Sekwencyjne zastosowanie szkiełek nakrywkowych do oceny sztywności na ściskanie soczewki myszy: odkształcenia i analizy morfometryczne

Podsumowanie

Związany z wiekiem wzrost sztywności soczewek oka jest związany ze starczowzrocznością. Protokół ten opisuje prostą i ekonomiczną metodę pomiaru sztywności soczewek myszy. Soczewki myszy, podobnie jak soczewki ludzkie, z wiekiem stają się sztywniejsze. Ta metoda jest precyzyjna i może być dostosowana do soczewek większych zwierząt.

Streszczenie

Soczewka oka to przezroczysty organ, który załamuje i skupia światło, tworząc wyraźny obraz na siatkówce. U ludzi mięśnie rzęskowe kurczą się, aby zdeformować soczewkę, co prowadzi do wzrostu mocy optycznej soczewki do skupiania się na pobliskich obiektach, proces znany jako akomodacja. Związane z wiekiem zmiany w sztywności soczewek są związane ze starczowzrocznością, zmniejszeniem zdolności soczewki do akomodacji, a co za tym idzie, z potrzebą noszenia okularów do czytania. Mimo że soczewki myszy nie dostosowują się do starczowzroczności ani jej nie rozwijają, modele mysie mogą stanowić nieocenione narzędzie genetyczne do zrozumienia patologii soczewek, a przyspieszone starzenie się obserwowane u myszy umożliwia badanie zmian w soczewce związanych z wiekiem. Protokół ten demonstruje prostą, precyzyjną i ekonomiczną metodę określania sztywności soczewek myszy, wykorzystującą szklane szkiełka nakrywkowe do sekwencyjnego zwiększania obciążeń ściskających na soczewkę. Reprezentatywne dane potwierdzają, że soczewki myszy z wiekiem stają się sztywniejsze, podobnie jak soczewki ludzkie. Metoda ta jest wysoce powtarzalna i potencjalnie może być skalowana w celu mechanicznego testowania soczewek od większych zwierząt.

Wprowadzenie

Soczewka jest przezroczystym i beznaczyniowym organem w przedniej komorze oka, który jest odpowiedzialny za precyzyjne skupianie światła na siatkówce. Przezroczysta błona podstawna, zwana torebką soczewki, otacza większość wydłużonych komórek włóknistych pokrytych przednią monowarstwą komórek nabłonkowych^1,2. Wzrost soczewki przez całe życie zależy od ciągłej proliferacji i różnicowania komórek nabłonkowych na równiku soczewki w nowe komórki włókniste, które są dodawane do poprzednich generacji komórek włóknistych w sposób koncentryczny². Z biegiem czasu komórki włókien soczewkowych ulegają zagęszczeniu, w wyniku czego w środku soczewki powstaje sztywny środek zwany jądrem¹. Akomodacja, zdefiniowana jako zmiana dioptrii w mocy optycznej oka, występuje u ludzi, gdy mięśnie rzęskowe kurczą się, aby zdeformować soczewkę i umożliwić prawdziwy wzrost mocy optycznej w celu skupienia się na bliskich obiektach^3-5. W oku nieprzystosowanym soczewka jest utrzymywana w stanie stosunkowo spłaszczonym z powodu naprężenia włókien strefowych. Kiedy mięśnie rzęskowe kurczą się, napięcie na soczewce jest zwalniane, co prowadzi do zmniejszenia średnicy równikowej soczewki i zwiększenia grubości osiowej. Związane z wiekiem zmiany w soczewce powodują starczowzroczność, postępującą utratę akomodacji soczewki, co prowadzi do konieczności noszenia okularów do czytania.

Kilka badań powiązało starczowzroczność z związanym z wiekiem wzrostem wewnętrznej sztywności soczewki^6-11. Sztywność definiuje się jako wytrzymałość sprężystego obiektu na odkształcenie pod wpływem przyłożonego obciążenia. Do badania sztywności soczewek ludzkich zastosowano różne metody, w tym kompresję spinową^12-14, kompresję siłownika¹⁵, wgłębienie sondy¹⁶, dynamiczną analizę mechaniczną ^6,10 i pęcherzykową siłę promieniowania akustycznego¹⁷. Podczas gdy soczewki myszy nie dostosowują się ani nie rozwijają starczowzroczności, mysie modele patologii soczewek są cennymi narzędziami, ponieważ myszy są tańsze niż większe zwierzęta, dobrze scharakteryzowane genetycznie i ulegają przyspieszonym zmianom związanym z wiekiem z powodu szybkiego starzenia się. Kilka badań dotyczyło sztywności soczewek myszy za pomocą metod kompresji i wykazało zmiany sztywności soczewek spowodowane starzeniem się lub ukierunkowanymi zaburzeniami genetycznymi^18-21. Dlatego soczewki myszy są dobrymi modelami do badania zmian sztywności soczewek związanych z wiekiem.

Ten protokół opisuje prostą i tanią, a jednocześnie precyzyjną i powtarzalną, metodę kompresji do określania sztywności soczewki myszy na podstawie nałożenia szklanych szkiełek nakrywkowych na soczewkę w połączeniu z fotografowaniem soczewki przez mikroskop separacyjny i lustro. Metoda ta pozwala uzyskać solidne dane dotyczące odkształceń i morfometrii za pomocą łatwej do wytworzenia i zmontowania aparatury. Reprezentatywne wyniki potwierdzają, że soczewki myszy zwiększają swoją sztywność wraz z wiekiem.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych przez National Institutes of Health oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez Institutional Animal Care and Use Committee w Instytucie Badawczym Scripps.

1. Sekcja soczewki

1. Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z zaleceniami zawartymi w "Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" National Institutes of Health oraz zatwierdzonymi protokołami wykorzystania zwierząt przez instytucje.
2. Wyłuszczenie oka od myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy. Wciśnij tkankę wokół oka kleszczami, aby wyjąć oko z oczodołu, a następnie wyrwij oko z oczodołu za pomocą kleszczy. Przenieść oczy do świeżej 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w naczyniu rozwarstwiającym.
3. Odetnij nerw wzrokowy jak najbliżej gałki ocznej. Delikatnie i ostrożnie włóż cienką prostą pęsetę do gałki ocznej przez otwór, w którym nerw wzrokowy wychodzi z tyłu.
4. Ostrożnie wykonaj nacięcie nożyczkami w gałce ocznej od tyłu do krawędzi rogówki. Soczewki gryzoni zajmują ~30% oka. Wykonuj te nacięcia ostrożnie i nie wkładaj pęsety ani nożyczek zbyt głęboko w oko, aby uniknąć uszkodzenia soczewki.
5. Przeciąć wzdłuż skrzyżowania rogówki i twardówki co najmniej w połowie wokół gałki ocznej.
6. Delikatnie naciśnij rogówkę, aby wyjąć soczewkę z oka przez otwór wykonany w krokach 1.4 i 1.5.
7. Użyj prostych kleszczyków z cienką końcówką, aby ostrożnie usunąć wszelkie duże zanieczyszczenia, które są nadal przymocowane do obiektywu. Sprawdź wzrokowo soczewkę pod kątem uszkodzeń przed przystąpieniem do pomiarów sztywności.

2. Pomiary sztywności

1. Zważyć co najmniej 10 szkiełek nakrywkowych z tego samego pudełka za pomocą wagi analitycznej. Określ średnią wagę szkiełek nakrywkowych. Aby zachować spójność, do wszystkich eksperymentów używaj tego samego pudełka szkiełek nakrywkowych. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy wstępnie zwilżyć szkiełka nakrywkowe i lustro pod kątem prostym w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.
2. Napełnij komorę pomiarową (patrz rysunek 1) 65 - 75 ml 1x PBS. Komora pomiarowa została wykonana z pleksi przez własny warsztat mechaniczny, a wgłębienia w komorze zostały wykonane za pomocą wiertarki ustawionej na żądaną głębokość za pomocą odpowiedniego wiertła. Soczewki pozostają przezroczyste w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez czas trwania testów mechanicznych.

Rysunek 1: Komora pomiaru sztywności. Zdjęcie przedstawiające wymiary wykonanej na zamówienie komory pomiaru sztywności z różnorodnymi divotami o różnych głębokościach i kształtach. Okrągłe wgłębienia o głębokości 200 μm lub 300 μm (żółte groty strzałek) są używane do pomiarów na soczewkach myszy. Wgłębienia mają średnicę 2 mm i znajdują się w odległości ~13 - 14 mm od krawędzi komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Umieść lustro pod kątem prostym w komorze w stałej odległości od wgłębienia, które będzie używane do trzymania soczewki. Upewnij się, że lustro nie porusza się podczas eksperymentu.
4. Ostrożnie przenieś wypreparowane soczewki do komory pomiarowej za pomocą kleszczy chwytających lub zakrzywionych kleszczy.
5. Zrób zdjęcie z góry rozładowanego obiektywu bezpośrednio z góry. Rób zdjęcia obiektywu myszy w 30-krotnym powiększeniu z oświetleniem z mikroskopu preparacyjnego (na dole) i światłowodowym źródłem światła po lewej i prawej stronie. Ustaw zasilacz światłowodowy na 80% maksymalnego natężenia światła. Dostosuj moc wyjściową zasilacza w zależności od oświetlenia otoczenia, preferencji użytkownika i jakości obrazu zgodnie z potrzebami.
6. Zrób zdjęcie z boku nieobciążonej soczewki, którą można zobaczyć przez lustro pod kątem prostym. Jeśli aparat nie jest skalibrowany, zrób zdjęcie krawędzi lustra z ostrością. Krawędź lustra ma długość 5 mm, a pomiar ten może być później wykorzystany do określenia pikseli/mm i służyć jako pasek skali na obrazach.
7. Umieść soczewkę w wgłębieniu i upewnij się, że soczewka jest bezpiecznie i prosto osadzona w wgłębieniu. Zrób zdjęcie obiektywu przed załadowaniem. Soczewka powinna spoczywać w wgłębieniu na swoim przednim lub tylnym biegunie.
8. Delikatnie nałóż 1 szkiełko nakrywkowe na soczewkę. Odczekaj 2 minuty, aby umożliwić pełzanie, i zrób kolejne zdjęcie z boku załadowanego obiektywu.
9. Kontynuuj dodawanie szkiełek nakrywkowych jak w kroku 2.8 i robienie zdjęć z boku po dodaniu każdego szkiełka nakrywkowego, jak w kroku 2.8, aż do nałożenia łącznie 10 szkiełek nakrywkowych.
10. Usuń wszystkie szkiełka nakrywkowe. Odczekaj 2 minuty i zrób zdjęcie soczewki z boku (wewnątrz i na zewnątrz divot) po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych.

3. Pomiar jądra soczewki

1. Aby określić rozmiar jądra soczewki, przenieś soczewkę na czystą szalkę Petriego wypełnioną 1x PBS.
2. Delikatnie zdekapsuluj soczewkę za pomocą cienkich prostych kleszczyków.
3. Złuszcz komórki włókien korowych, zwijając soczewkę między palcami w rękawiczce. Pozostałe jądro soczewki będzie wyglądało jak twarda kulka. Użyj tej procedury, aby wyizolować jądro na soczewkach dorosłych, począwszy od 1 miesiąca życia. Ponieważ izolowane jądro jest ciałem sztywnym, dalsze badania mechaniczne jądra soczewki nie mogą być wykonywane przy użyciu tej opisanej metody.
4. Delikatnie przepłucz jądro soczewki w 1x PBS na szalce Petriego.
5. Umieść jądro soczewki z powrotem w komorze pomiarowej (nie we wgłębieniu) i zrób zdjęcie jądra soczewki przez lustro pod kątem prostym.

Rysunek 2: Soczewki myszy ściśnięte przez szkiełka nakrywkowe. (A) Schemat i (B) fotografia układu eksperymentalnego pokazującego 2-miesięczną soczewkę myszy w głębokim na 200 μm divocie w komorze pomiarowej wypełnionej 1x PBS. Lustro kątowe i kamera cyfrowa zamontowana na mikroskopie preparacyjnym zostały użyte do zebrania obrazów soczewki podczas ucisku przez szkiełka nakrywkowe. (C) Zdjęcia widoków strzałkowych 2-miesięcznej soczewki typu dzikiego ściskanej przez kolejno rosnącą liczbę szkiełek nakrywkowych dostarczyły surowych danych do pomiaru średnic osiowych i równikowych oraz obliczania odkształceń osiowych i równikowych podczas testów ściskania opartych na szkiełku nakrywkowym. Odbicie soczewki można czasami zobaczyć w szkiełkach nakrywkowych (najwyraźniej widoczne na zdjęciu 1 szkiełka nakrywkowego). Dokonując pomiarów, zignoruj odbicie i zmierz do wierzchołka soczewki. (D) Zdjęcia widoków strzałkowych 2-miesięcznej soczewki typu dzikiego po kompresji i izolowanego jądra soczewki. Soczewka po kompresji i izolowane jądro znajdują się na zewnątrz wgłębienia. Podziałka liniowa, 1 mm. Ten rysunek jest zmodyfikowany na podstawie Gokhin i wsp. PloS jeden, 2012¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Analiza obrazu

1. Zmierz średnice równikowe i osiowe soczewek przed załadowaniem i po każdym etapie ładowania za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania. Zmierz średnicę każdego jądra soczewki. Jądro soczewki jest prawie sferyczne, więc pomiar w dowolnej orientacji wystarczy^19,21.
2. Skoryguj średnice osiowe soczewki, dodając głębokość użytego wgłębienia. W komorze pomiarowej wgłębienie zasłaniało 200 μm (2-miesięczne soczewki mysie) lub 300 μm (4-miesięczne i 8-miesięczne soczewki mysie) grubości osiowej soczewki.
3. Oblicz odkształcenia osiowe i równikowe na podstawie pomiarów średnicy soczewki za pomocą równania ε = (d_{- d 0}) / d₀, gdzie ε jest odkształceniem, d jest średnicą osiową lub równikową przy danym obciążeniu, a d₀ jest odpowiednią średnicą osiową lub równikową przy zerowym obciążeniu.
4. Wykreślić odkształcenia osiowe i równikowe jako funkcje obciążenia przyłożonego (w mg).
5. Wykreśl średnicę osiową, równikową i jądrową. Oblicz i wykreśl współczynnik proporcji obiektywu, dzieląc średnicę osiową przez średnicę równikową.
6. Oblicz i wykreśl objętość soczewki za pomocą równania, objętość = 4/3 × π × r_E² × r_A, gdzie_{gdzie E} to promień równikowy, a r_A to promień osiowy mierzony na podstawie rysunku wykonanego w kroku 2.6. Równanie to zakłada, że soczewka jest spłaszczoną sferoidą (elipsoidą)^1,22.
7. Oblicz i wykreśl objętość jądra za pomocą równania, objętość = 4/3 × π × r_N³, gdzie_N jest promieniem jądra soczewki mierzonym na rysunku wykonanym w kroku 3.5. Równanie to zakłada, że jądro soczewki jest kulą^19,21.
8. Oblicz i wykreśl frakcję jądrową jako stosunek objętości jądra do objętości soczewki.

Wyniki

Zmierzono sztywność i wymiary soczewek myszy w wieku 2, 4 i 8 miesięcy. Wszystkie myszy były zwierzętami typu dzikiego na czystym tle szczepu C57BL6 uzyskanym z Zakładu Hodowli Zwierząt TSRI, a każda soczewka została załadowana od 1 do 10 szkiełkami nakrywkowymi. Odkształcenia osiowe i równikowe obliczono w funkcji przyłożonego obciążenia poprzez pomiar średnic osiowych i równikowych soczewki po dodaniu każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie normalizację każdej zmiany średnicy do odpo...

Dyskusja

Istnieje kilka kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tej metody do pomiaru sztywności soczewek. Najpierw szkiełka nakrywkowe nakłada się na soczewkę pod lekko skośnym kątem (8 - 8,5°) w stosunku do dna komory (θ). Spowoduje to zastosowanie bardzo małej składowej obciążenia równie, a nie osiowo. Jednak to obciążenie równikowe jest uważane za nieistotne, ponieważ sin θ ≈ 0,1¹⁹. Jeśli ta metoda zostanie dostosowana do większych soczewek, kąt szkiełek nakrywkowych do dna komory będzie mu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze proste z cienką końcówką	Fine Scientific Tools	11252-40
Nożyczki do mikrodysekcji, prosta krawędź	Fine Scientific Tools	15000-00
Kleszcze zakrzywione	Fine Scientific Tools	11272-40
Kleszcze chwytające	Hammacher	HSC 702-93	Opcjonalne
naczynie preparacyjne	Fisher Scientific	12565154
Szalka Petriego 60 mm	Fisher Scientific	0875713A
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Life Technologies	14190
Szkiełka nakrywkowe szklane 18 x 18 mm	Fisher Scientific	12-542A Komora pomiarowa
z wgłębieniami do mocowania soczewek			Wykonane na zamówienie (patrz Rysunek 1)
Lustro kątowe	Edmund Optics	45-591
Źródło światła	Schott/Fostec	8375
Podświetlany mikroskop preparacyjny	Olympus	SZX-ILLD100	Z fototubą SZ-PT
Aparat cyfrowy	Nikon	Coolpix 990