontuj bloki do obróbki kaset do zatapiania wypełnionych utwardzonym woskiem parafinowym: rozpuść mały kawałek lub kroplę wosku parafinowego na końcówce odpowiedniej szpatułki za pomocą lampy etanolowej i użyj gorącego wosku do przymocowania bloku na podłożu (z osadzonymi tkankami na górze).
      1. Pozostawić wosk do stwardnienia przez co najmniej 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń nadmiar wosku otaczającego próbkę za pomocą żyletki na stole oświetleniowym. Upewnij się, że zachowasz kwadratową powierzchnię z równoległymi krawędziami (patrz Rysunek 1).
    4. Ustaw płytę grzewczą na 42 °C.
    5. Bezpiecznie zamocuj próbki na mikrotomie i przygotuj skrawki o grubości 6 - 10 μm. Zapoznaj się z instrukcją producenta dotyczącą korzystania z mikrotomu. Uwaga: Podczas gdy cieńsze sekcje często dają lepszą rozdzielczość strukturalną, większą ilość RNA o wyższej jakości można uzyskać przy grubszych sekcjach. Dla komórek dojrzałych gametofitów Boechera domyślnie używamy 7 μm. Poruszanie się raczej wolno z próbkami nad nożem do mikrotomów często skutkuje lepszą histologią.
    6. Wstążki parafinowe o długości około 10 - 15 cm należy zawsze przenieść do plastikowego pudełka z czarnym kartonem na dole przed umieszczeniem ich w szkiełkach LAM.
    7. Jeśli to możliwe, należy wstępnie wybrać części pasków parafinowych zawierających interesujące nas typy komórek lub tkanek, np. zalążki, pod lunetą preparacyjną, a resztę odrzucić.
  3. Przygotowanie preparatów do LAM.
    1. Umieść wymaganą ilość szkiełek z metalową ramą (zwykle 5 - 10) płaską powierzchnią na górze na płycie grzewczej.
    2. Odpipetować ~ 1 - 2 ml wody wolnej od RNAzy na plastikową część szkiełka. Za pomocą żyletki pokrój wstążki parafinowe na krótkie kawałki o długości około 4 - 5 cm, wystarczające do pokrycia plastikowych okien. Użyj pęsety i igły do przygotowania, aby idealnie ułożyć paski parafiny równolegle do siebie na plastikowych okienkach szkiełek. Ostrożnie podnieś szkiełko na jednym końcu, aby usunąć wodę i umieść szkiełka z powrotem.
      1. Alternatywnie umieść płytę grzewczą pod okapem chemicznym. Nałóż niewielką ilość metanolu na plastikową część szkiełka, wystarczającą do zwilżenia powierzchni (może to spowodować lekkie pofałdowanie szkiełek). Umieść paski parafiny na szkiełkach.
        Uwaga: Ze względu na toksyczność należy unikać stosowania metanolu, jeśli to możliwe. Jednak użycie metanolu na tym etapie poprawia jakość RNA w przypadku, gdy jakość osiągnięta przez montaż na wodzie nie jest wystarczająca. Warto przetestować te alternatywy na początku nowego projektu, ponieważ osiągnięta jakość RNA różni się w zależności od typu komórki i gatunku badanego.
    3. Szkiełka suszyć przez noc na płycie grzewczej w temperaturze 42 °C przez ~ 12 godzin. Przykryj płytę grzewczą plastikową pokrywką, która nie dotyka szkiełek. Upewnij się, że plastikowa pokrywa nie uniemożliwia wymiany powietrza. W tym celu pokrywę można umieścić na pudełkach z pipetami lub podobnymi elementami, które można podnieść.
      1. Alternatywnie skróć czas schnięcia do minimum dwóch godzin lub do momentu, gdy tkanka będzie wydawała się całkowicie sucha. Skrócenie czasu od krojenia do pobrania może poprawić jakość RNA.
    4. Pod kapturem chemicznym odwoskuj szkiełka 2 razy przez 10 minut w ksylolu za pomocą odpowiednich uchwytów do szkiełek. Upewnij się, że całkowicie zanurzasz plastikową część każdej prowadnicy, ale aby umożliwić wyjęcie suwaka poprzez dotknięcie szerszego końca metalowej ramy, która jest sucha.
    5. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na ~ 10 minut pod kapturem chemicznym przed LAM.
      Uwaga: Preparaty, które nie zostały natychmiast poddane obróbce, można umieścić z powrotem na płycie grzewczej w temperaturze 42 °C chusteczką skierowaną do góry na okres do kilku godzin. Zapobiegnie to pogorszeniu jakości RNA przez wilgoć do czasu dalszego przetwarzania.

4. Mikrodysekcja wspomagana laserem (LAM)

Uwaga: Procedura w przypadku lam będzie się różnić w zależności od zastosowanego instrumentu. Niektóre szczegóły tego protokołu są dostosowane do konkretnego instrumentu i technologii pobierania próbek na nasadce z wykorzystaniem sił elektrostatycznych. Ponadto szczegóły mogą się różnić nawet w zależności od wersji oprogramowania. Proszę zapoznać się z instrukcjami producenta i podręcznikami użytkownika, aby uzyskać szczegółowy opis i szczegółowe instrukcje dotyczące przyrządu i oprogramowania.

  1. Włącz urządzenia do LAM (komputer, mikroskop, skrzynka sterownicza lasera).
  2. Uruchom program, sterując mikroskopem i laserem.
  3. Włącz laser, naciskając odpowiedni przycisk na skrzynce sterowniczej.
  4. Umieść nasadkę (0,5 ml, bez dyfuzora) w uchwycie nasadki i umieść ją w instrumencie.
  5. Podeprzyj szkiełko do lamu szkiełkiem podstawowym do mikroskopii. Upewnij się, że płaska powierzchnia szkiełka z przymocowaną chusteczką jest skierowana w stronę szkiełka
    6. podstawowego.
  6. Umieść szkiełko w instrumencie z szkiełkiem pod spodem.
  7. Wybierz obiektyw 4X. W programie wybierz, aby przesunąć nasadkę do pozycji "góra" i przystąp do wykonania skanowania szkiełka.
  8. Przeszukaj slajd i zidentyfikuj interesujące Cię struktury. Wskaż i zapisz ich pozycje na suwaku, aby móc powrócić do dokładnej pozycji dla kroku cięcia.
  9. Wybierz odpowiedni obiektyw (np. 40X lub 60X).
  10. W razie potrzeby dostosuj prędkość lasera, ostrość i moc lasera, a także skalibruj stage ruch, odwołując się do instrukcji obsługi instrumentu. Po skonfigurowaniu konta dla określonej tkanki, która Cię interesuje, ustawienia mogą być ponownie użyte.
  11. Sprawdź pozycję lasera za pomocą pojedynczego strzału, naciskając przycisk "strzał laserowy" programu, najlepiej w części membrany bez tkanki.
    1. W razie potrzeby skalibruj pozycję lasera, postępując zgodnie z instrukcjami producenta przyrządu.
  12. Sprawdź kalibrację obiektywu, przesuwając oczywistą strukturę do wszystkich czterech rogów okna oprogramowania na monitorze, trzymając wciśnięty prawy przycisk myszy. Sprawdź, czy pozycja ręki w stosunku do oczywistej struktury jest taka sama we wszystkich czterech rogach. W przeciwnym razie skalibruj obiektywy zgodnie z instrukcją oprogramowania.
  13. Trzymając nasadkę w pozycji "dół", użyj narzędzia "pióro ręczne", aby zaznaczyć granice typu komórki lub tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, np. komórki jajowej. Przeanalizuj interesującą Cię komórkę za pomocą lasera, naciskając "wytnij". Uwaga: Często sekcje należy powtórzyć, jeśli obramowanie wokół komórki nie zostało całkowicie wycięte od razu. W takim przypadku zaleca się ustawienie oprogramowania tak, aby standardowo automatycznie wykonywało dwa powtórzenia sekcji.
  14. Podnieś nasadkę i przejdź do następnej zapisanej pozycji z interesującą Cię strukturą. Powtórz krok 4.13 procedury, aby przeanalizować kolejne sekcje komórek, aż wszystkie interesujące Cię komórki z jednego slajdu zostaną zebrane. Upewnij się, że nasadka jest umieszczona w taki sposób, aby nowa sekcja przylegała do pustej pozycji na nasadce.
    Uwaga: Zaleca się izolowanie większych fragmentów tkanek (np. skrawków całych kwiatów lub ich części) z każdego szkiełka po wyizolowaniu pojedynczych odcinków komórek na świeżej czapeczce. Można je wykorzystać do kontroli jakości RNA.
  15. Wyjmij slajd i kontynuuj do następnego slajdu, powtarzając kroki 4.4 - 4.9 i 4.13 do 4.14.
  16. Powtarzaj krok 4.15 i kroki pokrewne, aż interesujące Cię typy komórek ze wszystkich slajdów zostaną odizolowane. Uwaga: Nie zaleca się zbioru dłuższego niż ~ 4 - 5 godzin na tej samej nasadce.
  17. Należy przeprowadzić wizualną kontrolę powierzchni nasadki po MD, aby wykluczyć niespecyficzne zanieczyszczenia próbki. Podczas gdy niewypreparowane tkanki są chronione folią, kurz może przywierać do powierzchni z powodu przyczepności elektrostatycznej.
    1. Aby sprawdzić wzrokowo nasadkę, zdejmij suwak z instrumentu. Umieść uchwyt nasadki w pozycji "dolnej" i sprawdź powierzchnię za pomocą obiektywu 4X.
    2. W przypadku widocznych małych drobinek kurzu, należy je usunąć małą końcówką do pipety (2 μl). Alternatywnie, zamontuj szkiełko z powrotem na instrumencie, umieść nasadkę na wolnej części szkiełka (bez chusteczek) i całkowicie zniszcz zanieczyszczenie za pomocą lasera.
  18. Zamknij nakrętki i zamroź suche sekcje w temperaturze -80 °C do dalszego użycia. W razie potrzeby próbki można przechowywać przez okres do kilku tygodni. Zaleca się jednak szybkie postępowanie na tym etapie.

5. Izolacja RNA i kontrola jakości

Uwaga: RNA można wyizolować dowolną metodą odpowiednią dla małych ilości RNA. W niniejszym protokole opisano użycie zestawu do izolacji RNA określonego dla niewielkich ilości RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Probówki z próbką należy stosować bezpośrednio lub po wyjęciu z temperatury -80 °C.
    1. Otwórz probówki i ostrożnie odpipetuj 11 μl buforu ekstrakcyjnego na ściankę każdej probówki za pomocą końcówek filtrujących. Zmieniaj końcówki między próbkami.
    2. Zamknąć pokrywę i potrząsnąć buforem ekstrakcyjnym aż do nasadki probówki.
    3. Umieścić probówki nakrętką do dołu w piecu grzewczym nagrzanym do 42 °C. Inkubować przez 30 minut zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania kolumny i zbierania ekstraktu na dnie probówek.
    1. Jeżeli materiał z więcej niż jednej nasadki musi zostać połączony w jedną próbkę, należy postępować zgodnie z krokami 5.1.1 - 5.1.2 indywidualnie dla każdej probówki/nasadki.
    2. Następnie zebrać ekstrakty dla jednej próbki w jednej probówce i zmierzyć ilość połączonego ekstraktu za pomocą pipety przed dodaniem równoważnej ilości EtOH (patrz instrukcje producenta).
    3. Upewnij się, że ilość EtOH dodana przed załadowaniem kolumny jest równa objętości zbiorczego ekstraktu.
    4. Po wytrąceniu RNA za pomocą EtOH należy szybko przystąpić do załadunku kolumn zgodnie z instrukcjami producenta. Kontynuuj protokół z etapem wirowania 100 x g.
    5. Po przepuszczeniu zawartości każdej probówki zbiorczej przez kolumnę, należy przeprowadzić etap wirowania 16 000 x g przez 30 sekund, aby usunąć przepływ zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Kontynuuj ekstrakcję i oczyszczanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Po załadowaniu buforu elucyjnego do kolumny należy pozostawić kolumnę do inkubacji przez 1 minutę. Kontynuować ładowanie probówek do wirówki, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Dodatkowy etap wirowania przez 1 minutę przy 100 x g przed elucją, jak wskazano w protokole, może zwiększyć skuteczność elucji.
  3. Ekstrahować RNA z próbek kontrolnych (większe skrawki tkanek) w celu kontroli jakości RNA zgodnie z krokami od 5.1 do 5.2.7 niniejszego protokołu.
  4. W przypadku kontroli jakości RNA: załadować 1 μl nierozcieńczonego całkowitego RNA z każdej próbki kontrolnej na bioanalizatorze przy użyciu chipa Pico RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    Uwaga: Wyekstrahowany RNA można wykorzystać do amplifikacji liniowej i analizy transkryptomu przy użyciu mikromacierzy lub RNA-Seq 7,11,13,14. Idealnie byłoby, gdyby kontrola jakości wskazywała numer integralności RNA (RIN) wynoszący co najmniej 7. Wielu dostawców zapewnia odpowiednie zestawy do amplifikacji, odpowiednie przykłady podano w 9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie próbki oraz LAM są wykonywane w kolejnych etapach

Przygotowanie RNA do analizy transkrypcyjnej z wybranych typów komórek metodą LAM wymaga przeprowadzenia szeregu następujących po sobie etapów (Rysunek 1). Proces ten rozpoczyna się od zbioru kwiatów i natychmiastowej fiksacji, aby zapewnić niezmienność populacji RNA po zbiorze. Tkanka zostaje zatopiona, pocięta na sekcje i przenies...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół jest odpowiedni dla różnych typów komórek i tkanek

LAM w połączeniu z analizami transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub RNA-Seq jest cennym narzędziem do uzyskania wglądu w specyficzne wzorce aktywności genów regulujących procesy rozwojowe lub fizjologiczne 7-11,13,14. Jednak przydatność tej metody dla danego typu ogniwa jest krytycznie zależna od kwestii strukturalnych. Komórka musi być wyraźnie widoczna i jednoznacznie rozpoznawalna w suchych sekcjach w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Timothy'emu F. Sharbelowi (IPK Gatersleben) za dostarczenie nasion Boechera divaricarpa oraz Sharon Kessler (University of Oklahoma) za krytyczną lekturę i korektę. Prace nad analizami transkryptomu specyficznego dla typu komórki w celu zbadania rozwoju gametofitów i apomiksy w laboratorium UG są wspierane przez Uniwersytet w Zurychu, stypendium "Deutsche Forschungsgemeinschaft" i projekt Marie Curie IDEAGENA to AS, przez granty ze "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" w ramach działania COST FA0903 (dla UG i AS) oraz Szwajcarskiej Fundacji Narodowej (dla UG

).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EtanolVWR1 009 861 000absolutny EMPROVE Ph Eur, BP, USP
15 ml probówki wirówkowe falconVWR62406-200
2100 BioanalizatorAgilentG2939AA
Kwas octowyApplichemA3686,2500100% klasa biologii molekularnej
Ambion Technologie życia wodnego wolne od nukleazAM9932
ASP200 S S14048043624Leica 
kartonmożna kupić w specjalnych sklepach papierniczych
Wolne od DNA i RNAse Frame SlidesMicro Dissect GmbH1, 4 i micro; m Membrana PET; można również kupić w Leica
Dumond KleszczeActimed0208-5SPSF-PS
eksycykatordo
etanolowych
końcówki filtrujące 10  &mikro; lAxon Lab AGAL60010można zastąpić podobnymi końcówkami
filtrującymi 1 000  &mikro; lAxon Lab AGAL60010można zastąpić podobnymi końcówkami
filtrującymi 20  &mikro; lAxon Lab AGAL60020można zastąpić podobnymi końcówkami
filtrującymi 200  &mikro; lAxon Lab AGAL60200można zastąpić podobnymi końcówkami
kleszcze precyzyjneVWE232-1221
uchwyt do szkiełek do szkiełHuber & Co.AG10.0540.01Fä rbekä sten nach Szklana
witrażaHuber & Co.AG10.0570.01Fä rbekasten
Podgrzewany moduł do zatapiania parafiny Stacja blokująca LeicaLeica LeicaEG 1150 H, odpowiednie są podobne urządzenia
Stół grzewczy i suszącyMedax15501inne modele i/lub dostawcy są odpowiednie
Wiadro nalód VWR z pokrywką 10146-184podobne wiadra równie odpowiedni
stół oświetleniowyUVP An Analytical Jena CompanyTW-26 transluminator światła białego
szkiełko mikroskopoweThermo Scientific10143562CEkrawędzie tnące
ostrze mikrotomuThermo ScientificFEAHS35S35 jednorazowe ostrze mikrotomu
MMI Cell Cut Plus MMI(Molecular Machines and Industries)
Nieprzywierające, wolne od RNA probówki do mikrofuge, technologie 2 mlLifeAM12475
Paraplast X-TRARothX882.2do histologii
Zestaw do izolacji RNA PicoPure TechnologieżyciaKIT0204Arcturus Zestaw do izolacji RNA PicoPure
plastikowe tace do równoważeniaSemadeni AG2513
plastikowe pudełkoSemadeni AG2971Plastikdose PS plastikowa
pokrywka do płytydomowa
igła do przygotowaniaVWR631-7159
RNA 6000 Zestaw PicoAgilent5067-1513
Probówki do mikrofug bez RNAtechnologie życiaAM12400
Technologie dekontaminacji RNAz ZAP Technologie żywotności roztworuAM9780
Półautomatyczny mikrotom obrotowy Podobne urządzenia LeicaRM2245są równie odpowiednie
Kasety ekranowe Tissue Loc HistoThermo ScientificC-1000_AQodpowiednie są podobne kasety innych dostawców
Probówki z samoprzylepną pokrywą, bez dyfuzora 500 i mikro; l MMI (Maszyny i Przemysł Molekularny)50204
Ksylol (Isomere) ROTIPURANVWR4436.2min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
proces zatapiania KasetyLeica14039440000Kaseta Leica Jet I bez pokrywy
Piekarnik uniwersalnyMemmertUF55inne modele i/lub dostawcy są odpowiednie
procesor tkanek lamp Sigma-Aldrich Z354074-1EA Nalgene Vaccuum Ekssykator lub podobny sprzęt Hellendahl grzewczej

Bibliografia

  1. Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
  3. Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
  4. Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
  5. Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
  6. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
  7. Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476(2014).
  8. Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
  9. Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
  10. Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
  11. Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
  12. Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
  13. Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).
  14. Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685(2012).
  15. Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
  16. Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
  17. Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
  18. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
  19. Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozmna anie ro line ska linia zarodkowaekstrakcja RNAprzygotowanie tkanekizolacja kom rekgatunki Boecheraanaliza kom rek jajowychbadania nad apomiksj

Powiązane artykuły