Artykuł metodologiczny

Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

29.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53975

⸱

18 kwietnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

W tym artykule

Podsumowanie

Obfitość białek odzwierciedla tempo zarówno syntezy białek, jak i ich degradacji. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, po którym następuje western blot, do analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące).

Streszczenie

Regulacja obfitości białka jest kluczowa dla praktycznie każdego procesu komórkowego. Obfitość białek odzwierciedla integrację szybkości syntezy białek i degradacji białek. Wiele testów opisujących obfitość białek (np. jednorazowy western blotting w punkcie czasowym, cytometria przepływowa, mikroskopia fluorescencyjna lub testy reporterowe oparte na wzroście) nie pozwala na rozróżnienie względnego wpływu translacji i proteolizy na poziomy białka. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, a następnie western blot, w celu specyficznej analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące). W tej procedurze komórki drożdży są inkubowane w obecności inhibitora translacji cykloheksymidu. Podwielokrotności komórek pobiera się natychmiast po dodaniu cykloheksymidu i w określonych punktach czasowych po jego dodaniu. Komórki są poddawane lizie, a lizaty są rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu analizy obfitości białka western blot w każdym punkcie czasowym. Procedura pościgu cykloheksymidu pozwala na wizualizację kinetyki degradacji populacji w stanie stacjonarnym różnych białek komórkowych. Procedura ta może być wykorzystana do zbadania wymagań genetycznych i wpływów środowiska na degradację białek.

Wprowadzenie

Białka pełnią kluczowe funkcje w praktycznie każdym procesie komórkowym. Wiele procesów fizjologicznych wymaga obecności określonego białka (lub białek) przez określony czas lub w określonych okolicznościach. Organizmy monitorują zatem i regulują obfitość białka, aby zaspokoić potrzeby komórkowe 1. Na przykład cykliny (białka kontrolujące podział komórkowy) są obecne w określonych fazach cyklu komórkowego, a utrata regulowanych poziomów cyklin jest związana z powstawaniem nowotworów złośliwych 2. Oprócz regulowania poziomu białka w celu zaspokojenia potrzeb komórkowych, komórki wykorzystują degradacyjne mechanizmy kontroli jakości w celu wyeliminowania nieprawidłowo sfałdowanych, niezłożonych lub w inny sposób nieprawidłowych cząsteczek białka 3. Kontrola obfitości białek obejmuje regulację zarówno syntezy makromolekularnej (transkrypcja i translacja), jak i degradacji (rozpad RNA i proteoliza). Upośledzona lub nadmierna degradacja białek przyczynia się do wielu patologii, w tym raka, mukowiscydozy, chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń sercowo-naczyniowych 4-8. Mechanizmy proteolityczne stanowią zatem obiecujące cele terapeutyczne dla szeregu chorób 9-12.

Analiza białek w jednym punkcie czasowym (np. za pomocą western blot 13, cytometrii przepływowej 14 lub mikroskopii fluorescencyjnej 15) daje obraz obfitości białek w stanie ustalonym, nie ujawniając względnego wkładu syntezy lub degradacji. Podobnie, testy reporterowe oparte na wzroście odzwierciedlają poziomy białka w stanie ustalonym przez dłuższy czas bez rozróżniania między wpływami syntezy i degradacji 15-20. Możliwe jest wywnioskowanie udziału procesów degradacyjnych w poziomach białek w stanie stacjonarnym, porównując obfitość przed i po zahamowaniu określonych składników mechanizmu degradacji (np. poprzez farmakologiczną dezaktywację proteasomu 21 lub wyeliminowanie genu, co do którego przypuszczalnie wymagany jest do degradacji 13). Zmiana poziomu białek w stanie stacjonarnym po zahamowaniu szlaków degradacyjnych dostarcza mocnych dowodów na udział proteolizy w kontroli obfitości białek 13. Jednak taka analiza nadal nie dostarcza informacji na temat kinetyki obrotu białek. Pogoń za cykloheksymidem, a następnie western blotting przezwycięża te słabości, umożliwiając naukowcom wizualizację degradacji białek w czasie 22-24. Ponadto, ponieważ wykrywanie białek po pościgu cykloheksymidu jest zwykle wykonywane za pomocą western blot, izotopy promieniotwórcze i długie etapy immunoprecypitacji nie są wymagane do pościgu cykloheksymidu, w przeciwieństwie do wielu powszechnie stosowanych technik pościgu impulsowego, które są również wykonywane w celu wizualizacji degradacji białka25.

Cykloheksymid został po raz pierwszy zidentyfikowany jako związek o właściwościach przeciwgrzybiczych, wytwarzany przez bakterię Gram-dodatnią Streptomyces griseus 26,27. Jest to cząsteczka przepuszczalna dla komórek, która specyficznie hamuje eukariotyczną cytozolową (ale nie organellarną) translację poprzez upośledzenie translokacji rybosomalnej 28-31. W eksperymencie z pościgiem cykloheksymidu cykloheksymid jest dodawany do komórek, a porcje komórek są zbierane natychmiast i w określonych punktach czasowych po dodaniu związku 22. Komórki są poddawane lizie, a obfitość białka w każdym punkcie czasowym jest analizowana, zwykle za pomocą western blot. Zmniejszenie obfitości białka po dodaniu cykloheksymidu można z pewnością przypisać degradacji białek. Niestabilne białko będzie z czasem zmniejszać swoją liczebność, podczas gdy stosunkowo stabilne białko będzie wykazywać niewielkie zmiany w obfitości.

Mechanizmy selektywnej degradacji białek zostały bardzo zachowane w całej Eukarya. Wiele z tego, co wiemy o degradacji białek, po raz pierwszy poznano u modelowego jednokomórkowego eukarionta, Saccharomyces cerevisiae (pączkujące drożdże) 25,32-36. Badania z udziałem drożdży prawdopodobnie będą kontynuowane i dostarczą nowych i ważnych informacji na temat degradacji białek. Przedstawiono metodę pościgu cykloheksymidu w komórkach drożdży, a następnie analizę obfitości białek metodą western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost i zbiór komórek drożdży

  1. Jeśli nie analizujesz kinetyki degradacji endogennego białka drożdży, przekształć pożądany szczep (szczepy) drożdży za pomocą plazmidu kodującego interesujące białko. Wiarygodne metody przemiany drożdży zostały już wcześniej opisane 37.
  2. Zaszczepić drożdże w 5 ml odpowiedniej pożywki (np. selektywnej pożywki syntetycznej zdefiniowanej (SD) do utrzymania plazmidu w transformowanych komórkach lub nieselektywnej pożywki z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) dla komórek nieprzekształconych). Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C, obracając się.
    UWAGA: 30 °C to optymalna temperatura wzrostu dla typowych szczepów drożdży laboratoryjnych typu dzikiego 38. Ponieważ jednak niektóre zmutowane szczepy drożdży nie rosną optymalnie w temperaturze 30 °C, a niektóre białka ulegają degradacji zależnej od temperatury, temperatury stosowane do wzrostu komórek drożdży i pogoni cykloheksymidu powinny być określone empirycznie 39.
  3. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) każdej nocnej hodowli.
    UWAGA: Komórki mogą znajdować się w logarytmicznej lub stacjonarnej fazie wzrostu, ale powinny osiągnąć minimalną gęstość, która pozwoli na rozcieńczenie do OD600 = 0,2 w 15 ml świeżej pożywki.
  4. Rozcieńczyć kultury na noc do wartości OD600 wynoszącej 0,2 w 15 ml świeżej pożywki.
  5. Drożdże inkubować w temperaturze 30 °C, wstrząsając aż do momentu, gdy komórki osiągną środkową logarytmiczną fazę wzrostu (tj. OD600 między 0,8 a 1,2).
  6. Podczas wzrostu komórek drożdży należy wykonać następujące czynności, aby przygotować się do zabiegu pościgu cykloheksymimidowego:
    1. Ustawić blok grzewczy, który może pomieścić 15 ml stożkowych probówek, do temperatury 30 °C w celu inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu. Dodaj wodę do studzienek bloku grzewczego, aby umożliwić efektywne rozprowadzanie ciepła do kultur. Dodaj wodę do każdej studzienki tak, aby stożkowa rurka o pojemności 15 ml spowodowała podniesienie się poziomu wody do krawędzi studni, ale nie przelanie się przez nią.
    2. Ustaw drugi blok grzewczy, który może pomieścić 1,5 ml probówek mikrowirówkowych, do 95 °C w celu denaturacji białek po lizie komórek.
    3. Wstępnie ogrzać świeżą pożywkę wzrostową (1,1 ml na punkt czasowy na badaną kulturę) do 30 °C.
    4. Dodać 50 μl 20x Stop Mix do wstępnie oznakowanych probówek do mikrowirówek (jedna probówka na punkt czasowy na kulturę, która ma być oznaczona). Umieść probówki na lodzie.
      UWAGA: Azydek sodu, składnik 20x Stop Mix, jest toksyczny po spożyciu doustnym lub kontakcie ze skórą. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta podczas przygotowywania, przechowywania i obchodzenia się z azydkiem sodu. W przypadku przypadkowego narażenia należy zapoznać się z kartą charakterystyki dostarczonej przez producenta.
  7. Gdy komórki osiągną średni wzrost logarytmiczny, zbierz 2,5 OD600 jednostek każdej kultury na punkt czasowy, który ma być oznaczony (np. 7,5 OD600 jednostek, aby przeanalizować obfitość białka w trzech punktach czasowych). Odwirować zebrane komórki w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min.
    UWAGA: Jedna jednostka OD600 jest równa ilości drożdży obecnych w 1 ml kultury przy OD600 1,0. Objętość kultury (w ml) wymagana do zebrania X OD600 jednostek (V) może być określona za pomocą następującego równania: V = X OD600 jednostek/Zmierzony OD600. Na przykład, aby zebrać 7,5 OD600 jednostek kultury komórkowej drożdży przy OD600 1,0, zbierz 7,5 OD600 jednostek/1,0 = 7,5 ml kultury drożdży.
  8. Zawiesić każdą komórkę w 1 ml świeżej pożywki o temperaturze 30 °C (wstępnie podgrzanej) na 2,5 OD600 jednostek komórek (np. 3 ml na 7,5 OD600 jednostek).

2. Pogoń za cykloheksymidem

  1. Zrównoważyć zawiesiny komórek drożdży przez inkubację przez 5 minut w bloku grzewczym o temperaturze 30 °C.
  2. Przygotuj minutnik do liczenia od 0:00.
  3. Aby rozpocząć pościg za cykloheksymimidem, naciśnij "Start" na timerze. Szybko, ale ostrożnie, wykonaj następujące kroki:
    1. Dodać cykloheksymid do końcowego stężenia 250 μg/ml do pierwszej zawiesiny komórek drożdży (np. dodać 37,5 μl 20 mg/ml cykloheksymidu do 3 ml zawiesiny komórek) i krótko zmieszać.
      UWAGA: Cykloheksymid działa drażniąco na skórę i jest toksyczny po spożyciu doustnym. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta podczas przygotowywania, przechowywania i obchodzenia się z cykloheksymidem. W przypadku przypadkowego narażenia należy zapoznać się z kartą charakterystyki dostarczonej przez producenta.
    2. Natychmiast po dodaniu cykloheksymidu i wirowaniu, przenieś 950 μl (~2,4 OD600 jednostek) zawiesiny komórek drożdży z dodatkiem cykloheksymidu do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówki zawierającej 50 μl lodowatej mieszanki 20x. Zwiruj probówkę do mikrowirówki i umieść na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną zebrane.
    3. Przywrócić zawiesinę komórek drożdży do temperatury 30 °C.
  4. Powtórzyć kroki od 2.3.1 do 2.3.3 dla każdej z pozostałych zawiesin komórek drożdży w regularnych odstępach czasu (np. co 30 sekund, tak aby cykloheksymid był dodawany do próbki #1 o godzinie 0:00, próbki #2 o godzinie 0:30, próbki #3 o godzinie 1:00 itd.).
  5. W każdym kolejnym punkcie czasowym odwirować zawiesiny komórek drożdży i przenieść 950 μl do znakowanych probówek wirówkowych zawierających 50 μl wstępnie schłodzonego 20x Stop Mix. Wiruj i umieść zebrane komórki na lodzie. Umieścić 15 ml stożkowych probówek z powrotem w bloku grzewczym o temperaturze 30 °C.
    1. Na przykład, w przypadku pobierania komórek 30 minut po dodaniu cykloheksymidu (zakładając 30-sekundowe odstępy czasu między dodaniem cykloheksymidu do zawiesin komórek drożdży na początku przebiegu czasu), należy odwirować i usunąć 950 μl zawiesiny komórkowej z próbki #1 o godzinie 30:00. Powtórz dla próbki #2 o 30:30 i tak dalej.
      UWAGA: Aby zapobiec osadzaniu się drożdży, zawiesiny komórek wirowych w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml należy umieszczać mniej więcej co 5 minut przez cały czas trwania pościgu. Alternatywnie, zawiesiny komórek drożdży mogą być utrzymywane w stale mieszającej kąpieli wodnej przez czas trwania eksperymentu z pościgiem cykloheksymidu.
  6. Po pobraniu wszystkich próbek, zebrać komórki w osadach przez odwirowanie w temperaturze 6 500 x g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację. Komórki są teraz gotowe do lizy alkalicznej. Alternatywnie, zatrzaskowo zamrozić granulowane komórki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Ekstrakcja białek po alkalicze (zmodyfikowana z 16,40)

  1. Do każdej komórki dodać 100 μl wody destylowanej. Zawiesić przez pipetowanie w górę i w dół lub wirowanie.
  2. Dodać 100 μl 0,2 M NaOH do każdej próbki. Mieszać, pipetując w górę i w dół lub wirując.
  3. Inkubować zawieszone komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Na tym etapie komórki drożdży nie zostały poddane lizie, a białka nie zostały uwolnione 40.
  4. Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.
  5. Aby poddać lizie komórki, dodaj 100 μl buforu do próbki Laemmli do każdej osadki komórkowej. Zawiesić ponownie, pipetując w górę i w dół lub wirując.
    UWAGA: Sekwencyjna inkubacja komórek z buforem próbki NaOH i Laemmli uwalnia białka w postaci zgodnej z elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu (SDS-PAGE) przy użyciu systemu buforowego Tris-glicyna.
  6. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut do całkowitej denaturacji białek.
    UWAGA: Inkubacja w temperaturze 95 °C może nie być odpowiednia do analizy białek, które są podatne na agregację (np. białek z kilkoma segmentami transbłonowymi). Białka te mogą stać się nierozpuszczalne podczas inkubacji w podwyższonych temperaturach 41. Tak więc, do analizy takich białek, lizaty powinny być inkubowane w niższych temperaturach (np. 37 °C - 70 °C) przez 10 - 30 minut, jak określono empirycznie.
  7. Odwirować lizaty przy 18 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę do granulowania nierozpuszczalnego materiału. Supernatant (rozpuszczone, wyekstrahowane białko) jest gotowy do separacji za pomocą SDS-PAGE i późniejszej analizy western blot. Alternatywnie przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C.

4. Reprezentatywna SDS-PAGE i procedura Western Blotting (Dostosowane z 16)

  1. Załaduj wzorce masy cząsteczkowej białka i empirycznie oznaczoną objętość lizatów do żelu SDS-PAGE.
    UWAGA: Wybierz procentową zawartość akrylamidu i bis-akrylamidu w żelu SDS-PAGE na podstawie masy cząsteczkowej interesującego Cię białka. Ogólnie rzecz biorąc, żele o niższym procencie lepiej nadają się do rozpuszczania białek o wyższej masie cząsteczkowej.
  2. Uruchom żel pod napięciem 200 V, aż przód barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.
  3. Przenieść białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) metodą transferu na mokro pod napięciem 20 V przez 60-90 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Błonę blokową przez inkubację w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającą 5% odtłuszczonego mleka, kołysząc, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów w obecności membrany inkubowanej przez noc, zaleca się włączenie azydku sodu do roztworu blokującego w końcowym stężeniu 0,02%.
  5. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w TBS z 0,1% Tween-20 (TBS/T) i 1% odtłuszczonym mlekiem, kołysząc, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.
  7. Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w TBS/T z 1% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, kołysząc.
    UWAGA: Fluorofory są wrażliwe na światło. W związku z tym rozcieńczenia przeciwciał sprzężonych z fluoroforami powinny być przygotowywane w ciemności, a inkubacja błon w obecności przeciwciał sprzężonych z fluoroforami i następujące po nich etapy płukania powinny odbywać się w pojemnikach odpornych na światło (np. owiniętych folią).
  8. Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.
  9. Membranę obrazową należy wykonać przy użyciu oprogramowania LI-COR Odyssey CLx i Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.
  10. Po uzyskaniu obrazu błony inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla białka kontrolnego obciążenia w TBS/T z 1% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, kołysząc.
  11. Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.
  12. Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w TBS/T z 1% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, kołysząc.
  13. Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.
  14. Membrana obrazu jak w kroku 4.9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować metodologię śledzenia z użyciem cykloheksymidu, przeanalizowano stabilność Deg1-Sec62 (Rysunek 1), modelowego substratu degradacji związanej z siateczką śródplazmatyczną (ERAD) u drożdży 42-44. W procesie ERAD enzymy ligazy ubikwityny odpowiedzialne za kontrolę jakości kowalencyjnie przyłączają łańcuchy małego białka ubikwityny do aberracyjnych białek zlokalizowanych w błonie ER. Takie białka polypolyubikwitylowane są następnie usuwane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy przedstawiono metodę analizy kinetyki degradacji białek. Technika ta może być z łatwością zastosowana do szeregu białek degradowanych przez różne mechanizmy. Należy zauważyć, że eksperymenty z cykloheksymidem donoszą o kinetyce degradacji puli stanu stacjonarnego danego białka. Inne techniki mogą być stosowane do analizy kinetyki degradacji określonych populacji białek. Na przykład, degradacyjny los powstających polipeptydów może być śledzony za pomocą analizy pościgu impulsowego 55. W takich eksperyme...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują obecnym i byłym członkom laboratorium Rubensteina za zapewnienie wspierającego i entuzjastycznego środowiska badawczego. Autorzy dziękują Markowi Hochstrasserowi (Uniwersytet Yale) za podzielenie się odczynnikami i wiedzą specjalistyczną. E.M.R. dziękuje Stefanowi Kreftowi (Uniwersytet w Konstancji) i Jennifer Bruns (Uniwersytet w Pittsburghu) za podzielenie się bezcenną wiedzą z zakresu analizy kinetycznej białek. Praca ta była wspierana przez grant National Institutes of Health (R15 GM111713) dla E.M.R., nagrodę badawczą Ball State University ASPiRE dla E.M.R., nagrodę badawczą od oddziału Ball State University Sigma Xi dla S.M.E. oraz fundusze z Biura Rektora i Wydziału Biologii Uniwersytetu Stanowego Ball.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożądane szczepy drożdży, plazmidy, pożywka wzorcowa i składniki
Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientific14-961-32Dostępne u różnych producentów
Inkubator z regulacją temperatury (np. Inkubator Heratherm model IMH180)Dot Scientific51028068Dostępne u różnych producentów
Wymienny bęben New Brunswick do rur 18 mm (rolka rurowa)New BrunswickM1053-0450Rolka rurowa jest zalecana do utrzymywania przez noc  kultur starterowych komórek drożdży w zawiesinie. Alternatywnie, jeśli walec rurowy nie jest dostępny, do nocnych kultur starterowych można użyć wytrząsarki platformowej w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze. Wytrząsarka platformowa lub rolka rurowa mogą być używane do utrzymywania większych kultur w zawiesinie.
New Brunswick TC-7 Bęben rolkowy 120 V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Do użytku z rolką rurową
SmartSpec Plus SpektrofotometrBio-Rad170-2525Dostępne u różnych producentów
Wirówka 5430Eppendorf5427 000.216 Wirnik sprzedawany z urządzeniem zawiera probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 i 2,0 ml. Rotor można wymienić na taki, który mieści probówki stożkowe o pojemności 15 i 50 ml
Rotor o stałym kącie nachylenia F-35-6-30 z pokrywą i adapterami do wirówki model 5430/R, probówki stożkowe 15/50 ml, 6-miejscoweEppendorfF-35-6-30
15-ml rurka z sitodrukiem 17 x 20 mm stożkowa, polipropylenowaSarstedt62.554.205Dostępne u różnych producentów
1,5-ml flex-tube, Czyste, naturalne probówki do mikrowirówek do PCREppendorf22364120Dostępne u różnych producentów
Analogowe grzałki do kąpieli Dri-BathFisher Scientific1172011AQZaleca się, aby dostępne były dwie grzałki (jedna do inkubacji komórek podczas leczenia cykloheksymidem i jedna do gotowania lizatów w celu denaturacji białek). Alternatywnie, 30 ° Kąpiel wodna C może być stosowana do inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu. Wrząca kąpiel wodna z gorącą płytą może być naprzemiennie stosowana do denaturacji białek.
Blok grzewczy do probówek stożkowych 12 x 15 mlFisher Scientific11-473-70Do stosowania z grzałką Dri-Bath podczas inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu.
Blok grzewczy do probówek stożkowych 20 x 1,5 mlFisher Scientific11-718-9QDo użytku z podgrzewaczem Dri-Bath do gotowania lizatów w celu denaturacji białek.
Aparatura do uruchamiania i przenoszenia SDS-PAGE, zasilacze i sprzęt do obrazowania lub ciemnie dla SDS-PAGE i transferu na membranęBędzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
System obrazowania Western blot (np. Skaner Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowanie Image Studio)Li-Cor9140-01Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
Membrany transferowe EMD Millipore Immobilon PVDFFisher ScientificIPFL00010Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Kinaza fosfoglicerynianowa (Pgk1) Przeciwciało monoklonalne, mysz (klon 22C5D8))Life Technologies459250Będzie się różnić w zależności od laboratorium i aplikacji
Przeciwciała drugorzędowe (np. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life TechnologiesA-21065Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
buforowe

Bibliografia

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11(2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428(2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021(2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza Western Blotinhibicja syntezy bia eklizy kom rek dro d yrozdzia SDS PAGEanaliza wymaga genetycznychbadanie efekt w rodowiskowychpopulacja w stanie stacjonarnym

Powiązane artykuły