Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Podsumowanie

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Streszczenie

Dym papierosowy (CS) jest głównym czynnikiem ryzyka chorób układu krążenia i płuc. Ponieważ CS jest złożonym aerozolem zawierającym ponad 7000 substancji chemicznych¹, trudno jest ocenić udział poszczególnych składników w jego ogólnej toksyczności. Profile toksykologiczne poszczególnych składników, jak również mieszanin, można jednak ustalić in vitro, stosując wysokoprzepustowe narzędzia przesiewowe, które umożliwiają profilowanie szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC) dymu tytoniowego, zgodnie z definicją amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA). ^{cyfra arabska}

Do wstępnej oceny, użyto przyrządu opartego na impedancji, który w czasie rzeczywistym, bez etykietowania oceny toksyczności związku. Odczyt przyrządu opiera się na adhezji komórek, żywotności i morfologii, które razem zapewniają przegląd stanu komórki. Parametr bezwymiarowy, nazwany indeksem komórki, jest używany do kwantyfikacji. Opracowano zestaw różnych protokołów barwienia na potrzeby badania opartego na obrazowaniu fluorescencyjnym, a platformę HCS wykorzystano w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat rodzaju cytotoksyczności wywoływanej przez każdy HPHC.

Z 15 testowanych składników, tylko pięć zostało wybranych do analizy opartej na HCS, ponieważ zarejestrowały one obliczalną LD₅₀ (< 20 mM). Należały do nich 1-aminonaftalen, arsen (V), chrom (VI), aldehyd krotonowy i fenol. Na podstawie ich wpływu na HCS, 1-aminonaftalen i fenol mogą być zidentyfikowane jako wywołujące dysfunkcję mitochondriów, a wraz z chromem (VI) jako genotoksyczne w oparciu o zwiększoną fosforylację histonów H2AX. Aldehyd krotonowy został zidentyfikowany jako induktor stresu oksydacyjnego, a arsen jako aktywator szlaku kinazy stresowej.

To badanie pokazuje, że połączenie technologii opartych na impedancji i HCS dostarcza solidnego narzędzia do oceny in vitro składników CS.

Wprowadzenie

Ocena ryzyka toksykologicznego historycznie opierała się na wykorzystaniu modeli zwierzęcych, które, choć fundamentalne w naukach przyrodniczych, są również związane z niedociągnięciami, takimi jak niespójna przekładalność na ludzi i wysokie koszty. Co więcej, coraz częściej dąży się do znalezienia alternatyw dla testów na zwierzętach w duchu "3R"² (wymiana, redukcja i udoskonalenie). Wysiłki te zostały przyspieszone w ciągu ostatnich kilku lat, nie tylko ze względu na niedawne postępy, takie jak techniki wysokoprzepustowe i podejścia biologii systemowej, ale także ze względu na prawodawstwo ograniczające stosowanie testów na zwierzętach, zwłaszcza w Unii Europejskiej.

Złożoność komórkowych szlaków sygnałowych regulujących reakcję na toksyczne obelgi sprawia, że oczywiste jest, że użycie pojedynczych toksykologicznych punktów końcowych nie będzie wystarczające do opisania toksykologicznych podstaw niektórych związków. W tym celu należy również wziąć pod uwagę wzajemne oddziaływanie setek oddziałujących ze sobą białek przyczyniających się do sieci biologicznej. Aby zbadać wpływ substancji toksycznych na te sieci, przydatne jest podejście toksykologiczne systemowe w połączeniu z fenotypowymi średnio- i wysokoprzepustowymi testami przesiewowymi, aby wywnioskować potencje i jednocześnie dostarczyć więcej informacji na temat mechanizmu działania poszczególnych substancji toksycznych.

W tym badaniu wykorzystaliśmy HCS jako potężne narzędzie do badań przesiewowych, które składa się z automatycznego mikroskopu i aplikacji biologicznej, która może pozyskiwać, przetwarzać i analizować dane obrazowe pochodzące z określonych testów komórkowych opartych na fluorescencji. Pozwala to na ilościowe określenie zmian wizualnych w komórce, na poziomie pojedynczej komórki lub subkomórki, a także na jednoczesną analizę wielu parametrów. ³ Na przykład pęknięcia dwuniciowych DNA oceniano za pomocą identyfikacji fosforylacji histonu H2AX na podstawie przeciwciał, a reaktywne formy tlenu (ROS) określono ilościowo za pomocą przepuszczalnego dla komórek barwnika wrażliwego na ponadtlenek.

Ponieważ komórki nabłonka płuc stanowią pierwszą biologiczną barierę przed wdychanymi toksynami, w tym dymem papierosowym, wykorzystaliśmy pierwotne komórki nabłonka oskrzeli jako model in vitro do profilowania wpływu HPHC opublikowanego przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków. ⁴ Niniejszy manuskrypt jest kontynuacją poprzedniego badania⁵, w którym oceniliśmy biologiczny wpływ innego podzbioru HPHC.

W ramach naszego przepływu pracy do oceny cytotoksyczności in vitro, początkowo oceniliśmy potencje wybranych 15 HPHC, używając systemu analizy komórkowej w czasie rzeczywistym opartego na impedancji (RTCA), który pozwolił nam ustalić zakresy dawek, odpowiednie do późniejszej analizy HCS (Rysunek 1). Następnie przeprowadzono toksykologiczną ocenę HCS przy użyciu dziewięciu wieloparametrycznych punktów końcowych toksyczności komórkowej, z których każdy był monitorowany w dwóch punktach czasowych (4 i 24 godziny). Zastosowane markery wskazywały na toksyczność mitochondrialną, uszkodzenia DNA, kinazę stresową, reaktywne formy tlenu (ROS), zawartość glutationu (GSH), aktywność kaspazy 3 - 7, uwalnianie cytochromu C i przepuszczalność błon komórkowych, jak opisano w tabeli 1.

Nasze podejście umożliwiło identyfikację i scharakteryzowanie wpływu składników dymu papierosowego poprzez pobieranie próbek zależne od dawki i czasu. Ostatecznie uzyskano w ten sposób profil toksykologiczny in vitro dla każdego HPHC. Podejścia multiomiczne mogą być również stosowane w celu dalszego uzupełnienia analizy HCS. Pozwoliłoby to również na głębsze zrozumienie efektów na poziomie sygnalizacji komórkowej i/lub transkrypcji.

Protokół

1. Pobieranie normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (NHBE)

1. Podgrzej wstępnie pożywkę do hodowli komórkowych (pożywkę uzupełnioną pożywką do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli), HEPES, trypsynę i roztwór neutralizujący trypsynę (TNS) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
2. Zbierz komórki, gdy zostanie osiągnięte 80% konfluencji.
   UWAGA: W celu uzyskania optymalnej konfluencji w niepowlekanych kolbach T75 z 20 ml pożywki można zastosować następujące warunki wysiewu kultur komórkowych NHBE:
   1. Nasiona 1 x 10⁶ komórek do hodowli 3-dniowej, 0,5 x 10⁶ komórek do hodowli 4-dniowej i 0,25 x 10⁶ komórek do hodowli 5-dniowej. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, gdy komórki są w hodowli, aby odświeżyć składniki odżywcze. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ .
3. Usunąć supernatant z kolby(-i) (kolb) i dodać HEPES w celu przepłukania komórek (np. 3 ml na kolbę o średnicy 75^cm2). Obrócić każdą kolbę, aby pokryć monowarstwę komórek roztworem HEPES.
4. Usunąć roztwór HEPES i dodać roztwór trypsyny (np. 3 ml na kolbę o średnicy 75^cm2). Obrócić kolbę, aby pokryć monowarstwę komórek roztworem trypsyny.
5. Inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 ± 2 °C. Monitorować odrywanie komórek pod mikroskopem i, jeśli to konieczne, inkubować dłużej i delikatnie postukać w kolbę, aby uwolnić pozostałe przyłączone komórki.
6. Dodać TNS w celu zatrzymania reakcji (np. 3 ml dla kolby o średnicy 75^cm2) i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
7. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 × g przez 5 minut.
8. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml świeżej pożywki, delikatnie mieszając w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek.
9. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μM, aby usunąć agregaty i policzyć komórki. Uwaga: W naszym laboratorium zastosowano wielokanałowy system zliczania komórek w polu elektrycznym do precyzyjnej i spójnej oceny liczby komórek żywotnych.

2. Wyszukiwanie zakresu dawek (DRF) oparte na analizatorze komórek w czasie rzeczywistym (RTCA)

UWAGA: System pomiarowy oparty na impedancji został wykorzystany do: 1) oceny toksyczności związków, 2) wyboru związków do dalszych badań przez HCS oraz 3) doboru odpowiednich dawek dla HCS. Komórki NHBE w płytkach RCTA dozuje się przez dodanie 25 μl rozcieńczeń badanego związku do 100 μl pożywki obecnej w każdym dołku. Dlatego wszystkie roztwory testowe przygotowuje się przy 5-krotności (5x) pożądanego stężenia końcowego.

1. Wysiewanie komórek NHBE
   1. Zaprogramuj przyrząd tak, aby zdefiniował liczbę i czas trwania pomiarów impedancji. W tym badaniu dane rejestrowano co 15 minut przez 48 godzin (od 24 godzin ± 2 godzin przed i 24 godziny po podaniu komórkom środków testowych).
   2. Zmierzyć tło płytki, pipetując 50 μl wstępnie podgrzanego podłoża do każdego dołka 96-dołkowej płytki RTCA. Uwaga: Ten etap stanowi wymóg techniczny dla przyrządu do obliczania ośrodka oporu elektrycznego, który jest następnie wykorzystywany jako punkt odniesienia dla obliczeń opartych na komórkach.
   3. Przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 144 000 komórek/ml (± 5%) i dodać 50 μl zawiesiny komórek (7 200 komórek/basenik) do każdego dołka płytki RTCA, do której dodano już 50 μl/studzienkę pożywki do pomiaru tła instrumentu.
   4. Pozwól komórkom przylegać przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem ich w kołysce RTCA (w celu poprawy jednorodnego rozmieszczenia komórek). Inkubować płytki RTCA w kołysce RTCA w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 )} i rozpocząć rejestrowanie danych przez następne 24 ± 2 godziny przed podaniem.
2. Rozcieńczenia HPHC i kontrole dodatnie
   1. Rozcieńczenie kontroli dodatniej
      1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy staurosporyny (10 mM) w stosunku 1:10 w DMSO (patrz Tabela 3) i dodać 5 μl rozcieńczenia do 195 μl pożywki, aby otrzymać 5-krotny roztwór roboczy.
   2. Rozcieńczenie HPHC
      1. Rozpuścić/rozcieńczyć każdy HPHC w nośniku (tabela 2) w celu wytworzenia 1 M roztworu podstawowego. Rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy HPHC w stosunku 1:10 w pożywce, aby uzyskać roztwór o stężeniu 100 mM.
      2. Wygeneruj "złożoną płytkę wzorcową", wykonując pięcioetapowe seryjne rozcieńczanie 1:10 przy użyciu pożywki + 10% nośnika, aby uzyskać 5-krotne roztwory robocze (rysunek 2). Uwaga: Docelowo końcowe dawki wynoszą: 0,2 μM, 2 μM, 20 μM, 0,2 mM, 2 mM, 20 mM. Na tym etapie należy również przygotować dawkę 0, odpowiadającą jedynemu nośnikowi.
   3. Dawkowania
      1. Zatrzymaj instrument RTCA i otwórz podstawkę, aby wyjąć płytkę.
      2. Wyjmij płytkę i umieść ją w narzędziu do pomiaru temperatury płytki RTCA (przeznaczonym do stabilizacji temperatury płytki RTCA podczas procedur eksperymentalnych poza stacją RTCA), aby uniknąć wychłodzenia ogniw, co mogłoby wpłynąć na pomiar impedancji.
      3. Dodać 25 μl 5x roztworu z "płytki wzorcowej związku" do komórek w trzech powtórzeniach, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce głównej (najwyższa dawka w górnym rzędzie i kontrola nośnika w wierszu numer 7) (rysunek 2). Nie usuwaj istniejącego (100 μl) podłoża do hodowli komórkowych.
      4. Dodać 25 μl 5x roztworu kontroli dodatniej do komórek w dolnym rzędzie (do połowy po prawej) bez usuwania istniejącej pożywki hodowlanej. Dodać 25 μl pożywki do komórek w dolnym rzędzie (do połowy po lewej) bez usuwania istniejącej pożywki do hodowli komórkowych.
      5. Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt. Umieść płytkę z powrotem w podstawce RTCA i zablokuj ją. Uruchom ponownie rejestrowanie danych dla żądanego czasu ekspozycji (np. 24 godziny). Uwaga: Zaleca się stosowanie tej folii uszczelniającej, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia, w tym zanieczyszczenia krzyżowego między studniami.
   4. Analiza danych Obliczenia RTCA i LD₅₀
      1. Eksportuj nieprzetworzone dane jako plik tekstowy (.txt) lub Excel (.xls). Uwaga: Plik będzie zawierał wszystkie informacje dotyczące układu płytki (związki, dawki i położenie studzienki). Wartości surowych indeksów komórek są zorganizowane w formacie 96-dołkowym (lustrzany rozkład dołków płytkowych) i są podawane dla każdego punktu czasowego, w którym miało miejsce nagranie. Wartość w pozycji i w płytce 96-dołkowej w czasie t jest oznaczona przez CI_t(i).
      2. Jako odniesienie normalizacyjne należy określić ostatni punkt czasowy przed dawkowaniem dla każdej pozycji i na płytce 96-dołkowej (np. Indeks komórek po 23 godzinach 50 min 00 sekundach w pozycji i, CI_t(i) _{= 23:50:00} =_{CI Ref}(i)). Uwaga: Informacje te muszą być opatrzone adnotacją podczas dawkowania.
      3. Podzielić, na podstawie studzienki, wszystkie wartości punktu czasowego przez odniesienie normalizacji, aby znormalizować wszystkie wartości w czasie dozowania. Znormalizowana wartość w pozycji i w płytce 96-dołkowej w czasie t jest oznaczona przez NCI_t(i), a zatem jest zdefiniowana przez NCI_t(i) = CI_t(i) / CI_Ref(i) dla wszystkich t.
      4. Obliczyć pole pod krzywą (AUC) po 24 godzinach po podaniu dla każdej próbki i (pozycja i na płytce 96-dołkowej), łącznie z miejscami kontroli dodatniej i nośnika.
         1. Uzyskać AUC w pozycji i uzyskuje się przez zsumowanie powierzchni każdego prostokąta, przy czym każdy prostokąt znajduje się między dwoma punktami czasowymi oznaczonymi przez t_k i t_l (t_k l); obliczyć każdy obszar prostokąta za pomocą x*y, gdzie x = t_l- t_k jest odległością między dwoma punktami czasowymi, a y jest średnią aktywności dwóch punktów czasowych (y = (NCI_tk(i) + NCI_tl(i)) / 2).
            Uwaga: AUC po 24 godzinach po podaniu dawki dla pozycji i jest oznaczone przez AUC(i). Ponieważ wszystkie warunki są posiewane w trzech dołkach, stosuje się medianę trzech wartości.
      5. Znormalizuj wartości, używając następującego równania:
         
         gdzie i jest pozycją w płytce 96-dołkowej, dla której obliczono AUC po 24 godzinach od podania,
         Nośnik oznacza medianę wartości AUC dla studzienek nośnika na tabliczce po 24 godzinach po podaniu,
         Kontrola dodatnia jest medianą wartości AUC dla studzienek kontroli dodatniej na płytce po 24 godzinach od podania dawki,
         CR jest pożądaną medianą znormalizowanej wartości dla pojazdu (0%), a
         SC jest pożądaną medianą znormalizowanej wartości dla kontroli dodatnich (-100%)
         UWAGA: Na końcu tego kroku uzyskuje się zestaw danych, który zawiera, dla każdej pozycji i w płytce 96-dołkowej, stężenie ci (w jednostkach logarytmicznych), które stosuje się do próbki zawartej w pozycji i i i odpowiadające jej znormalizowane AUC po 24 godzinach po podaniu AUC_normalized(i).
      6. Wykreślić i dopasować wartości (c_{, i}, AUC_normalized(i)) za pomocą 4-parametrowego równania Hilla. Jeśli to możliwe, oblicz również LD₅₀.
         
         gdzie Y = AUC_normalized,
         Aktywność zerowa S₀ = poziom aktywności przy zerowym stężeniu badanego związku,
         Nieskończona aktywność S_inf = poziom aktywności przy nieskończonym stężeniu,
         AC50 = Stężenie, przy którym aktywność osiąga 50% maksymalnego poziomu,
         Współczynnik nachylenia n = Miara nachylenia przy AC50 i
         c = stężenie w jednostkach logarytmicznych odpowiadające wartościom na osi x wykresu krzywej dawka-odpowiedź.
         UWAGA: AC50 odpowiada LD₅₀ (testy cytotoksyczności). Jest to miara mocy, w której niskie wartości wskazują na wysoką moc.

3. Pomiar efektów toksykologicznych za pomocą HCS

UWAGA: Za pomocą platformy HCS mierzy się łącznie dziewięć wieloparametrycznych markerów toksyczności, pogrupowanych w sześć różnych testów. Na podstawie analizy żywotności komórek RTCA (sekcja 2) określono zakres dawek dla każdego składnika i uwzględniono również dawkę referencyjną 3R4F. Dawka referencyjna jest równoważna ilości HPHC obecnej w dymie z jednego wkładu z papierosa referencyjnego 3R4F.

1. Wysiewanie komórek NHBE
   1. Przygotuj zawiesinę komórkową o stężeniu 120 000 komórek/ml (± 5%) i dodaj 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki HCS (12 000 komórek/dołek). Przygotuj wystarczającą ilość płytek do oceny wszystkich testów (cytotoksyczność, uszkodzenie DNA, kinaza stresowa, ROS, zawartość GSH i apoptoza) i punktów czasowych (4 i 24 godziny).
   2. Pozostawić płytki HCS w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do studzienek, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 ± 2 godziny przed podaniem.
2. Rozcieńczanie HCHP i kontroli dodatnich
   UWAGA: Komórki NHBE w płytkach HCS zostaną dozowane przez dodanie 25 μl roztworów próbek testowych do 100 μl pożywki już obecnej w każdym dołku. Dlatego wszystkie dawki są przygotowywane przy 5-krotnym pożądanym stężeniu końcowym.
   1. Rozcieńczenie kontroli dodatnich (płytka kontroli dodatniej)
      1. Dozować 40 μl roztworu podstawowego każdej kontroli dodatniej (patrz Tabela 3) w kolumnie # 2 (Rysunek 4a, studzienki zacienione na czerwono). Dozować 20 μl nośnika w kolumnach # 3 i # 5 (rysunek 4a, studzienki zacienione na jasnoniebieskim kolorze) i 40 μl nośnika w kolumnie # 4 (rysunek 4a, studzienki zacienione na jasnoniebieski
      ).
      2. Pobrać 12 μl z dołków w kolumnie # 2, dozować do studzienek w kolumnie # 3 i wymieszać (rysunek 4b), kontynuować aż do uzyskania końcowego seryjnego rozcieńczenia 3 dawkami (d1, d2 i d3) i nośnikiem (V) dla każdego związku kontroli dodatniej (rysunek 4c). Aby wytworzyć płytkę kontroli dodatniej, należy przygotować rozcieńczenie związków w pożywce w stosunku 1:40 (rysunek 4d).
   2. Rozcieńczanie HPHC (złożona płyta główna)
      UWAGA: Wybrane zakresy dawek HPHC dla HCS są wymienione w Tabeli 2.
      1. Rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy HPHC (1 M) w stosunku 1:10 w pożywce do stężenia 100 mM. Wykonać rozcieńczenia przy użyciu pożywki z 10% podłożem, aby uzyskać wybrane 5 dawek dla każdego HPHC.
3. Dawkowania
   1. Dodać 25 μl 5 x roztworów z płytki wzorcowej do komórek w trzech powtórzeniach, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce wzorcowej (najwyższa dawka w górnym rzędzie i kontrola nośnika w wierszu numer 7) (rysunek 5). Nie usuwaj istniejącego (100 μl) podłoża do hodowli komórkowych.
   2. Dodać 25 μl 5x roztworu z płytki kontroli dodatniej do komórek w dolnym rzędzie, zachowując tę samą kolejność dawkowania, co na płytce kontroli dodatniej (ryc. 5). Nie usuwaj istniejącego (100 μl) podłoża do hodowli komórkowych. Uwaga: Każdy test ma określoną kontrolę dodatnią; patrz tabela 3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez żądany czas ekspozycji (4 lub 24 godziny).
4. Barwienia
   1. Przygotowanie do wszystkich testów
      1. Roztwory buforu płuczącego (PBS) należy wstępnie podgrzać w temperaturze 37 °C.
      2. Przygotować roztwór utrwalający (4% roztwór formaldehydu), dodając 10,81 ml 37% formaldehydu do 89,19 ml buforu do płukania i podgrzać go w temperaturze 37 °C.
      3. Przygotować bufor permeabilizacyjny, dodając 10 ml 10-krotnego buforu do przemywania 90 ml buforu do przemywania i wstępnie ogrzać go w temperaturze 37 °C.
      4. Przygotować bufor blokujący, dodając 10 ml 10-krotnego buforu blokującego do 90 ml buforu do przemywania i wstępnie ogrzać go w temperaturze 37 °C.
      5. Podgrzej wstępnie pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
      6. Po osiągnięciu 4 i 24 godzinnych czasów ekspozycji należy wyjąć płytki HCS z inkubatora i wykonać następujące szczegółowe protokoły dla każdego testu.
   2. Test cytotoksyczności
      1. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu do barwienia żywych komórek zgodnie z następującym wzorem: Objętość podłoża (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek)
      2. Rozcieńczyć barwnik mitochondriów w roztworze do barwienia żywych komórek zgodnie z instrukcją dostawcy. Rozcieńczyć barwnik przepuszczalności błony w roztworze do barwienia żywych komórek zgodnie z instrukcją dostawcy.
      3. Dodać 50 μl roztworu do barwienia żywych komórek do każdego dołka na płytce (płytkach) oznaczonej jako "test cytotoksyczności". NIE usuwaj pożywki do hodowli komórkowych i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
      4. Delikatnie zassać pożywkę i roztwór barwiący i dodać 100 μl/studzienkę roztworu utrwalającego do każdej studzienki, a następnie inkubować płytkę (płytki) przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      5. Delikatnie odessać roztwór utrwalający i przemyć raz 100 μl/dobrze przepłukać buforem do płukania.
      6. Usunąć bufor do przemywania i dodać 100 μl/studzienkę 1x bufor permeabilizacyjny do każdej studzienki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      7. Odessać bufor permeabilizacyjny i dwukrotnie przemyć płytkę 100 μl/studzienkę buforu do płukania.
      8. Odessać bufor do przemywania i dodać 100 μl 1x buforu blokującego do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      9. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zgodnie z następującym wzorem: Objętość buforu blokującego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek). Rozcieńczyć przeciwciało anty-cytochromu C (mysz) w stosunku 1:250 w roztworze przeciwciała pierwotnego.
      10. Odessać bufor blokujący i dodać 50 μl/dołek roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      11. Przygotować wystarczającą objętość (V) przeciwciała drugorzędowego i roztworu jądrowego zgodnie z następującym wzorem: Objętość buforu blokującego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek). Rozcieńczyć przeciwciało przeciw myszom w stosunku 1:500 w przeciwciałie drugorzędowym i roztworze jądrowym. Rozcieńczyć barwnik jądrowy w stosunku 1:1,000 w przeciwciałie wtórnym i roztworze jądrowym.
      12. Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć płytkę trzykrotnie 100 μl/studzienkę buforu do przemywania za pomocą podkładki do płytek.
      13. Odessać bufor do przemywania i dodać 50 μl/basenik przeciwciała wtórnego i roztworu jądrowego do każdego dołka płytki (płytek) i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      14. Odessać przeciwciało wtórne i roztwór jądrowy i przemyć płytkę trzykrotnie 100 μl/studzienkę buforu do przemywania za pomocą podkładki do płytek. Dodać 100 μl/studzienkę buforu do płukania. Płytka (płyty) jest (są) teraz gotowa do oceny na czytniku HCS.
   3. Test uszkodzeń DNA
      1. Delikatnie odessać pożywkę z płytek oznaczonych jako "uszkodzenie DNA".
      2. Wykonaj te same czynności, jak opisano w kolejności: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Zwróć uwagę, że w tym przypadku w kroku 3.4.2.4 usuwane jest tylko medium.
      3. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zgodnie z następującym wzorem: Objętość buforu blokującego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek)
      4. Rozcieńczyć przeciwciało anty-fosfo H2AX (mysz) w stosunku 1:2,000 w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego.
      5. Wykonaj ten sam krok, jak opisano w 3.4.2.10.
      6. Przygotować wystarczającą objętość (V) przeciwciała drugorzędowego i roztworu jądrowego zgodnie z następującym wzorem: Objętość buforu blokującego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek)
      7. Rozcieńczyć przeciwciało przeciw myszom w stosunku 1:500 w przeciwciałie drugorzędowym i roztworze jądrowym.
      8. Rozcieńczyć barwnik jądrowy w stosunku 1:1,000 w przeciwciałie wtórnym i roztworze jądrowym.
      9. Wykonaj te same czynności, jak opisano w sekwencji: 3.4.2.12-3.4.2.14.
   4. Test kinazy stresowej
      1. Delikatnie odessać pożywkę z każdej z płytek oznaczonych jako "Kinaza Stresu".
      2. Wykonaj te same czynności, jak opisano w kolejności: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Zwróć uwagę, że w tym przypadku w kroku 3.4.2.4 usuwane jest tylko medium.
      3. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zgodnie z następującym wzorem: Objętość buforu blokującego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek)
      4. Rozcieńczyć przeciwciało anty-fosfo cJun (królik) w stosunku 1:200 w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego.
      5. Wykonaj ten sam krok, jak opisano w 3.4.2.10.
      6. Przygotować wystarczającą objętość (V) przeciwciała drugorzędowego i roztworu jądrowego zgodnie z następującym wzorem: Objętość buforu blokującego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek)
      7. Rozcieńczyć przeciwciało anty-królicze w stosunku 1:500 w przeciwciałie drugorzędowym i roztworze jądrowym.
      8. Rozcieńczyć barwnik jądrowy w stosunku 1:1,000 w przeciwciałie wtórnym i roztworze jądrowym.
      9. Wykonaj te same czynności, jak opisano w sekwencji: 3.4.2.12-3.4.2.14.
   5. Test ROS
      1. Przygotować odpowiednią objętość (V) roztworu do barwienia żywych komórek według następującego wzoru: Objętość podłoża (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek).
      2. Rozcieńczyć barwnik ROS w roztworze do barwienia żywych komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy
      3. Rozcieńczyć barwnik jądrowy w stosunku 1:1,000 w roztworze do barwienia żywych komórek.3.4.5.4) Dodać 50 μl roztworu do barwienia żywych komórek do każdej płytki studzienki oznaczonej "ROS"; NIE WOLNO wyjmować pożywki do hodowli komórkowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      4. Delikatnie odessać podłoże i roztwór barwiący, a następnie trzykrotnie umyć płytkę 100 μl/dożylną pożywkę.
      5. Odessać pożywkę, dodać 100 μl/dołek roztworu utrwalającego do każdej studzienki i inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      6. Delikatnie odessać roztwór utrwalający i trzykrotnie umyć płytkę buforem o stężeniu 100 μl/studzienkę.
      7. Dodać 100 μl/dobrze przemywać bufor. Talerz(e) jest(są) już gotowy.
      8. Oceń tabliczkę na czytniku HCS w ciągu 1 godziny.
   6. Test zawartości GSH
      1. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu do barwienia jądrowego żywych komórek według następującego wzoru: Objętość pożywki (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek).
      2. Rozcieńczyć barwnik jądrowy (daleka czerwień) w stosunku 1:1,000 w roztworze do barwienia jądrowego żywych komórek.3.4.6.3). Dodać 50 μl roztworu do barwienia jądrowego żywych komórek do każdego dołka z płytek oznaczonych "Zawartość GSH". NIE WOLNO usuwać pożywki do hodowli komórkowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
      3. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu barwiącego GSH z żywymi komórkami zgodnie z następującym wzorem: Objętość HBSS (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek)
      4. Rozcieńczyć barwnik GSH w roztworze barwiącym GSH na żywo zgodnie z instrukcjami dostawcy.
      5. Delikatnie odessać pożywkę i roztwór do barwienia jądrowego, a następnie trzykrotnie umyć płytkę 100 μl/studzienkę.
      6. Odessać pożywkę i dodać 100 μl/dołek roztworu barwiącego GSH z żywych komórek do każdego dołka płytki (płytek).
      7. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Talerz(e) jest(są) już gotowy.
      8. Oceń płytkę (płytki) w czytniku HCS w ciągu 1 godziny.
   7. Test apoptozy
      1. Przygotować odpowiednią objętość (V) roztworu do barwienia żywych komórek według następującego wzoru: Objętość podłoża (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek).
      2. Rozcieńczyć barwnik kaspazy w stosunku 1:300 w roztworze do barwienia żywych komórek.
      3. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych, dodać 50 μl roztworu do barwienia żywych komórek do każdej studzienki na płytce (płytkach) oznaczonej jako "apoptoza" i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
      4. Przygotować wystarczającą objętość (V) roztworu do barwienia jądrowego żywych komórek zgodnie z następującym wzorem: Objętość roztworu utrwalającego (μl) V = 50 x W x 1,2 (W Liczba studzienek).
      5. Rozcieńczyć barwnik jądrowy w stosunku 1:1,000 w roztworze do barwienia jądrowego żywych komórek.
      6. Usunąć roztwór do barwienia żywych komórek, dodać 100 μl/studzienkę roztworu do barwienia jądrowego żywych komórek do każdego dołka na płytce (płytkach) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      7. Odessać roztwór utrwalający/barwnika jądrowego i przemyć płytkę (płytki) trzykrotnie buforem do płukania 100 μl/studzienkę.
      8. Dodać 100 μl/dobrze przemywać bufor. Talerz(e) jest(są) już gotowy.
      9. Oceń płytkę (płytki) w czytniku HCS.
5. Analiza danych HCS
   1. Eksportuj surowe dane jako plik Excela (.xls). Uwaga: Wartości indeksu surowych komórek są zorganizowane w formacie 96 dołków (lustrzany rozkład dołków płytkowych) i są podawane dla każdego punktu końcowego w danym punkcie czasowym po dozowaniu.
   2. Znormalizuj wartości, używając następującego równania:
      
      gdzie i jest zmierzoną wartością sygnału surowego studni,
      Pojazd to mediana zmierzonych wartości sygnału dla studzienek pojazdu na tabliczce,
      CR jest pożądaną medianą znormalizowanej wartości dla pojazdu (0%), a
      SC jest pożądaną medianą znormalizowanej wartości dla kontroli dodatnich (100),
      UWAGA: Na końcu tego kroku uzyskuje się zestaw danych, który zawiera, dla każdej pozycji i w płytce 96-dołkowej, stężenie c_i (w jednostkach logarytmicznych), które zostało zastosowane do próbki zawartej w pozycji/basenie i odpowiadającego mu znormalizowanego sygnału N(i).
   3. Wykreślić i dopasować wartości (c_i, N(i)) za pomocą 4-parametrowego równania Hilla.
      
      gdzie Aktywność zerowa S₀ = poziom aktywności przy zerowym stężeniu badanego związku,
      Nieskończona aktywność S_inf = poziom aktywności przy nieskończonym stężeniu,
      AC50 = Stężenie, przy którym aktywność osiąga 50% maksymalnego poziomu,
      Współczynnik nachylenia n = Miara nachylenia przy AC50 i
      c = stężenie w jednostkach logarytmicznych odpowiadające wartościom na osi x wykresu krzywej dawka-odpowiedź.
      UWAGA: AC50 to miara mocy, w której niskie wartości wskazują na wysoką moc.

Wyniki

RTCA

Ponieważ punkty końcowe HCS nie będą informacyjne, gdy nie zostanie wykryty efekt toksyczny, te związki, które nie wykazują zmniejszonej żywotności komórek do najwyższego stężenia w RCTA, nie są testowane przez HCS (Rysunek 3b,c,d,g,k,l,m,p). Związki wykazujące zmniejszoną żywotność komórek tylko przy najwyższym stężeniu (ryc. 3e,o) są również odznaczone dla HCS. Na koniec do dalszej analizy HCS wybierane są tylko składniki o obliczalnym LD₅₀ (< 20 mM) (Rysunek 3a,f,h,j,n). HPHC spełniające powyższe kryteria to: 1-aminonaftalen, Arsen (V), Chrom (VI), Aldehyd krotonowy i Fenol.

HCS

Jako kontrola jakości (QC), najpierw analizowane są kontrole pozytywne, aby upewnić się, że procedura barwienia jest prawidłowo przeprowadzona. Reprezentatywne obrazy komórek poddanych kontroli dodatniej przedstawiono na rycinie 6. Wartości danych są znormalizowane do pojazdu, jak opisano wcześniej. Nie wykreśla się krzywych dawka-odpowiedź, ponieważ badane są tylko trzy dawki i nie wszystkie trzy dawki są brane pod uwagę w każdym punkcie czasowym. Dawki kontroli dodatniej dobiera się (na podstawie poprzednich doświadczeń, dane nie zostały przedstawione) w taki sposób, aby zaobserwować odpowiednie reakcje dla każdego punktu końcowego zarówno po 4 godzinach, jak i po 24 godzinach. W szczególności dawki 1 i 2 stosuje się do oceny działania po 4 godzinach, natomiast dawki 2 i 3 stosuje się do oceny działania po 24 godzinach. Płytki wyrzuca się, jeżeli nie obserwuje się reakcji na dawki kontroli dodatniej. Należy zauważyć, że dla wszystkich punktów końcowych, z wyjątkiem potencjału błony mitochondrialnej i zawartości GSH, oczekuje się wzrostu intensywności sygnału.

Wszystkie związki, z wyjątkiem fenolu, indukowały nekrotyczny fenotyp, oparty na zwiększonej przepuszczalności błony komórkowej (Rysunek 7a,f,h,l). 1-aminonaftalen, chrom (VI), aldehyd krotonowy i fenol zostały zidentyfikowane jako genotoksyczne na podstawie zwiększonej fosforylacji histonu H2AX (Rysunek 7e,j,n,p). Stwierdzono, że fenol i 1-aminonaftalen wywołują ciężką dysfunkcję mitochondriów (ryc. 7b,o), która w przypadku 1-aminonaftalenu prowadziła do zwiększonego uwalniania cytochromu C (ryc. 7c). Wykrycie zwiększonej aktywności kaspazy 3/7 dostarczyło dowodów na zdarzenie apoptozy po ekspozycji na chrom. Indukcję stresu oksydacyjnego (ROS lub GSH) wykryto również po leczeniu 1-aminonaftalenem, aldehydem krotonowym i fenolem (ryc. 7d, m, q). Wreszcie, arsen indukuje stres komórkowy, o czym świadczy zwiększona fosforylacja czynnika transkrypcyjnego cJun (ryc. 7g).

Rysunek 1. Przepływ pracy Compound Tox-Profiler. a) Schemat przepływu pracy zastosowanego w tym badaniu. W pierwszej kolejności dokonano ustalenia zakresu dawek przy użyciu platformy RTCA w celu wybrania odpowiednich dawek dla kolejnych HCS w celu scharakteryzowania profili toksyczności specyficznych dla związku. b) Eksperymentalny projekt badania. 24 godziny po wysiewie komórkom podawano dawki, a wartości impedancji były stale monitorowane przez kolejne 24 godziny, podczas gdy punkty końcowe HCS badano 4 i 24 godziny po podaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Płyta ekspozycyjna RTCA. Złożona płyta wzorcowa jest najpierw generowana przez wykonanie pięcioetapowego seryjnego rozcieńczania w skali 1:10. Każdy związek, łącznie z kontrolą nośnika (dawka 0), jest następnie dodawany w trzech egzemplarzach do płytki ekspozycyjnej razem z pożywką i staurosporyną jako próbami. Należy zauważyć, że kolejność dawek jest zachowywana po przeniesieniu, najwyższe dawki znajdują się w wierszu numer 1, podczas gdy grupy kontrolne pojazdu znajdują się w wierszu numer 7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki żywotności komórek RTCA. a) 1-aminonaftalen, b) 2-nitropropan, c) acetamid, d) aceton, e) akrylamid, f) arsen (V), g) benzen, h) chrom (VI), j) aldehyd krotonowy, k) keton metylowo-etylowy, l) nikiel (II), m) nitrobenzen, n) fenol, o) chinolina, p) Toluen. Po 24 godzinach od podania dawki obliczono pole pod krzywą (AUC) dla każdej dawki (w tym kontroli dodatniej i nośnika) i znormalizowano je w zakresie od 0 do -100% aktywności (oś y), gdzie 0 odzwierciedla aktywność nośnika, a -100 kontroli dodatniej. Wartości zostały następnie wykreślone i dopasowane za pomocą czteroparametrowego równania Hilla i, jeśli to możliwe, obliczono LD₅₀. Stężenia są wyrażane w skali logarytmicznej (oś x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Schemat rozcieńczania związków służących do kontroli dodatniej w testach HCS. a) Dodanie kontroli dodatnich i nośnika do seryjnej płytki rozcieńczającej. b) Seryjne rozcieńczanie kontroli dodatnich. c) 200 razy więcej dawek kontroli dodatniej. d-e) Rozcieńczenie 200-krotnych dawek kontroli dodatniej w pożywce (1:40) w celu wytworzenia płytki kontroli dodatniej zawierającej 5-krotne dawki. Należy zauważyć, że każda dawka jest rozcieńczana w trzech egzemplarzach, aby odzwierciedlić ostateczny układ na płycie naświetlającej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Płyta ekspozycyjna HCS. Złożona płytka wzorcowa jest najpierw generowana przez wykonanie pięciostopniowego rozcieńczenia. Każdy związek, łącznie z kontrolą nośnika (dawka 0), dodaje się następnie trzykrotnie do płytki ekspozycyjnej razem z kontrolami dodatnimi. Należy zauważyć, że kolejność dawek jest zachowywana po przeniesieniu, najwyższe dawki znajdują się w wierszu numer 1, podczas gdy kontrole pojazdu znajdują się w wierszu numer 7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Reprezentatywne zdjęcia fluorescencyjne komórek barwionych przeciwciałami lub barwnikiem. a) Parametry jądrowe - Barwnik jądrowy: Przepuszczalny barwnik, który wiąże się z DNA w żywych lub utrwalonych komórkach. To barwienie służy do identyfikacji pojedynczych komórek oznaczających obszar jądrowy. b) Nekroza - Barwnik przepuszczalności błony komórkowej: Wykrywanie integralności błony komórkowej za pomocą barwnika. Odczynnik jest wewnętrznie nieprzepuszczalny dla błony komórkowej. Podczas martwicy błona staje się przepuszczalna, a barwnik dostaje się do komórki i wiąże się z DNA, wytwarzając silny sygnał fluorescencyjny. c) Apoptoza - Cytochrom C: Wykrywanie uwalniania cytochromu C na podstawie przeciwciał, dobrze znana cecha charakterystyczna wczesnej apoptozy. Po indukcji apoptozy cytochrom c jest uwalniany z mitochondriów i dyfunduje do jądra. d) Uszkodzenie DNA - pH2AX: Oparte na przeciwciałach wykrywanie fosforylacji histonu H2AX, dobrze znanej cechy charakterystycznej pęknięć dwuniciowego DNA. e) Kinaza stresowa - cJun: Oparte na przeciwciałach wykrywanie fosforylacji w Ser-73 cJun, dobrze znanej cechy charakterystycznej stresu komórkowego. f) Stres oksydacyjny - DHE: Wykrywanie rodników ponadtlenkowych za pomocą barwnika. Sam dihydroethidium fluoryzuje na niebiesko w cytoplazmie, podczas gdy utleniona forma ethidium fluoryzuje na czerwono po interkalacji DNA. g) GSH - mBcl: Wykrywanie wolnych cząsteczek GSH za pomocą barwnika. mBcl reaguje z GSH, tworząc produkt o wysokiej fluorescencji. h) Apoptoza - aktywacja kaspazy 3/7: Wykrywanie aktywności kaspazy 3/7 za pomocą barwnika. Odczynnik jest niefluorescencyjny z czteroaminokwasowym peptydem, który hamuje wiązanie DNA. Po aktywacji kaspazy-3/7 peptyd jest rozszczepiany, umożliwiając barwnikowi związanie się z DNA i wywołanie jasnej, fluorogenicznej odpowiedzi. Panele b-h pokazują komórki poddane kontroli pozytywnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Reprezentatywne wyniki HCS. 1-aminonaftalen (a-e), arsen (V) (f i g), chrom (VI) (h-k), aldehyd krotonowy (ln) i fenol (o-q). Sygnały 4-godzinne (niebieska linia) i 24-godzinne (pomarańczowa linia) zostały obliczone dla każdej dawki i znormalizowane do aktywności nośnika (0%). Wartości, które nie są uwzględniane w obliczeniach dopasowania krzywych, są wyświetlane w kolorze szarym. Stężenia są wyrażane w skali logarytmicznej (oś x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Test	Punkt końcowy #	Biologiczny punkt końcowy	Przedział komórkowy	Funkcja wyjściowa
Cytotoksyczność	1	Masa mitochondrialna 6	cytoplazma	Średni obszar punktowy
	cyfra arabska	Potencjał błony mitochondrialnej 6	cytoplazma	Średnia intensywność punktowa
	3	Cytochrom C uwalnianie 7	jądro	Średnia intensywność
	4	Przepuszczalność błony komórkowej 8	jądro	Średnia intensywność
Uszkodzenie DNA	5	fosfo-H2AX 9	jądro	Średnia intensywność
Kinaza stresowa	6	fosfo-cCze10	jądro	Średnia intensywność
Ros	7	ROS 11	jądro	Średnia intensywność
Zawartość GSH	8	Zobacz materiał GSH 12	cytoplazma	Średnia intensywność punktowa
apoptoza	9	Kaspaza 313	cytoplazma	Średnia intensywność punktowa

Tabela 1. Wykaz testów HCS i punktów końcowych.

) szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. szt. pkt. ) szt. szt. szt. pkt. ) szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt. szt. Rozdział pkt. ) szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. szt. Rozdział szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt. ) szt. szt. szt. pkt. ) szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. szt. szt. ) szt. szt. szt. pkt. szt. szt. szt. pkt.

		Pojazd	Dawki RTCA (μM)						LD50	Dawki HCS
										Wybrana żywotność komórki (μM)				3R4F (nM)
1-Aminonaftalen		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	280 μM	2 000	500	200	150	0,27
2-nitropropan		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Parateamid		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Aceton		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Akrylamid		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Arsen (V)		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	160 μM	200	100	50	25	0,17
benzen		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Chrom (VI)		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	20 μM	100	50	20	10	0,06
Aldehyd krotonowy		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	200 μM	20 000	2 000	200	20	2 000
keton metylowo-etylowy		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Nikiel		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Nitrobenzen		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Fenol		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	2 300 μM	5 000	2 000	1 000	500	240
Chinolina		EtOH (EtOH	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM
Toluen		Woda	20 000	2 000	200	20	cyfra arabska	0,2	>20 mM

Tabela 2. Lista badanych związków HPHC ze względnym LD₅₀ po 24 godzinach leczenia. Związki wybrane do analizy HCS są zaznaczone kolorem pomarańczowym i podane są również badane dawki. Dawka 3R4F jest równoważna ilości składnika obecnego w dymie z jednego wkładu z papierosa referencyjnego 3R4F.

Rozdział szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział

Test	związek	Roztwór podstawowy	rozpuszczalnik	Dawka(y) (μM)
Żywotność komórek	Staurosporyna	10 mM	Dmso	50
Cytotoksyczności	Walinomycyna	10 mM	Dmso	50	20	5
Uszkodzenie DNA	Parakwat	100 mM	Dmso	500	200	50
Kinaza stresowa	Anizomycyna	2 mM	Dmso	10	4	1
Ros	Rotenon	200 mM	Dmso	1 000	400	100
Zawartość GSH	Kwas etakrynowy	200 mM	Dmso	1 000	400	100
apoptoza	Staurosporyna	40 mM	Dmso	200	50	20

Tabela 3. Wykaz kontroli dodatnich i stężeń stosowanych w każdym badaniu.

Dyskusja

W ostatnich latach szeroko dyskutowano o potrzebie znalezienia alternatyw dla doświadczeń na zwierzętach oraz nowych podejść do badań o wysokiej przepustowości. To skłoniło naukowców i organy regulacyjne do zbadania alternatywnych metod standardowych testów toksyczności, wykorzystujących testy komórkowe, które ściśle naśladują fizjologię tkanek docelowych. W tym badaniu wykazaliśmy możliwość zastosowania połączenia analizatora komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) z platformą badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) w celu oceny wpływu ekspozycji na pojedyncze składniki CS na ludzkie komórki nabłonka płuc. Układ ten można analogicznie zastosować do oceny cytotoksyczności indukowanej przez różne inne zanieczyszczenia powietrza, cząstki unoszące się w powietrzu i nanocząstki. Co więcej, uzyskane wyniki można porównać z wynikami transkryptomiki całego genomu i metod obliczeniowych opartych na przyczynowych sieciach biologicznych. Jak wcześniej informowaliśmy, podejście to pozwoliło nam potwierdzić dane dotyczące zaburzeń szlaku molekularnego po ekspozycji na CS⁵ z punktami końcowymi HCS, rozwiązując te perturbacje szlaku również fenotypowo.

Jako test schematu blokowego, analiza komórek w czasie rzeczywistym dostarcza informacji związanych z żywotnością komórek w rozdzielczości zależnej od dawki i czasu, co pozwala na lepsze podejmowanie decyzji, która dawka i punkt czasowy ekspozycji mogą być korzystne dla dalszej analizy¹⁴. Zasada działania analizatora opiera się na zmianach impedancji elektrycznej generowanej przez ogniwa, gdy przyczepiają się i rozprzestrzeniają na powierzchni studzienki hodowlanej pokrytej złotą mikroelektrodą. Impedancja jest przekształcana w bezwymiarowy parametr o nazwie cell-index, który może być używany do monitorowania adhezji komórek, rozprzestrzeniania się, morfologii i ostatecznie żywotności komórek. Chociaż technika ta nie dostarcza informacji na temat mechanizmów cytotoksycznych, jej czułość umożliwia wykrywanie morfologicznych zmian komórkowych nawet przy bardzo niskich dawkach, przy których HCS nie ma charakteru informacyjnego (dane nie pokazane). Na podstawie wcześniejszych eksperymentów zauważyliśmy, że metodologia RTCA jest w stanie wykryć zmiany morfologiczne przy niższych dawkach w porównaniu z punktami końcowymi HCS.

Po wstępnym badaniu przesiewowym za pomocą analizatora komórkowego w czasie rzeczywistym, wykorzystano platformę HCS w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat rodzaju cytotoksyczności wywoływanej przez każdy HPHC. Panel testowy HCS pozwolił na profilowanie HPHC pod kątem ich potencjalnego wpływu na przedziały komórkowe/organelle, a także na zidentyfikowanie tych, które wywołują genotoksyczność lub stres oksydacyjny. Analiza ujawniła odrębne profile, w których wybrane HPHC indukują cytotoksyczność w komórkach NHBE. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzono, że wszystkie związki, z wyjątkiem fenolu, wywołują martwicę przy najwyższych testowanych dawkach. Zgodnie z potencjalną rolą w rozwoju raka, fosforylacja H2AX indukowana przez 1-aminonaftalen jako marker genotoksyczności, jednak panel HCS odkrył również aktywność tego HPHC w odczycie toksyczności mitochondrialnej (wzrost masy i uwalnianie cytochromu C) i stresie oksydacyjnym (wyczerpanie GSH). Podobnie, jak opisano wcześniej, stwierdzono, że fenol wywołuje dysfunkcję mitochondriów i powoduje uszkodzenie DNA, a także wyczerpanie GSH. Chrom (VI), jeden ze związków sklasyfikowanych jako czynniki rakotwórcze grupy I, oraz aldehyd krotonowy zostały również zidentyfikowane jako genotoksyczne, w szczególności chrom (VI) również indukował apoptozę (aktywacja kaskady kaspazy), a aldehyd krotonowy powodował zwiększone wytwarzanie ROS. Wreszcie, stwierdzono, że arsen (V) indukuje fosforylację cJun, która jest markerem aktywacji szlaku kinazy stresowej.

W tym badaniu wykorzystaliśmy komórki NHBE jako model komórek nabłonka płuc in vitro. Wykorzystanie tych komórek w warunkach HCS jest bezprecedensowe i umożliwiło zbadanie szerszego zakresu punktów końcowych, w tym genotoksyczności i markerów stresu oksydacyjnego. Zarówno podejścia do barwienia żywych komórek, jak i utrwalonych komórek zostały opisane w naszych protokołach, co świadczy o elastyczności całej techniki. W rzeczywistości te same protokoły można zastosować do szerszego zakresu celów, które można rozwiązać za pomocą dowolnego barwnika fluorescencyjnego lub przeciwciała. Aby pomyślnie wykonać protokoły barwienia na żywo, ważne jest, aby przestrzegać czasu inkubacji, ponieważ niektóre barwniki mają ograniczony okres półtrwania, a sygnał fluorescencji może się zmniejszyć przed zakończeniem akwizycji obrazu. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że jeśli używany jest inny typ komórek, wszystkie warunki barwienia powinny zostać ponownie ocenione, ponieważ optymalne stężenie barwnika i czas inkubacji mogą być różne.

W niniejszym artykule opisaliśmy scenariusz, w którym tylko pięć związków zostało przebadanych za pomocą metodologii HCS. Biorąc pod uwagę wcześniej opisany układ płytek, dozowano je na 2 różnych zestawach płytek, co daje łącznie 24 płytki (6 testów i 2 punkty czasowe). Można również zwiększyć liczbę płytek, co pozwoli na jednoczesne badanie przesiewowe większej liczby związków lub badanie większej liczby punktów końcowych. Zanim to jednak zrobimy, należy wziąć pod uwagę, że niektóre punkty końcowe (GSH i ROS) wymagają natychmiastowego pobrania, a w konsekwencji dozowanie płytek powinno odbywać się w sposób rozłożony w czasie, aby umożliwić nabycie poprzedniej płytki. Z drugiej strony, stosowanie protokołu barwienia komórek o utrwalonym kształcie stanowi zaletę, ponieważ płytki można układać w stosy, przerywając protokół na dowolnym etapie po utrwaleniu, w celu zakończenia procedury barwienia na późniejszym etapie. Takie podejście, na przykład, zapewniłoby operatorowi czas na wykonanie wszystkich płytek do barwienia żywych komórek bez uszczerbku dla jakości danych.

Aby jeszcze bardziej zoptymalizować przepływ pracy poprzez zmniejszenie liczby płyt, możliwe byłoby również multipleksowanie większej liczby punktów końcowych razem. Na przykład w tym kontekście, uszkodzenia DNA i kinazy stresowej można badać razem, po prostu używając dwóch drugorzędowych przeciwciał z fluorochromami emitującymi w różnych kanałach. Ciągły rozwój platformy HCS, w tym w pełni zautomatyzowane wysiewanie komórek, rozcieńczanie związków, dozowanie i barwienie, a także dodawanie nowych punktów końcowych, jeszcze bardziej rozszerzy możliwości platformy HCS jako potężnego narzędzia do profilowania HPHC na nabłonku i innych typach komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader	Thermo	N01-0002B
xCelligence RTCA MP	ACEA
Screener (HCS)	Genedata	NA
CASY licznik TTC	Roche	05 651 719 001
e-Plates VIEW 96	ACEA	06 472 451 001
RTCA Frame 96	ACEA	05232392001
RTCA Cardio Temperature Tool	ACEA	2801171
Uszczelniacz płytek oddechowych	Greiner bio-one	676051
Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE)	Lonza	CC-2540	niepalący 60-letni dawca rasy kaukaskiej
BEGM BulletKit	Lonza	CC-3170	Ciepły w 37 stopniach; C przed użyciem
ReagentPack Subculture Zestaw odczynników	Lonza	CC-5034	Ciepły w 37 & stopniach; C przed użyciem
Penicylina/Streptomycyna (100x)	Corning	30-002-CI
Nasadka filtra Easy Flask 75  cm2	Thermo Scientific	12-565-349
96 płytka testowa dołka	Corning	3603
Hoechst 33342	Fisher Scientific	PI-62249
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)	Biostatus	DR50200
Barwnik mitochondrialny: MitoTracker Red CMXRos	Life technologies	M-7512
Barwnik mitochondrialny: MitoTracker Red CM-H2XRos	Life technologies	M-7513
ROS Barwnik: Dihydroethidium	Sigma	D7008
ROS Dye: CellROX	Life technologies	C10422
ROS Barwnik: MitoSOX	Life technologies	M36008
GSH Barwnik: Monochlorobimane	Sigma	69899	Toksyczny
GSH Barwnik: Monobromobimane	Life technologies	M-1378
Toksyczna przepuszczalność membrany Barwnik: YO-PRO-1	Technologie życiowe	Y3603 Irytujące
Przepuszczalność membrany Barwnik: TO-PRO-1	Technologie życiowe	T3602	Irytujące
Przepuszczalność membrany Barwnik: TOTO-1	Technologie życiowe	T3600	Irytujące
Barwnik kaspazy: Cellevent Kaspaza 3/7 zielony	Technologie życia	C10423	Drażniące
Przeciwciało anty-cytochromu C (mysz)	Thermo	MA5-11823
Przeciwciało anty-phospho-c-Jun (mysz)	Thermo	MA5-15889
Przeciwciało anty-fosfo-H2AX (mysz)	Thermo	MA1-2022
Kozia anty-mysia IgG DyLight 650	Abcam	ab96878
10x bufor permeabilizacyjny	Fisher	8408400
4% roztwór formaldehydu	Sigma	F1635	Toksyczny
10x bufor blokujący	Fisher	8408500
Dulbecco' s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	D8537
Zrównoważony roztwór soli Hanksa	Sigma	H8264
Staurosporine	Sigma	S4400	Toksyczna
walinomycyna	Sigma	V0627	Toksyczny
parakwat	Sigma	36541	Toksyczna
anisomycyna	Sigma	A9789	Toksyczny
kwas etakrylowy	Sigma	E4754	Toksyczny
1-aminonaftalen	Sigma	34390	Toksyczny
2-nitropropan	Sigma	130265	Toksyczny
acetamid	Sigma	695122	Toksyczny
aceton	Sigma	650501	Toksyczny
akryloamid	Sigma	A9099	Toksyczny
arsen (V)	Sigma	A6756	toksyczny
Benzen	Sigma	12540	Toksyczny
chrom (VI)	Sigma	216623	Toksyczny
aldehyd krotonowy	Sigma	262668	Toksyczny
keton metylowo-etylowy	Sigma	34861	Toksyczny
nikiel	Sigma	203866	Toksyczny
nitrobenzen	Sigma	48547	Toksyczny
fenol	Sigma	P5566	Toksyczny
chinolinowy	Sigma	241571	Toksyczny
toluen	Sigma	34866	Toksyczny