Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Summary

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Abstract

Zwłóknienie jest często zaangażowane w patogenezę różnych przewlekłych postępujących chorób, takich jak śródmiąższowa choroba płuc. Patologicznym znakiem rozpoznawczym jest powstawanie ognisk fibroblastycznych, co wiąże się z ciężkością choroby. Sugeruje się, że komórki mezenchymalne składające się z ognisk fibroblastycznych pochodzą z kilku źródeł komórkowych, w tym pierwotnie rezydujących fibroblastów wewnątrzpłucnych i krążących fibrocytów ze szpiku kostnego. Od niedawna uważa się, że komórki mezenchymalne, które przeszły przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT), również mają przyczyniać się do patogenezy zwłóknienia. Ponadto EMT może być indukowany przez przekształcanie czynnika wzrostu β, a EMT może być wzmocniony przez cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu α. Test skurczu żelowego jest idealnym modelem in vitro do oceny kurczliwości, która jest jedną z charakterystycznych funkcji fibroblastów i przyczynia się do gojenia ran i zwłóknienia. W tym miejscu zademonstrowano opracowanie testu skurczu żelu do oceny zdolności skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły EMT.

Introduction

Zwłóknienie bierze udział w patogenezie różnych przewlekłych postępujących chorób, takich jak śródmiąższowa choroba płuc, zwłóknienie serca, marskość wątroby, końcowa niewydolność nerek, twardzina układowa i choroba autoimmunologiczna¹. Wśród śródmiąższowych chorób płuc idiopatyczne włóknienie płuc (IPF) jest przewlekłą chorobą postępującą i wykazuje złe rokowanie. Patologicznym znakiem rozpoznawczym IPF jest rozwój ognisk fibroblastycznych składających się z aktywowanych fibroblastów i miofibroblastów, które są związane z rokowaniem. Sugeruje się, że pochodzenie takich fibroblastów płucnych wywodzi się z kilku komórek mezenchymalnych, w tym pierwotnie rezy....

Protocol

1. Przygotowanie i hodowla komórek nabłonka płuc

1. Hodowla ludzkich komórek nabłonka płuc A549 (przylegająca linia komórkowa) w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
2. Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z naczynia hodowlanego i przemyć raz 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po umyciu należy natychmiast zassać PBS.
3. Dodać 2 ml trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 3 minuty.
4. Zebrać oderwane komórki do p....

Results

Podczas EMT, komórki nabłonkowe tracą markery nabłonkowe, takie jak E-kadheryna, i zyskują ekspresję markerów mezenchymalnych, takich jak wimentyna i aktyna^4,5 α-mięśni gładkich. Inkubacja ludzkich komórek nabłonka płuc A549 z TGF-β1 i TNF-α indukuje EMT. Wygląd normalnych komórek A549 to kształt przypominający kostkę brukową i kształt trójkąta, który jest charakterystyczny dla komórek nabłonkowych (ryc. 3A), ale po stymulacji TGF-a1 i TNF-α wygląd zmienił się .......

Discussion

Protokół opracowany w tym badaniu składa się z dwóch etapów. Pierwszym krokiem jest indukcja EMT, natomiast drugim krokiem jest test skurczu żelu. Ponieważ ważne jest, aby potwierdzić, że komórki przeszły EMT, krok 2 stanowi doskonałe uzupełnienie zmian morfologicznych i ekspresji genów. Poprzednie badania wykazały, że EMT komórek A549 był indukowany przez TGF-a1 tylko²⁴; jednakże, jak informowaliśmy wcześniej¹⁰, leczenie TNF-α zwiększa EMT i pozyskiwanie mezenchymalnych markerów komórkowych. Uważa .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	Dla A549 średni
FBS	GIBCO	10437
Transformujący czynnik wzrostu-β 1, Ludzkie, rekombinowane	chemikalia laboratoryjne Wako	209-16544
Rekombinowany ludzki TNF-α	R& Systemy D	210-TA/CF
E-Kadheryna (24E10) Technologia	sygnalizacji komórkowej	# 3195	Rozcieńczenie 1: 3,000
Wimentyna (D21H3)	Technologia sygnalizacji komórkowej	# 5741	Rozcieńczenie 1:3 000
Przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe	sigma	aldrich T9026	Rozcieńczenie 1:10 000
Monoklonalna antyaktyna, &alfa;-Przeciwciało mięśni gładkich& nbsp;	sigma aldrich	A5228	1:10,000 rozcieńczenie
anty-N-kadheryny	Laboratoria Transdukcji BD #	610920	Rozcieńczenie 1:1,000
Anty-mysie IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (przeciwciało wtórne)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 rozcieńczenie
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (przeciwciało wtórne)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 odczynnik blokujący rozcieńczenie
	GE Healthcare	RPN418	2% w TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom Multiwell Multiwell Cell Culture Plate, z pokrywką	corning	#353046
100 mm Naczynie do hodowli komórkowych	TPP	#93100
DMEM, technologie trwałości proszku		12100-046	Dla 4 i razy; Żel kolagenowy DMEM
typu 1	Nitta żelatyna	Cellmatrix typ I-A
24 Well Płytka do hodowli komórkowych	AGC TECHNO GLASS	1820-024
System dokumentacji żelu	ATTO	AE-6911FXN	Gel imager
Oprogramowanie do analizy żelu	ATTO	Densitograph, wersja 3.00	oprogramowanie analityczne w zestawie z AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05%), phenol red	life technologies	25300054
24-dołkowymi płytkami, niepoddanymi obróbce	IWAKI	1820-024
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	life technologies	15250-061
Zestaw do ekstrakcji RNA	Qiagen	74106
Technologie odwrotnej transkryptazy	życia	18080044
System PCR w czasie rzeczywistym	Stratagene	Mx-3000P
SYBR	Qiagen	204145
Inhibitor proteazy Cocktail (100x)	technologie życia	78429
Membrana	PVDFATTO	2392390
Zestaw do oznaczania białek	bio-rad	5000006JA
Żel poliakrylamidowy	ATTO	2331810
Odczynnik do wykrywania Western blot	GE Healthcare	RPN2232
Kamera CCD	na zimno ATTO	Ez-Capture MG/ST
Inhibitor trypsyny	sigma aldrich	T9003-100MG
Monolaurynian polioksyetylenu (20)sorbitanu	Wako Chemikalia laboratoryjne	163-11512
Eter polioksyetylenowy (9) oktiifenylowy	Wako Chemikalia laboratoryjne	141-08321