Związany z wiekiem wzrost sztywności soczewek oka jest związany ze starczowzrocznością. Protokół ten opisuje prostą i ekonomiczną metodę pomiaru sztywności soczewek myszy. Soczewki myszy, podobnie jak soczewki ludzkie, z wiekiem stają się sztywniejsze. Ta metoda jest precyzyjna i może być dostosowana do soczewek większych zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sekwencyjne zastosowanie szkiełek nakrywkowych do oceny sztywności na ściskanie soczewki myszy: odkształcenia i analizy morfometryczne
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Soczewka oka to przezroczysty organ, który załamuje i skupia światło, tworząc wyraźny obraz na siatkówce. U ludzi mięśnie rzęskowe kurczą się, aby zdeformować soczewkę, co prowadzi do wzrostu mocy optycznej soczewki do skupiania się na pobliskich obiektach, proces znany jako akomodacja. Związane z wiekiem zmiany w sztywności soczewek są związane ze starczowzrocznością, zmniejszeniem zdolności soczewki do akomodacji, a co za tym idzie, z potrzebą noszenia okularów do czytania. Mimo że soczewki myszy nie dostosowują się do starczowzroczności ani jej nie rozwijają, modele mysie mogą stanowić nieocenione narzędzie genetyczne do zrozumienia patologii soczewek, a przyspieszone starzenie się obserwowane u myszy umożliwia badanie zmian w soczewce związanych z wiekiem. Protokół ten demonstruje prostą, precyzyjną i ekonomiczną metodę określania sztywności soczewek myszy, wykorzystującą szklane szkiełka nakrywkowe do sekwencyjnego zwiększania obciążeń ściskających na soczewkę. Reprezentatywne dane potwierdzają, że soczewki myszy z wiekiem stają się sztywniejsze, podobnie jak soczewki ludzkie. Metoda ta jest wysoce powtarzalna i potencjalnie może być skalowana w celu mechanicznego testowania soczewek od większych zwierząt.
Wprowadzenie
Soczewka jest przezroczystym i beznaczyniowym organem w przedniej komorze oka, który jest odpowiedzialny za precyzyjne skupianie światła na siatkówce. Przezroczysta błona podstawna, zwana torebką soczewki, otacza większość wydłużonych komórek włóknistych pokrytych przednią monowarstwą komórek nabłonkowych1,2. Wzrost soczewki przez całe życie zależy od ciągłej proliferacji i różnicowania komórek nabłonkowych na równiku soczewki w nowe komórki włókniste, które są dodawane do poprzednich generacji komórek włóknistych w sposób koncentryczny2. Z biegiem czasu komórki włókien soczewkowych ulegają zagęszczeniu, w wyniku czego w środku soczewki powstaje sztywny środek zwany jądrem1. Akomodacja, zdefiniowana jako zmiana dioptrii w mocy optycznej oka, występuje u ludzi, gdy mięśnie rzęskowe kurczą się, aby zdeformować soczewkę i umożliwić prawdziwy wzrost mocy optycznej w celu skupienia się na bliskich obiektach3-5. W oku nieprzystosowanym soczewka jest utrzymywana w stanie stosunkowo spłaszczonym z powodu naprężenia włókien strefowych. Kiedy mięśnie rzęskowe kurczą się, napięcie na soczewce jest zwalniane, co prowadzi do zmniejszenia średnicy równikowej soczewki i zwiększenia grubości osiowej. Związane z wiekiem zmiany w soczewce powodują starczowzroczność, postępującą utratę akomodacji soczewki, co prowadzi do konieczności noszenia okularów do czytania.
Kilka badań powiązało starczowzroczność z związanym z wiekiem wzrostem wewnętrznej sztywności soczewki6-11. Sztywność definiuje się jako wytrzymałość sprężystego obiektu na odkształcenie pod wpływem przyłożonego obciążenia. Do badania sztywności soczewek ludzkich zastosowano różne metody, w tym kompresję spinową12-14, kompresję siłownika15, wgłębienie sondy16, dynamiczną analizę mechaniczną 6,10 i pęcherzykową siłę promieniowania akustycznego17. Podczas gdy soczewki myszy nie dostosowują się ani nie rozwijają starczowzroczności, mysie modele patologii soczewek są cennymi narzędziami, ponieważ myszy są tańsze niż większe zwierzęta, dobrze scharakteryzowane genetycznie i ulegają przyspieszonym zmianom związanym z wiekiem z powodu szybkiego starzenia się. Kilka badań dotyczyło sztywności soczewek myszy za pomocą metod kompresji i wykazało zmiany sztywności soczewek spowodowane starzeniem się lub ukierunkowanymi zaburzeniami genetycznymi18-21. Dlatego soczewki myszy są dobrymi modelami do badania zmian sztywności soczewek związanych z wiekiem.
Ten protokół opisuje prostą i tanią, a jednocześnie precyzyjną i powtarzalną, metodę kompresji do określania sztywności soczewki myszy na podstawie nałożenia szklanych szkiełek nakrywkowych na soczewkę w połączeniu z fotografowaniem soczewki przez mikroskop separacyjny i lustro. Metoda ta pozwala uzyskać solidne dane dotyczące odkształceń i morfometrii za pomocą łatwej do wytworzenia i zmontowania aparatury. Reprezentatywne wyniki potwierdzają, że soczewki myszy zwiększają swoją sztywność wraz z wiekiem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals National Institutes of Health oraz zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee w The Scripps Research Institute.
1. Disekcja soczewki
- Uśmierć myszy zgodnie z zaleceniami zawartymi w National Institutes of Health "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" oraz zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt.
- Usuń gałkę oczną z oka myszy za pomocą zakrzywionej pęsety. Uciśnij tkanki wokół oka pęsetą, aby wypchnąć gałkę z oczodołu, a następnie wyciągnij ją pęsetą z oczodołu. Przenieś oczy do świeżego 1x roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w naczyniu do sekcji.
- Odetnij nerw wzrokowy jak najbliżej gałki ocznej. Delikatnie i ostrożnie wprowadź cienką prostą pęsetę do wnętrza gałki ocznej przez otwór, z którego nerw wzrokowy wychodzi z tylnej części oka.
- Ostrożnie wykonaj nożyczkami nacięcie gałki ocznej od strony tylnej aż do krawędzi rogówki. Soczewki gryzoni zajmują ok. 30% objętości oka. Wykonuj te nacięcia ostrożnie i nie wprowadzaj pęsety ani nożyczek zbyt głęboko do wnętrza oka, aby uniknąć uszkodzenia soczewki.
- Przetnij miejsce połączenia rogówki ze twardówką na co najmniej połowie obwodu gałki ocznej.
- Delikatnie uciśnij rogówkę, aby usunąć soczewkę z oka przez otwór wykonany w krokach 1.4 i 1.5.
- Używając prostej pęsety z cienkimi końcówkami, ostrożnie usuń wszelkie większe zanieczyszczenia, które nadal przylegają do soczewki. Przed przystąpieniem do pomiarów sztywności przeprowadź oględziny soczewki w celu sprawdzenia, czy nie jest uszkodzona.
2. Pomiary sztywności
- Za pomocą wagi analitycznej zważ co najmniej 10 szkiełek nakrywkowych z tego samego pudełka. Oblicz średnią masę szkiełek. Aby zapewnić spójność wyników, we wszystkich eksperymentach należy używać szkiełek z tego samego pudełka. Przed rozpoczęciem eksperymentów namocz szkiełka nakrywkowe oraz lustro kątowe w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 h.
- Wypełnij komorę pomiarową (patrz Rysunek 1) 65–75 ml 1x PBS. Komora pomiarowa została wykonana z pleksiglasu w wewnętrznym warsztacie mechanicznym, a wgłębienia w komorze zostały wykonane za pomocą wiertarki stołowej ustawionej na pożądaną głębokość z zastosowaniem odpowiedniego wiertła. Soczewki pozostają przezroczyste w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania badań mechanicznych.
Rycina 1: Komora pomiaru sztywności. Zdjęcie przedstawiające wymiary wykonanej na zamówienie komory pomiaru sztywności z różnymi wgłębieniami o różnej głębokości i kształcie. Okrągłe wgłębienia o głębokości 200 µm lub 300 µm (żółte groty strzałek) są wykorzystywane do pomiarów soczewek mysich. Wgłębienia mają 2 mm średnicy i znajdują się w odległości ~13 - 14 mm od krawędzi komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Umieść lustro kątowe w komorze w stałej odległości od wgłębienia, które będzie służyć do utrzymania soczewki. Upewnij się, że lustro nie przesuwa się podczas eksperymentu.
- Przenieś wypreparowane soczewki do komory pomiarowej, używając ostrożnie pęsety chwytnej lub pęsety zakrzywionej.
- Wykonaj zdjęcie soczewki nieobciążonej z góry, bezpośrednio z nad nią. Zdjęcia soczewek mysich wykonuj przy powiększeniu 30X, stosując oświetlenie z mikroskopu stereoskopowego (od dołu) oraz światłowodowe źródła światła po lewej i prawej stronie. Ustaw zasilacz światłowodowy na 80% maksymalnej intensywności światła. Dostosuj moc wyjściową zasilacza w zależności od oświetlenia otoczenia, preferencji użytkownika i jakości obrazu, jeśli jest to konieczne.
- Wykonaj zdjęcie soczewki nieobciążonej z widoku bocznego, widoczne poprzez lustro kątowe. Jeśli kamera nie jest skalibrowana, wykonaj zdjęcie krawędzi lustra w ostrości. Krawędź lustra ma długość 5 mm, a pomiar ten może zostać później wykorzystany do wyznaczenia liczby pikseli/mm i służyć jako pasek skali na obrazach.
- Umieść soczewkę we wgłębieniu i upewnij się, że jest ona osadzona stabilnie i prosto. Wykonaj zdjęcie soczewki przed obciążeniem. Soczewka powinna spoczywać we wgłębieniu na swoim biegunie przednim lub tylnym.
- Ostrożnie połóż 1 szkiełko podstawowe na soczewce. Odczekaj 2 min, aby umożliwić pełzanie, a następnie wykonaj kolejne zdjęcie soczewki obciążonej z widoku bocznego.
- Kontynuuj dodawanie szkiełek podstawowych zgodnie z krokiem 2.8 i wykonuj zdjęcia z widoku bocznego po dodaniu każdego szkiełka, jak opisano w kroku 2.8, aż do zastosowania łącznie 10 szkiełek.
- Usuń wszystkie szkiełka podstawowe. Odczekaj 2 min i wykonaj zdjęcie soczewki z widoku bocznego (wewnątrz i na zewnątrz wgłębienia) po usunięciu wszystkich szkiełek.
3. Pomiar jądra soczewki
- Aby określić rozmiar jądra soczewki, przenieś soczewkę do czystej szalki Petriego wypełnionej 1x PBS.
- Delikatnie usuń torebkę soczewki, używając cienkich pęsety prostych.
- Usuń komórki włókien korowych, obracając soczewkę między palcami w rękawiczkach. Pozostałe jądro soczewki będzie przypominać w dotyku twardą kulkę. Stosuj tę procedurę w celu wyizolowania jądra z soczewek osobników dorosłych powyżej 1. miesiąca życia. Ponieważ wyizolowane jądro jest ciałem sztywnym, dalsze badania mechaniczne jądra soczewki nie mogą być przeprowadzone przy użyciu opisanej metody.
- Delikatnie wypłucz jądro soczewki w 1x PBS w szalce Petriego.
- Umieść jądro soczewki z powrotem w komorze pomiarowej (poza zagłębieniem) i wykonaj zdjęcie jądra soczewki przez lustro kątowe.
Rysunek 2: Soczewki mysie poddane kompresji szkiełkami podstawowymi. (A) Schemat i (B) fotografia układu eksperymentalnego przedstawiająca soczewkę 2-miesięcznej myszy w zagłębieniu o głębokości 200-µm w komorze pomiarowej wypełnionej 1x PBS. Do gromadzenia obrazów soczewki podczas kompresji szkiełkami podstawowymi wykorzystano lustro prostokątne i kamerę cyfrową zamontowaną na mikroskopie sekcyjnym. (C) Zdjęcia widoków strzałkowych soczewki typu dzikiego 2-miesięcznej myszy, poddanej kompresji przez sukcesywnie zwiększającą się liczbę szkiełek podstawowych, dostarczyły surowych danych do pomiaru średnic osiowej i równikowej oraz obliczenia odkształceń osiowych i równikowych podczas testów kompresji z użyciem szkiełek podstawowych. W szkiełkach podstawowych czasem widoczne jest odbicie soczewki (najwyraźniej widoczne na obrazie z 1 szkiełkiem). Podczas dokonywania pomiarów należy zignorować odbicie i mierzyć do wierzchołka soczewki. (D) Zdjęcia widoków strzałkowych soczewki typu dzikiego 2-miesięcznej myszy po kompresji oraz wyizolowanego jądra soczewki. Soczewka po kompresji i wyizolowane jądro znajdują się poza zagłębieniem. Paski skali, 1 mm. Rysunek zmodyfikowano na podstawie Gokhin, et al. PloS one, 201219. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
4. Analiza obrazu
- Przed obciążeniem oraz po każdym etapie obciążania zmierz średnice równikowe i osiowe soczewek, korzystając z programu ImageJ lub podobnego oprogramowania. Zmierz średnicę jądra każdej soczewki. Jądro soczewki jest niemal sferyczne, więc pomiar w dowolnej orientacji będzie wystarczający19,21.
- Skoryguj osiowe średnice soczewek, dodając głębokość użytego wgłębienia. W komorze pomiarowej wgłębienie zasłaniało 200 µm (soczewki mysie 2-miesięczne) lub 300 µm (soczewki mysie 4- i 8-miesięczne) grubości osiowej soczewki.
- Oblicz odkształcenia osiowe i równikowe z pomiarów średnic soczewek, korzystając z równania ε = (d - d0) / d0, gdzie ε to odkształcenie, d to średnica osiowa lub równikowa przy danym obciążeniu, a d0 to odpowiadająca jej średnica osiowa lub równikowa przy zerowym obciążeniu.
- Przedstaw odkształcenia osiowe i równikowe jako funkcje przyłożonego obciążenia (w mg) na wykresie.
- Przedstaw na wykresie średnice osiowe, równikowe i jądrowe. Oblicz i przedstaw na wykresie współczynnik kształtu soczewki, dzieląc średnicę osiową przez średnicę równikową.
- Oblicz i przedstaw na wykresie objętość soczewki, korzystając z równania volume = 4/3 × π × rE2 × rA, gdzie rE to promień równikowy, a rA to promień osiowy zmierzony na zdjęciu wykonanym w kroku 2.6. Równanie to zakłada, że soczewka jest spłaszczoną sferoidą (elipsoidą)1,22.
- Oblicz i przedstaw na wykresie objętość jądra, korzystając z równania volume = 4/3 × π × rN3, gdzie rN to promień jądra soczewki zmierzony na zdjęciu wykonanym w kroku 3.5. Równanie to zakłada, że jądro soczewki jest sferą19,21.
- Oblicz i przedstaw na wykresie frakcję jądrową jako stosunek objętości jądra do objętości soczewki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zmierzono sztywność oraz wymiary soczewek mysich w wieku 2, 4 i 8 miesięcy. Wszystkie myszy były zwierzętami typu dzikiego w czystym szczepie C57BL6 pochodzącymi z TSRI Animal Breeding Facility, a na każdą soczewkę nałożono od 1 do 10 szkiełek podstawowych. Odkształcenia osiowe i równikowe obliczono jako funkcję przyłożonego obciążenia, mierząc średnice osiową i równikową soczewki po dodaniu każdego szkiełka, a następnie normalizując każdą zmianę średnicy do odpowiadającej jej średnicy w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tej metody do pomiaru sztywności soczewek. Najpierw szkiełka nakrywkowe nakłada się na soczewkę pod lekko skośnym kątem (8 - 8,5°) w stosunku do dna komory (θ). Spowoduje to zastosowanie bardzo małej składowej obciążenia równie, a nie osiowo. Jednak to obciążenie równikowe jest uważane za nieistotne, ponieważ sin θ ≈ 0,119. Jeśli ta metoda zostanie dostosowana do większych soczewek, kąt szkiełek nakrywkowych do dna komory będzie mu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) oraz National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kleszcze proste z cienką końcówką | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Nożyczki do mikrodysekcji, prosta krawędź | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Kleszcze zakrzywione | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Kleszcze chwytające | Hammacher | HSC 702-93 | Opcjonalne |
| naczynie preparacyjne | Fisher Scientific | 12565154 | |
| Szalka Petriego 60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| Szkiełka nakrywkowe szklane 18 x 18 mm | Fisher Scientific | 12-542A Komora pomiarowa | |
| z wgłębieniami do mocowania soczewek | Wykonane na zamówienie (patrz Rysunek 1) | ||
| Lustro kątowe | Edmund Optics | 45-591 | |
| Źródło światła | Schott/Fostec | 8375 | |
| Podświetlany mikroskop preparacyjny | Olympus | SZX-ILLD100 | Z fototubą SZ-PT |
| Aparat cyfrowy | Nikon | Coolpix 990 |
Bibliografia
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F. Elastic properties of the human lens. Exp Eye Res. 11 (1), 143(1971).
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. Mouse lens stiffness measurements. Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
