Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53974

⸱

10 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Streszczenie

Zwłóknienie jest często zaangażowane w patogenezę różnych przewlekłych postępujących chorób, takich jak śródmiąższowa choroba płuc. Patologicznym znakiem rozpoznawczym jest powstawanie ognisk fibroblastycznych, co wiąże się z ciężkością choroby. Sugeruje się, że komórki mezenchymalne składające się z ognisk fibroblastycznych pochodzą z kilku źródeł komórkowych, w tym pierwotnie rezydujących fibroblastów wewnątrzpłucnych i krążących fibrocytów ze szpiku kostnego. Od niedawna uważa się, że komórki mezenchymalne, które przeszły przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT), również mają przyczyniać się do patogenezy zwłóknienia. Ponadto EMT może być indukowany przez przekształcanie czynnika wzrostu β, a EMT może być wzmocniony przez cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu α. Test skurczu żelowego jest idealnym modelem in vitro do oceny kurczliwości, która jest jedną z charakterystycznych funkcji fibroblastów i przyczynia się do gojenia ran i zwłóknienia. W tym miejscu zademonstrowano opracowanie testu skurczu żelu do oceny zdolności skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły EMT.

Wprowadzenie

Zwłóknienie bierze udział w patogenezie różnych przewlekłych postępujących chorób, takich jak śródmiąższowa choroba płuc, zwłóknienie serca, marskość wątroby, końcowa niewydolność nerek, twardzina układowa i choroba autoimmunologiczna1. Wśród śródmiąższowych chorób płuc idiopatyczne włóknienie płuc (IPF) jest przewlekłą chorobą postępującą i wykazuje złe rokowanie. Patologicznym znakiem rozpoznawczym IPF jest rozwój ognisk fibroblastycznych składających się z aktywowanych fibroblastów i miofibroblastów, które są związane z rokowaniem. Sugeruje się, że pochodzenie takich fibroblastów płucnych wywodzi się z kilku komórek mezenchymalnych, w tym pierwotnie rezydujących fibroblastów płucnych i krążących fibrocytów ze szpiku kostnego. Ostatnio zaproponowano, że przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) jest związane z powstawaniem komórek mezenchymalnych2 i przyczynia się do patogenezy zaburzeń zwłóknieniowych.

Uważa się, że EMT odgrywa ważną rolę w procesie rozwoju płodu, gojenia się ran i progresji raka, w tym inwazji guza i przerzutów3. W wyniku procesu EMT komórki nabłonkowe uzyskują zdolność komórek mezenchymalnych poprzez utratę markerów nabłonkowych, takich jak E-kadheryna, oraz poprzez ekspresję markerów mezenchymalnych, takich jak wimentyna i aktyna α-mięśni gładkich (SMA)4,5. Wcześniejsze badania wykazały dowody na to, że proces EMT jest związany z rozwojem zwłóknienia tkanek w nerkach6 i płucach7. Dodatkowo przewlekły stan zapalny sprzyja chorobie zwłóknieniowej8; ponadto takie cytokiny zapalne, jak nadrodzina czynnika martwicy nowotworu 14 (TNFSF14; Wykazano, że czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α i interleukina-1β zwiększają EMT9-12.

Test skurczu żelu kolagenowego, test skurczu komórek oparty na kolagenie, w którym fibroblasty są trójwymiarowo osadzone w żelu kolagenowym typu I, jest idealnym modelem in vitro do oceny kurczliwości. Kurczliwość jest jedną z charakterystycznych funkcji fibroblastów i przyczynia się do prawidłowego gojenia się ran i zwłóknienia13. W tym teście uważa się, że przyłączanie fibroblastów do kolagenu typu I poprzez mechanizmy zależne od integryn ma w pewnych warunkach wytwarzać napięcie mechaniczne, a w konsekwencji prowadzić do skurczu tkanek.

Tutaj rozwój testu skurczu żelu jest dostosowany do oceny nabycia funkcji skurczu w komórkach, które przeszły EMT. Raport ten pokazuje, że ten zmodyfikowany test jest odpowiedni do oceny kurczliwości w komórkach mezenchymalnych, które przeszły EMT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i hodowla komórek nabłonka płuc

  1. Hodowla ludzkich komórek nabłonka płuc A549 (przylegająca linia komórkowa) w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z naczynia hodowlanego i przemyć raz 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po umyciu należy natychmiast zassać PBS.
  3. Dodać 2 ml trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty.
  4. Zebrać oderwane komórki do probówek wirówkowych zawierających pożywkę do hodowli komórkowych, odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy sile 150 × g.
  5. Zawiesić osad komórek w 2 ml pożywki do hodowli komórkowych i usunąć próbkę do zliczenia komórek. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, aby sprawdzić żywotność komórek.
  6. Nasiona komórek A549 na 10 cm płytkach polistyrenowych o gęstości 0,5 - 1,0 × 106 komórek/naczynie z 10 ml pożywki do testu skurczu żelu. Wysiewaj komórki na 6 dołkach polistyrenowych o gęstości 0,5 - 1,0 × 105 komórek/studzienkę z 2 ml pożywki w celu potwierdzenia EMT. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.

2. Procedura EMT

  1. Dodać 10 μl TGF-β1 (5 μg/ml) i 10 μl TNF-α (10 μg/ml) do płytki do testu skurczowego żelu wysiewanego w kroku 1.6. Dodać 2 μl TGF-β1 (5 μg/ml) i 2 μl TNF-α (10 μg/ml) na płytkę w celu potwierdzenia EMT wysiewu w kroku 1.6. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.

3. Potwierdzenie procedury EMT za pomocą PCR i Western Blotting

  1. Potwierdź zmianę morfologii (od brukowej kamienia do wrzecionowatego kształtu) leczonych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
    Uwaga: Normalne komórki A549 mają brukowany wygląd przypominający kamień i trójkątny kształt, który jest charakterystyczny dla komórek nabłonkowych, ale po stymulacji TGF-β1 i TNF-α komórki wydają się długie i wrzecionowate, co jest podobne do komórek mezenchymalnych14,15.
  2. Oceń ekspresję markera nabłonkowego, takiego jak E-kadheryna, i markerów mezenchymalnych, takich jak N-kadheryna, wimentyna i aktyna α mięśni gładkich za pomocą PCR lub Western blot.
    1. Ekstrahuj całkowite RNA z komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA16 i zsyntetyzuj cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy17 zgodnie z protokołem producenta.
    2. Zmierz ekspresję poziomów mRNA za pomocą systemu Real Time PCR18 i zestawu do PCR z monomerycznym barwnikiem cyjaninowym zgodnie z instrukcjami producenta. Specyficzne startery dla GAPDH (dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego), ACTA2 (alfa-aktyna-2), CDH1 (kadheryna-1; E-kadheryna) i VIM (wimentyna) przedstawiono w Tabeli 1.
    3. Poddać komórki lizie za pomocą roztworu buforu do lizy (Tabela 2) zawierającego 1% koktajl inhibitorów proteazy. Zmierzyć stężenie białka we wszystkich próbkach za pomocą zestawu do oznaczania białek19,20 i nanieść te same ilości białka na żel poliakrylamidowy.
      1. Wykonać elektroforezę żelową SDS i półsuchy transfer białek do błony PVDF21. Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez 1 - 2 godziny. Po inkubacji przemyć dwukrotnie membranę buforem do przemywania i inkubować błonę przez 1 godzinę z drugimi przeciwciałami.
        Uwaga: Patrz Tabela materiałów/sprzętu, aby zapoznać się z przeciwciałami i rozcieńczeniami stosowanymi w tych badaniach. Patrz tabela 2, aby zapoznać się ze składnikami bufora blokującego.
      2. Dwukrotnie przemyć membranę buforem do mycia. Zrób zdjęcia membrany za pomocą zestawu do wykrywania Western blotting22 za pomocą zimnej kamery CCD11,23.

4. Test skurczu żelu do oceny EMT

  1. Odessać kondycjonowaną pożywkę z naczynia do hodowli komórkowej i dobrze przemyć 5 - 10 ml PBS w celu usunięcia martwych komórek. Po umyciu należy natychmiast zassać PBS.
  2. Dodać 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty.
  3. Zebrać oderwane komórki do probówek wirówkowych zawierających DMEM uzupełniony inhibitorem trypsyny (1 mg/ml), odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 4 minuty w temperaturze 150 ×g.
  4. Wymieszaj żel kolagenowy typu 1 z wodą destylowaną i 4× skoncentrowanym DMEM, aby dostosować objętości, aby osiągnąć stężenie kolagenu 1,75 mg / ml i stężenie 1× DMEM. Na tym etapie upewnij się, że podłoże żelowe znajduje się na lodzie.
    Uwaga: Aby przygotować 6 ml podłoża żelowego, dobrze wymieszaj 3,5 ml żelu kolagenowego typu 1 (3 mg / ml), 1,5 ml 4× skoncentrowanego DMEM i 1 ml wody destylowanej.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS i usunąć próbkę do zliczenia komórek. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru z barwieniem trypanowym, aby sprawdzić żywotność komórek.
  6. Dodać podłoże żelowe, aby dostosować objętości w celu uzyskania gęstości komórek 3,0 × 105 komórek/dołek (6,0 × 105 komórek/ml) i delikatnie, ale szybko wymieszać, pipetując bez żelowania.
  7. Szybko i ostrożnie dozować 0,5 ml mieszaniny do każdej studzienki 24-dołkowej, niepoddanej działaniu substancji płytki, aby uzyskać schludną cylindryczną formę. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie zanieczyściły żeli (Rysunek 1A).
    Uwaga: Podłoże żelowe zawierające komórki jest lepkie i może łatwo żelować i tworzyć kształt półksiężyca w studzience.
  8. Inkubować płytkę przez 15 minut w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%, aż do całkowitego zżelowania.
  9. Odłącz żele od płytki bez pękania, przesuwając wysterylizowaną szpatułkę w taki sposób, aby narysować obwód w jednym kierunku. Za pomocą szpatułki delikatnie przenieś żele na 60-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych zawierające 5 ml DMEM/1% FBS z lub bez TGF-β1 (5 ng/ml) i TNF-α (10 ng/ml).
  10. Delikatnie potrząśnij naczyniami, aby upewnić się, że żele unoszą się na podłożu. Inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

5. Pomiar rozmiaru żelu

  1. Zmierz rozmiar żelu kolagenowego po 0, 24, 48 i 72 godzinach za pomocą systemu analizy obrazu.
    1. Włącz system dokumentacji żelu (Rysunek 2A) i włóż naczynia do szafki z osłoną światła. Następnie zdejmij pokrywkę naczyń w szafce.
    2. Otwórz powiązane oprogramowanie do analizy żeli. Kliknij przycisk "akwizycja obrazu" na pasku menu, aby wyświetlić obraz żeli w szafce. Następnie kliknij "pobierz" na pasku menu, aby zrobić zdjęcia żeli (Rysunek 2B).
    3. Kliknij "przycisk wykrywania" na pasku menu (Rysunek 2C) i dostosuj obszar pomiaru (żółte kółko na rysunku 2C), przeciągając myszą. Następnie kliknij przycisk "automatyczne wykrywanie" na pasku menu (patrz przycisk na rysunku 2D). Oprogramowanie automatycznie wykrywa żele, wyświetlając mapę cieplną (rysunek 2D).
    4. Kliknij "OK", aby wyodrębnić kontur żeli poprzez przetwarzanie obrazu i obliczyć obszary otoczone konturem (Rysunek 2E). Po obliczeniu powierzchni obliczony obszar jest wyświetlany w osobnym oknie wyskakującym.
      Uwaga: Jeśli żele nakładają się na siebie podczas obrazowania, delikatnie przesuwaj żele za pomocą sterylnej końcówki pipety.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W trakcie EMT komórki nabłonkowe tracą markery nabłonkowe, takie jak E-kadheryna, i zaczynają wykaziwać ekspresję markerów mezenchymalnych, takich jak wimentyna i α-aktyna mięśni gładkich4,5. Inkubacja ludzkich komórek nabłonkowych płuc A549 z TGF-β1 i TNF-α indukuje EMT. Normalne komórki A549 mają kształt przypominający brukowca lub trójkąt, co jest charakterystyczne dla komórek nabłonkowych (Rysunek 3A), natomiast po stymulacji TGF-β1 i TNF-α ich wygląd zmien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół opracowany w tym badaniu składa się z dwóch etapów. Pierwszym krokiem jest indukcja EMT, natomiast drugim krokiem jest test skurczu żelu. Ponieważ ważne jest, aby potwierdzić, że komórki przeszły EMT, krok 2 stanowi doskonałe uzupełnienie zmian morfologicznych i ekspresji genów. Poprzednie badania wykazały, że EMT komórek A549 był indukowany przez TGF-a1 tylko24; jednakże, jak informowaliśmy wcześniej10, leczenie TNF-α zwiększa EMT i pozyskiwanie mezenchymalnych markerów komórkowych. Uważa ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Tadashi Koyama za pomoc techniczną. Prace te były częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; grant dla Grupy Badawczej ds. Niewydolności Oddechowej z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej w Japonii; grant na badania nad chorobami alergicznymi i immunologią, Japonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMsigma aldrich11965-092Dla A549 średni
FBSGIBCO10437
Transformujący czynnik wzrostu-β 1, Ludzkie, rekombinowanechemikalia laboratoryjne Wako209-16544
Rekombinowany ludzki TNF-αR& Systemy D210-TA/CF
E-Kadheryna (24E10) Technologiasygnalizacji komórkowej# 3195Rozcieńczenie 1: 3,000
Wimentyna (D21H3)Technologia sygnalizacji komórkowej# 5741Rozcieńczenie 1:3 000
Przeciwciało anty-&alfa-tubulinowesigmaaldrich T9026Rozcieńczenie 1:10 000
Monoklonalna antyaktyna, &alfa;-Przeciwciało mięśni gładkich& nbsp;sigma aldrichA52281:10,000 rozcieńczenie
anty-N-kadherynyLaboratoria Transdukcji BD #610920Rozcieńczenie 1:1,000
Anty-mysie IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (przeciwciało wtórne)GE HealthcareNA931-100UL1:20,000 rozcieńczenie
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (przeciwciało wtórne)GE HealthcareNA934-100UL1:20,000 odczynnik blokujący rozcieńczenie
GE HealthcareRPN4182% w TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom Multiwell Multiwell Cell Culture Plate, z pokrywkącorning#353046
100 mm Naczynie do hodowli komórkowychTPP#93100
DMEM, technologie trwałości proszku12100-046Dla 4 i razy; Żel kolagenowy DMEM
typu 1Nitta żelatynaCellmatrix typ I-A
24 Well Płytka do hodowli komórkowychAGC TECHNO GLASS1820-024
System dokumentacji żelu ATTOAE-6911FXNGel imager
Oprogramowanie do analizy żeluATTODensitograph, wersja 3.00oprogramowanie analityczne w zestawie z AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05%), phenol redlife technologies25300054
24-dołkowymi płytkami, niepoddanymi obróbceIWAKI1820-024
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%life technologies15250-061
Zestaw do ekstrakcji RNAQiagen74106
Technologie odwrotnej transkryptazyżycia18080044
System PCR w czasie rzeczywistymStratageneMx-3000P
SYBRQiagen204145
Inhibitor proteazy Cocktail (100x)technologie życia78429
MembranaPVDFATTO2392390
Zestaw do oznaczania białekbio-rad5000006JA 
Żel poliakrylamidowyATTO2331810
Odczynnik do wykrywania Western blotGE HealthcareRPN2232
Kamera CCDna zimno ATTOEz-Capture MG/ST
Inhibitor trypsynysigma aldrichT9003-100MG
Monolaurynian polioksyetylenu (20)sorbitanuWako Chemikalia laboratoryjne163-11512
Eter polioksyetylenowy (9) oktiifenylowyWako Chemikalia laboratoryjne141-08321
mAb królika mAb królika Przeciwciało Zielony zestaw PCR

Bibliografia

  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test kurczenia eluTGF Beta 1TNF Alphakom rki A549kurczliwo kom rekanaliza Western blotbarwienie immunofluorescencyjneinkubator do hodowli kom rkowych
Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.