Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53942

⸱

24 marca 2016

 ,  , 
1W. M. Keck FTMS Laboratory for Human Health Research, Department of Chemistry, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Streszczenie

Źródła jonizacji otoczenia dla spektrometrii mas (MS) były przedmiotem dużego zainteresowania w ciągu ostatniej dekady. Przykładem takich metod jest jonizacja elektronatryskowa wspomagana desorpcją laserową (MALDESI), w której łączą się cechy desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI) (np. pulsacyjny charakter desorpcji) i jonizacji elektrorozpylania (ESI) (np. miękka jonizacja). Jedną z głównych zalet MALDESI jest jego nieodłączna wszechstronność. W eksperymentach MALDESI laser ultrafioletowy (UV) lub podczerwony (IR) może być używany do rezonansowego wzbudzania endogennej lub egzogennej matrycy. Wybór matrycy nie jest zależny od analitu i zależy wyłącznie od długości fali lasera użytej do wzbudzenia. W eksperymentach IR-MALDESI cienka warstwa lodu osadza się na powierzchni próbki jako matryca pochłaniająca energię. Geometria źródła IR-MALDESI została zoptymalizowana przy użyciu statystycznego projektowania eksperymentów (DOE) do analizy próbek cieczy, a także próbek tkanek biologicznych. Ponadto opracowano solidne źródło obrazowania IR-MALDESI, w którym przestrajalny laser w średniej podczerwieni jest zsynchronizowany ze sterowanym komputerowo stolikiem translacyjnym XY i spektrometrem masowym o wysokiej zdolności rozdzielczej. Niestandardowy graficzny interfejs użytkownika (GUI) umożliwia użytkownikowi wybór częstotliwości powtarzania lasera, liczby strzałów na woksel, rozmiaru kroku stolika próbki oraz opóźnienia między zdarzeniami desorpcji i skanowania dla źródła. IR-MALDESI jest używany w różnych zastosowaniach, takich jak analiza kryminalistyczna włókien i barwników oraz MSI sekcji tkanek biologicznych. Za pomocą tej techniki można zmierzyć i określić ilościowo rozmieszczenie różnych analitów, od endogennych metabolitów po egzogenne ksenobiotyki w skrawkach tkanki. Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie opisuje główne kroki niezbędne do przeprowadzenia IR-MALDESI MSI w przekrojach tkanek całego ciała.

Wprowadzenie

Obrazowanie spektrometrią mas (MSI) w trybie mikrosondy polega na desorpcji próbki z powierzchni za pomocą wiązki (lasera lub jonów) w dyskretnych miejscach nad powierzchnią próbki. W każdym punkcie rastra generowane jest widmo masowe, a uzyskane widma, wraz z lokalizacją przestrzenną, z której zostały zebrane, mogą być wykorzystane do jednoczesnego mapowania wielu analitów w próbce. Ten bezznacznikowy sposób obrazowania w połączeniu z czułością i swoistością spektrometrii mas pomógł MSI stać się jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin spektrometrii mas1,2.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) jest najpowszechniejszą metodą jonizacji używaną do analiz MSI. Jednak potrzeba matrycy organicznej i wymagania MALDI dotyczące próżni stwarzają znaczne ograniczenia w odtwarzalności, przepustowości próbek i typach próbek, które można analizować za pomocą tej metody. W ostatnich latach opracowano szereg metod jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (AP) w celu obejścia tych ograniczeń3. Te metody jonizacji otoczenia pozwalają na analizę próbek biologicznych w środowisku, które jest znacznie bliższe ich naturalnemu stanowi i upraszczają etapy przygotowania próbki przed analizą. Przykładem takiej metody jonizacji elektrorozpylania wspomaganej desorpcją laserową (MALDESI) jest4,5.

W eksperymentach IR-MALDESI, cienka warstwa lodu jest osadzana na powierzchni tkanki jako matryca pochłaniająca energię. Impuls laserowy w średniej podczerwieni jest pochłaniany przez matrycę lodową i ułatwia desorpcję neutralnych materiałów z powierzchni poprzez rezonansowe wzbudzanie trybu rozciągania O-H wody. Desorbowane neutralne rozdzielają się na naładowane kropelki ortogonalnego elektrosprayu i są poddawane postjonizacji w sposób podobny do ESI4-6. Dodanie egzogennej matrycy lodowej jest preferowane w porównaniu z poleganiem wyłącznie na endogennej wodzie w tkance, ponieważ pomaga uwzględnić zmiany zawartości wody w różnych przedziałach tkankowych i wykazano, że zwiększa desorpcję6 i poprawia obfitość jonów o ~ 15-krotnie7,8 w eksperymentach obrazowania tkanek.

W tej pracy wykorzystujemy IR-MALDESI MSI do wywołania rozkładu metabolitów w różnych narządach w całym ciele noworodka myszy. Przedstawiono przegląd regulowanych parametrów źródła IR-MALDESI oraz zademonstrowano kroki niezbędne do pomyślnego obrazowania wycinków tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Poniższy protokół opisuje wszystkie niezbędne kroki do przeprowadzenia eksperymentów IR-MALDESI MSI. Szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanej geometrii źródła IR-MALDESI oraz jego synchronizacji z laserem, stolikiem i spektrometrem mas można znaleźć w innych opracowaniach5,6. Próbki tkanek zwierzęcych wykorzystane w niniejszym protokole zostały pobrane zgodnie z regulacjami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz North Carolina State University.

1. Przygotowanie tkanki

  1. Przygotuj kąpiel z izopentanu i suchego lodu, wlewając około 20 ml izopentanu do czystego zlewka umieszczonego w zewnętrznym pojemniku z suchym lodem pod wyciągiem. Podczas pracy z kąpielą z izopentanu i suchego lodu oraz z tkanką należy przez cały czas stosować rękawice ochronne i okulary ochronne.
    1. Uśmierć dwudniowego całego noworodka myszy poprzez przedawkowanie Avertinu (7,5 mg/g masy ciała), a następnie zamroź tkankę w kąpieli z izopentanu i suchego lodu, aby zachować strukturę tkanki. Użyj wcześniej oczyszczonej pęsety, aby umieścić i wyjąć noworodka myszy w formie kriogenicznej z kąpieli z izopentanu i suchego lodu. Przechowuj błyskawicznie zamrożoną tkankę w temperaturze -80 °C do momentu analizy.
  2. W użyciu rękawic ochronnych nałóż warstwę medium montującego OCT (optimal cutting temperature) na 40 mm dysk do preparatów w kriostacie. Delikatnie umieść zamrożoną mysz w całości na pokrytym OCT uchwycie do preparatów, aby przymocować zwierzę do dysku w orientacji pożądanej dla sekcjonowania.
    Uwaga: OCT jest wykorzystywane wyłącznie do przytwierdzenia tkanki do krążka z próbką w celu wykonania skrawków. Nie należy całkowicie zatapiać tkanki w OCT i należy unikać jego nadmiaru, ponieważ wiadomo, że OCT wywiera niekorzystny wpływ na analizę MSI. Do krioembeddingu tkanki przed jej pocięciem można użyć innych mediów, takich jak żelatyna.9.
  3. Umieść dysk (z OCT i sekcją tkanki) na uchwycie próbek Peltiera w kriosztacie i naciśnij przycisk zasilania Peltiera. Odczekaj 10 minut, aż próbka osiągnie równowagę termiczną.
  4. Umieść dysk z próbkami (z zamocowaną na nim tkanką) w uchwycie dysku, kierując tkanką w dół w stronę płaszczyzny przeznaczonej do analizy. Przetnij tkankę na sekcje o żądanej grubości w temperaturze -20 °C przy użyciu mikrotomu obrotowego znajdującego się wewnątrz kriosztatu10.
    Uwaga: W przypadku analiz całego ciała należy pokroić tkankę na 25-μm-grube przekroje w celu zachowania integralności tkanki. W przypadku mniejszych obszarów (np., wątroba, mózg, nerka), pokroić tkankę na 10-μm-przekroje grube.
    1. Użyj płytki antyrolującej, aby zapobiec zwijaniu się wyciętego skrawka tkanki. Do usunięcia niepożądanych resztek tkanki użyj węża próżniowego i szczotek dostępnych w kriostacie. Po zakończeniu krojenia tkanki załóż osłonę, aby zabezpieczyć ostrze mikrotomu i uniknąć obrażeń ciała.
  5. Zorientuj przekrój myszy na płytce do preparatów, a następnie zamontuj go na uprzednio oczyszczonym szkiełku przedmiotowym poprzez rozmrożenie, zbliżając szkiełko tak blisko jak to możliwe do przekroju tkanki, tak aby go nie dotknąć.10.
    Uwaga: w przypadku ilościowych eksperymentów MSI, przed montowaniem tkanki należy pokryć slajd standardem wewnętrznym za pomocą zautomatyzowanego natryskiwacza pneumatycznego, a następnie zamontować rozmrożony przekrój tkanki na pokrytym slajdzie11.
  6. Usuń ostrze mikrotomu użyte do krojenia tkanki za pomocą wysuwnika ostrza, a następnie bezpiecznie wyrzuć je do odpowiedniego pojemnika na odpady ostre.
  7. Przechowywać szkiełko wewnątrz kriotomatu aż do kroku 3.2, aby utrzymać krioterapijną konserwację tkanki.

2. Przygotowanie/Kalibracja IR-MALDESI

  1. Włącz laser średniej podczerwieni (mid-IR) i uruchom aplikację sterującą laserem na komputerze. Wybierz pożądaną długość fali za pomocą aplikacji sterującej dostarczonej przez producenta. Eksperymenty IR-MALDESI są zazwyczaj przeprowadzane przy 2 940 nm.
    Uwaga: Niedawne badania nad zależnością długości fal laserowych mid-IR od matrycy lodowej wykazały różnice, które wydają się być specyficzne dla analizowanego związku8.
  2. Włącz sterownik stolika, uruchom niestandardowy program sterowania użytkownika (RASTIR) i skalibruj pozycję stolika za pomocą przycisku home.
  3. Przygotuj roztwór do elektrorsyju. Zazwyczaj jako rozpuszczalnik do elektrorsyju w trybie jonów dodatnich stosuje się mieszaninę metanolu i wody w stosunku 50:50 (v/v) z dodatkiem 0,2% kwasu mrówkowego. Dobierz skład rozpuszczalnika do elektrorsyju zgodnie z eksperymentem. Na przykład w zastosowaniach obrazowania w trybie jonów ujemnych stosuj 5 mM wodorotlenku amonu jako modyfikator elektrorsyju.
    Uwaga: W przypadku MSI IR-MALDESI z przełączaniem polarności stosuj 1 mM kwasu octowego jako modyfikator. Stwierdzono, że modyfikator ten jest optymalny dla uzyskania stabilnego i powtarzalnego sygnału zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych12.
  4. Napełnij strzykawkę 1 ml rozpuszczalnikiem do elektrorsyju i przemyj kapilarę krzemionkową nowym rozpuszczalnikiem.
  5. Ustaw emitery ESI w jednej osi z wlotem MS, korzystając z parametrów źródła, takich jak odległość ESI-spot, odległość spot-inlet, wysokość próbki oraz szybkość przepływu rozpuszczalnika, które zostały zoptymalizowane za pomocą statystycznego DOE dla analizy przekrojów tkanek6. Uwaga: Patrz Rysunek 1 w celu zapoznania się ze schematem przedstawiającym te parametry oraz zoptymalizowane wartości dla MSI przekrojów tkanek.
  6. Uruchom elektrorsyj i oceń jego stabilność (>10 min), monitorując całkowity prąd jonowy (TIC), który w tym momencie składa się wyłącznie ze związków pochodzenia zewnętrznego. Zazwyczaj zmienność TIC <10% w ciągu 10-15 min jest dobrym wskaźnikiem stabilności.

Proces jonizacji przez rozpylanie elektrosprayowe; schemat z parametrami ESI dla obrazowania tkanek; przepływ rozpuszczalnika.
Rysunek 1. Schemat i parametry IR-MALDESI. (ASchemat konfiguracji źródła IR-MALDESI (nie w skali) oraz parametry regulowane.B) Zoptymalizowane wartości parametrów do obrazowania skrawków tkanek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Nakładanie matrycy lodowej

  1. Uwaga: Wyłącz elektrospray przed umieszczeniem próbki na stoliku.
  2. Umieść rozmrożoną tkankę na płytce do próbek IR-MALDESI w polu widzenia kamery.
  3. Upewnij się, że dłonie nie znajdują się w pobliżu emitera ESI, a następnie ponownie uruchom elektrospray.
  4. Zamknij drzwiczki dostępu do źródła IR-MALDESI i przepłucz obudowę suchym azotem, aby zapobiec kondensacji wody na powierzchni tkanki. Gdy wilgotność względna wewnątrz obudowy spadnie poniżej <3%, włącz zasilacz DC (~12 V) płytki Peltiera, która schłodzi płytkę z próbką. Uwaga: Proces chłodzenia w stoliku chłodzonym elementem Peltiera jest szczegółowo omówiony w innym opracowaniu13.
  5. Schłodź stolik do -9 °C i poczekaj, aż zamocowana tkanka osiągnie równowagę termiczną (~5-10 min).
  6. Zatrzymaj przepływ azotu i wystaw tkankę na działanie wilgotności względnej otoczenia, otwierając drzwiczki dostępu do źródła. Na zimnej powierzchni stolika Peltiera i zamocowanym przekroju tkanki osadzi się cienka warstwa lodu w wyniku desublimacji wody z powietrza.
    Uwaga: Jeśli wilgotność względna w laboratorium jest niższa niż 10-15%, umieść wewnątrz obudowy zlewkę z ciepłą wodą, aby ułatwić formowanie się lodowej warstwy matrycy.
  7. Po sformowaniu lodowej warstwy matrycy zamknij drzwiczki dostępu i ponownie uruchom przepływ suchego azotu, aby zredukować wilgotność względną do 10±2%. Dostosuj szybkość przepływu azotu tak, aby utrzymać wilgotność względną na tym poziomie, co empirycznie uznano za punkt równowagi między tworzeniem się lodu a sublimacją, pozwalający na utrzymanie stałej warstwy lodu przez cały czas trwania eksperymentu6.

4. Akwizycja danych obrazowania spektrometrią mas

  1. Korzystając z interfejsu graficznego RASTIR (Rysunek 2), przesuń stolik do pozycji analizy, klikając przycisk „LASER position”. Użyj diody regulacyjnej lasera, aby upewnić się, że ablacja nastąpi w obszarze poza tkanką. Wystrzel impuls lasera w obszarze poza tkanką, aby skalibrować przesunięcie lasera względem obrazu z kamery. Kliknij przycisk „Laser Test Fire”, aby zaktualizować pozycję lasera.
  2. Powróć do „CAMERA position” i zaktualizuj pozycję lasera w RASTIR, umieszczając celownik wyrównania lasera na punkcie ablacji laserowej (Rysunek 2-1).
  3. Kliknij przycisk obszaru zainteresowania (ROI) i dostosuj rozmiar oraz pozycję ROI dla analizowanego przekroju tkanki (Rysunek 2-2). Wprowadź odpowiednie parametry eksperymentalne, takie jak wielkość kroku w kierunkach X i Y (w mm) (Rysunek 2-3), oraz nazwij plik MSI w polu „Project Name” (Rysunek 2-4).
    1. Podczas wyznaczania ROI uwzględnij fragment poza tkanką, który posłuży jako kontrola. Wykorzystaj ten obszar poza tkanką do wyboru pików (Krok 5.4).
      Uwaga: Średnica desorpcji (rozmiar punktu) lasera na tkance wynosi około 150 µm; jednak wyższą rozdzielczość przestrzenną można uzyskać stosując metodę nadpróbkowania14,15.
  4. Wybierz z listy rozwijanej odpowiednią częstotliwość lasera, liczbę impulsów laserowych na woksel (wartości całkowite) oraz opóźnienie między wyzwalaniem lasera a akwizycją sygnału ze spektrometru mas (Rysunek 2-5). W eksperymentach IR-MALDESI MSI zazwyczaj stosuje się dwa impulsy laserowe na woksel przy 20 Hz, aby całkowicie zdesorbować materiał, z czasem opóźnienia 10 msec, co pozwala wygenerowanym jonom dotrzeć do analizatora mas w celu pomiaru5.
    Uwaga: Wybierz najwyższą częstotliwość powtórzeń, przy której laser jest w stanie pracować. Niedawno wykazano, że zastosowanie wyższej częstotliwości powtórzeń poprawia wykrywalność analitów16.

Układ skanowania laserowego do obrazowania; schemat z kalibracją pikseli, wzorem skanowania i szczegółami dotyczącymi częstotliwości.
Rysunek 2. Interfejs użytkownika do obsługi IR-MALDESI MSI. Przedstawiono zrzut ekranu programu RASTIR Scan Control. Kroki niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu MSI to (1) zlokalizowanie plamki laserowej, (2) wyznaczenie ROI, (3) wybór wielkości kroku stolika (w mm), (4) nadanie nazwy plikowi, (5) wybór odpowiedniej liczby impulsów na woksel oraz pożądanej częstotliwości repetycji i (6) sprawdzenie listy ustawień obrazowania oraz MS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. W oprogramowaniu spektrometru mas wybierz parametry takie jak tryb jonizacji, napięcie elektrospray, szybkość przepływu rozpuszczalnika, temperatura kapilary oraz czas wtrysku. Przykład parametrów zastosowanych w MSI IR-MALDESI całego ciała znajduje się w Tabeli 1.
    Uwaga: Ze względu na złożoność próbek biologicznych i brak metod rozdziału w analizach MSI, źródło IR-MALDESI jest sprzężone z instrumentem o wysokiej rozdzielczości i wysokiej dokładności masy. Do analiz takich jak równoległe monitorowanie reakcji (PRM)7 lub MSI z przełączaniem polarności12 można wczytać odpowiednią metodę akwizycji.
  2. Po wybraniu wszystkich parametrów (lasera, stolika i spektrometru mas), przełącz MS w tryb „handshake” w celu synchronizacji i rozpocznij akwizycję MS.
  3. Za pomocą oprogramowania do obrazowania RASTIR zweryfikuj, czy wszystkie kroki w liście kontrolnej (Rysunek 2-6) zostały wykonane, zaznaczając odpowiednie pola, a następnie wczytaj program. Po wczytaniu programu dostępny będzie przycisk „Run”. Naciśnij Run, aby rozpocząć akwizycję sygnału MSI.
  4. Po zakończeniu eksperymentu obrazowania zatrzymaj akwizycję spektrometru mas i przełącz instrument w tryb czuwania. Wyłącz przepływ azotu do obudowy, wyłącz zasilanie płyty Peltiera oraz wyłącz sterownik stolika i laser.
  5. Otwórz drzwiczki dostępu, wyjmij końcówkę emitera elektrospray z wnętrza obudowy źródła, a następnie, używając rękawic ochronnych, wyjmij wysunięty podgrzewany metalowy wlot MS. Uwaga: Wysunięty metalowy wlot MS będzie bardzo gorący.
  6. W rękawicach i okularach ochronnych wyczyść wysunięty metalowy wlot kapilary w kąpieli ultradźwiękowej w 15% kwasie azotowym przez 10 min, następnie w wodzie klasy HPLC przez 10 min, a na koniec w metanolu klasy HPLC przez 10 min. Osusz metalowy wlot kapilary strumieniem azotu i włóż go ponownie do MS. Uwaga: Po zakończeniu procesu utylizuj rozpuszczalniki w odpowiednich pojemnikach na odpady.
ParametrWartość
Tryb jonizacjiDodatni
Napięcie elektrosprayowe3,8-4,2 kV
Szybkość przepływu rozpuszczalnika2 μl/min
Temperatura kapilarna275 °C
Zakres skanowaniam/z 250–1 0
Typ skanowania Pełne skanowanie
Czas wtrysku10 ms
Rozdzielczość140,000

Tabela 1. Parametry instrumentu zastosowane w badaniu MSI całego ciała metodą IR-MALDESI.

5. Analiza danych

  1. Przekształć surowe pliki danych wygenerowane przez instrument do formatów danych takich jak mzXML17 lub imzML18, korzystając z bezpłatnego oprogramowania, takiego jak MSConvert17 oraz konwerter imzML19.
  2. Uruchom program MSiReader v1.0, oprogramowanie open-source opracowane do analizy danych MSI o wysokiej rozdzielczości20, na dedykowanym komputerze do przetwarzania danych. Wczytaj plik obrazowania do programu MSiReader. Interfejs użytkownika MSiReader oraz niektóre z jego wbudowanych funkcji przedstawiono na Rysunku 3.
  3. Wygeneruj mapy jonowe interesujących analitów, wprowadzając ich m/z i wybierając odpowiednie okno m/z w częściach na milion (ppm) lub Thomsonach (Th) (Rysunek 3-1). Dla instrumentów o wysokiej rozdzielczości (RP) wybierz okno w niskim zakresie ppm.
    Uwaga: Odpowiednie okno m/z zależy od rozdzielczości (RP) oraz dokładności pomiaru masy (MMA) instrumentu, z którym sprzężone jest źródło IR-MALDESI.
  4. Dalszą interpretację danych przeprowadź przy użyciu wbudowanych funkcji, takich jak interpolacja (Rysunek 3-2), normalizacja (Rysunek 3-3), nałożenie obrazu optycznego (Rysunek 3-4) oraz detekcja pików (peak picking) (Rysunek 3-5)20.

Analiza obrazowania MS, interfejs oprogramowania MSiReader, wizualizacja danych spektrometrii mas, schemat.
Rysunek 3. Interfejs użytkownika MSiReader; v1.020Po załadowaniu pliku do oprogramowania mapy jonowe interesujących analityków są wyświetlane poprzez (1) wprowadzenie m/z oraz tolerancja w ppm lub Th. Można również przeprowadzić dalsze analizy, takie jak (2) interpolacja lub (3) normalizacja. W celu lepszej wizualizacji można również zaimportować obraz optyczny tkanki i nałożyć go na mapy jonowe (4). W przypadku analiz niecelowanych można wykorzystać funkcję wyboru piku (5) do wyodrębnienia pików specyficznych dla tkanki poprzez zaznaczenie obszaru tkanki (linia purpurowa) oraz obszaru referencyjnego poza tkanką (zielona ramka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Użyj funkcji wyboru pików (peak picking), aby wygenerować listę specyficznych dla tkanki wartości m/z zgodnie z kryteriami zdefiniowanymi przez użytkownika. Uwaga: Algorytm PeakFinder wykorzystuje różnice w średnim widmie mas dwóch obszarów. Wartości m/z te mogą następnie zostać przeszukane w bazach danych metabolitów, takich jak METLIN21 lub LIPID MAPS.2
    1. Przykład wyboru badanego obszaru tkanki (magenta polygon ROI) oraz referencyjnego obszaru poza tkanką (green polygon ROI) przedstawiono na Rysunku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazy przedstawione na Rysunku 4 ukazują rozmieszczenie przestrzenne metabolitów w różnych narządach w przekroju całej tkanki organizmu. Unikalne wartości m/z przypisane do konkretnych regionów ciała zostały zidentyfikowane przy użyciu programu MSiReader PeakFinder, a następnie poddane przetwarzaniu wsadowemu w celu wygenerowania obrazów. Narzędzie nakładania obrazów (Rysunek 3-4) posłużyło do dopasowania obrazu optycznego wykonanego przed osadz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powyższy protokół opisuje kluczowe kroki do przeprowadzenia eksperymentu IR-MALDESI MSI. Proces nakładania matrycy (sekcja 3) trwa około 20 minut, co jest podobne do typowego procesu aplikacji matrycy w eksperymentach MALDI MSI poprzez sublimację lub powlekanie natryskowe za pomocą zrobotyzowanego opryskiwacza. Co więcej, IR-MALDESI nie opiera się na podziale analitów na kryształy matrycy6, a matryca lodowa może być uniwersalnie stosowana do wszystkich analitów, niezależnie od ich masy, wielkości czy właściwoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują profesorowi H. Troyowi Ghashghaei z Wydziału Molekularnych Nauk Biomedycznych NCSU za dostarczenie całej tkanki myszy. Autorzy wyrażają również wdzięczność za pomoc finansową otrzymaną od National Institutes of Health (R01GM087964), fundacji W.M. Kecka i Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IR-MALDESI SourceCustom-madeN/AProszę zapoznać się z odnośnikami 4 i 12 w celu szczegółowego omówienia rozwoju źródła IR-MALDESI.
Q Exactive Plus Thermo ScientificQ Exactive Plus Hybrydowy kwadrupolowo-orbitrapowy spektrometr masowy
Woda, klasa HPLCBurdick & Jackson AH365-4
Metanol, klasa HPLCBurdick & Jackson AH230-4
Kwas mrówkowySigma Aldrich 56302
Przestrajalny laser średniej podczerwieniOpotek Inc.IR OpolettePrzestrajalny 2,700-3,100  nm IR Laser OPO
Azot GazowyArc3 GazyAG S-NI300-5.0Butla z azotem o wysokiej czystości Grade 5.0 (300)
KriostatLeica BiosystemsCM 1950
Wysokoprofilowe ostrza mikrotomuLeica Biosystems3802123Leica DB80HS
Medium montażowe (OCT)Leica Biosystems3801480Surgipath FSC 22
Dysk z próbkami kriostatuLeica Biosystems14047740045średnicy 40 mm
Szkiełka mikroskopoweVWR48312-003Matowe, wyselekcjonowane, wstępnie oczyszczone
Medium montażowe

Bibliografia

  1. Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A. Imaging Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 26, 606-643 (2007).
  2. Chughtai, K., Heeren, R. M. A. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem. Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
  3. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. Atmospheric Pressure Mass Spectrometry Imaging. Encycl. Anal. Chem. , (2014).
  4. Sampson, J. S., Hawkridge, A. M., Muddiman, D. C. Generation and detection of multiply-charged peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (12), 1712-1716 (2006).
  5. Robichaud, G., Barry, J. A., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. Infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) imaging source coupled to a FT-ICR mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (1), 92-100 (2013).
  6. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI Mass Spectrometry Imaging of Biological Tissue Sections Using Ice as a Matrix. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  7. Barry, J. A., et al. Mapping Antiretroviral Drugs in Tissue by IR-MALDESI MSI Coupled to the Q Exactive and Comparison with LC-MS/MS SRM Assay. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  8. Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Ghashghaei, H. T., Muddiman, D. C. Influence of Desorption Conditions on Analyte Sensitivity and Internal Energy in Discrete Tissue or Whole Body Imaging by IR-MALDESI. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 26, 899-910 (2015).
  9. Nelson, K. A., Daniels, G. J., Fournie, J. W., Hemmer, M. J. Optimization of whole-body zebrafish sectioning methods for mass spectrometry imaging. J. Biomol. Tech. 24 (3), 119-127 (2013).
  10. Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194(2007).
  11. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  12. Nazari, M., Muddiman, D. C. Polarity Switching Mass Spectrometry Imaging of Healthy and Cancerous Hen Ovarian Tissue Sections by Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI). Analyst. 141, 595-605 (2016).
  13. Hsu, C. C., et al. Design and Application of a Low-Temperature Peltier-Cooling Microscope. J. Pharm. Sci. 85 (1), 70-74 (1996).
  14. Jurchen, J. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. MALDI-MS imaging of features smaller than the size of the laser beam. J. Am. Soc.Mass Spectrom. 16 (10), 1654-1659 (2005).
  15. Nazari, M., Muddiman, D. C. Cellular-level mass spectrometry imaging using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) by oversampling. Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2265-2271 (2015).
  16. Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Nazari, M., Muddiman, D. C. Influence of C-Trap Ion Accumulation Time on the Detectability of Analytes in IR-MALDESI MSI. Anal. Chem. 87, 10483-10490 (2015).
  17. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  18. Schramm, T., et al. ImzML - A common data format for the flexible exchange and processing of mass spectrometry imaging data. J. Proteomics. 75 (16), 5106-5110 (2012).
  19. Race, A. M., Styles, I. B., Bunch, J. Inclusive sharing of mass spectrometry imaging data requires a converter for all. J. Proteomics. 75 (16), 5111-5112 (2012).
  20. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  21. Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug. Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
  22. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Res. 35, D527-D532 (2007).
  23. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J. Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
  24. Takai, N., Tanaka, Y., Inazawa, K., Saji, H. Quantitative analysis of pharmaceutical drug distribution in multiple organs by imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26 (13), 1549-1556 (2012).
  25. Liu, J., Gingras, J., Ganley, K. P., Vismeh, R., Teffera, Y., Zhao, Z. Whole-body tissue distribution study of drugs in neonate mice using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (2), 185-190 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

tkanka całego organizmulaser podczerwonymatryca lodowasekcjonowanie w kriotomierozkład przestrzennyanaliza metabolitówobrazowanie tkanek
Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.