Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53990

⸱

20 października 2016

 ,  ,  , 
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy (glejak IV stopnia) jest bardzo agresywnym nowotworem ludzkim z medianą przeżycia 1 roku po diagnozie. Pomimo lepszego zrozumienia zdarzeń molekularnych, które prowadzą do glejaków, nowotwór ten nadal pozostaje wysoce oporny na konwencjonalne leczenie. Chirurgiczna resekcja guzów mózgu o wysokim stopniu złośliwości rzadko jest kompletna ze względu na wysoce naciekający charakter komórek glejaka. Podejścia terapeutyczne, które osłabiają inwazję komórek glejaka, są zatem atrakcyjną opcją. Nasze laboratorium i inne wykazały, że makrofagi związane z nowotworem i mikroglej (makrofagi rezydujące w mózgu) silnie stymulują inwazję glejaka. Protokół opisany w tej pracy służy do modelowania interakcji glejak-makrofag/mikroglej za pomocą testów hodowli in vitro. Takie podejście może znacznie ułatwić rozwój i/lub odkrycie leków, które zakłócają komunikację z makrofagami, które umożliwiają to złośliwe zachowanie. Ustaliliśmy dwa solidne testy inwazji kokulturowej, w których mikroglej / makrofagi stymulują inwazję komórek glejaka 5-10 razy. Komórki glejaka znakowane markerem fluorescencyjnym lub konstytutywnie wyrażające białko fluorescencyjne są siane bez i z makrofagami/mikroglejem na wkładkach komory poliwęglanowej pokrytych matrycą lub osadzone w trójwymiarowej matrycy. Inwazję komórek ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania i liczenia tylko komórek inwazyjnych znajdujących się na spodniej stronie filtra. Za pomocą tych testów zidentyfikowano kilka inhibitorów farmakologicznych (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitynib i Semapimod), które blokują inwazję glejaka stymulowaną makrofagami/mikroglejem.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy jest agresywnym nowotworem mózgu u człowieka, którego mediana przeżycia wynosi około 12 miesięcy od momentu diagnozy 1,2. Glejak wielopostaciowy jest jednym z najbardziej śmiertelnych i trudnych klinicznie nowotworów, ponieważ jest oporny na standardową chemioterapię i resekcję chirurgiczną. Rozproszony charakter glejaka umożliwia komórkom nowotworowym rozprzestrzenianie się w normalnym mózgu, co praktycznie uniemożliwia całkowite chirurgiczne wycięcie zaawansowanego guza. Ten wysoce inwazyjny aspekt jest cechą charakterystyczną glejaka i innych zaawansowanych gwiaździaków. Dlatego wiele badań skupia się na molekularnym mechanizmie inwazji komórek glejaka. Mikrośrodowisko guza glejaka odgrywa istotną rolę w tworzeniu nowotworu złośliwego 3-6. Wykazano, że makrofagi/mikroglej związane z nowotworem są odpowiedzialne za promowanie inwazji glejaka 7,8. Większość z tych badań mierzyła jednak wpływ makrofagów/mikrogleju za pomocą testów, które fizycznie oddzielają je od komórek glejaka. Nasze laboratorium postawiło sobie za cel opracowanie ulepszonych testów, które pozwolą nam zbadać, w jaki sposób inwazja glejaka jest zależna od makrofagów/mikrogleju w kokulturach i umożliwią nam zobrazowanie fizycznej interakcji między nimi podczas inwazji.

Klasyczne testy do pomiaru inwazji komórek obejmują "standardowe" formaty chemotaksji w komorze Boydena i chemoinwazji. W tym przypadku badane komórki są platerowane w plastikowej komorze, która zawiera na dnie filtr poliwęglanowy z porami o określonej wielkości (zwykle o średnicy od 0,4 do 8 μM). Proces inwazji komórek obejmuje fizyczną barierę, zwykle składającą się z białka macierzy zewnątrzkomórkowej. W teście chemoinwazji preferowaną stosowaną matrycą jest Matrigel (zwany dalej "matrycą"), mieszanina białek macierzy zewnątrzkomórkowej wydzielana przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) i składa się głównie z kolagenu typu IV i lamininy. Komory są następnie umieszczane w studzience do hodowli tkankowej, która zawiera pożywki do hodowli komórkowych z czynnikami wzrostu lub bez nich, co do których istnieje podejrzenie, że stymulują inwazję. Komórki, które mają większą zdolność inwazyjną, będą przenikać przez filtr pokryty macierzą zewnątrzkomórkową z większą częstotliwością i przylegać do spodu filtra. Zmodyfikowaliśmy ten test w celu oceny roli mikrogleju i makrofagów związanych z nowotworem w inwazji komórek glejaka.

Udało nam się ustalić za pomocą testów kokulturowych opisanych w tym artykule, że mikroglej może stymulować inwazję dwóch linii komórkowych glejaka 5 - 10-krotnie 9,10. Odzwierciedla to to, co obserwuje się w zwierzęcych modelach glejaka. Ponadto opracowaliśmy trójwymiarowy test inwazji, w którym można bardziej bezpośrednio badać interakcje między komórkami glejaka a makrofagami/mikroglejem. Zakres inwazji komórek glejaka stymulowanej przez makrofagi/mikroglej w teście 3D jest porównywalny z tym, co obserwuje się przy użyciu podejścia komorowego pokrytego matrycą. Podobne testy zostały wcześniej opracowane w celu zbadania interakcji raka piersi z makrofagami podczas inwazji 11-13. Obie metody opisane w tej pracy powinny pomóc w analizie molekularnych mechanizmów inwazji komórek glejaka stymulowanej makrofagami/mikroglejem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Fluorescencyjne znakowanie komórek

UWAGA: Oznacz linie komórkowe glejaka i mikrogleju barwnikami fluorescencyjnymi 9. Alternatywnie, wygeneruj linie komórkowe, które konstytutywnie wyrażają białka fluorescencyjne, takie jak GFP / RFP, jak opisano w 14.

  1. Umieść komórki na 6-dołkowej płytce tak, aby w dniu barwienia zlewały się w 70 - 80%. W przypadku mysiego glejaka linii komórkowej GL261 i ludzkiej linii komórkowej glejaka U87, płytkę 1 x 106 i 1,5 x 106 komórek, odpowiednio na 6 cm szalce 24 godziny przed barwieniem.
  2. Przygotuj roztwór barwnika do barwienia komórek fluorescencyjnych w DMSO i dodaj 5 μM barwnika do pożywki, pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) lub pożywki wolnej od surowicy makrofagów (MSFM), dobrze wirować.
  3. Inkubować komórki z barwnikiem przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Usuń pożywkę zawierającą barwnik i dodaj nową pożywkę (RPMI lub MSFM) do komórek.
  5. Inkubuj komórki przez 30 minut. Uwaga: Komórki są teraz wybarwione i gotowe do użycia w eksperymencie.

2. Test inwazji kokultury w komorze matrycowej z precoated

  1. Różnicuj komórki THP-1 za pomocą octanu mirystynianu forbolu (PMA)15.
    1. Płytka 2 - 3 x 105 komórek THP-1 w 1,5 ml RPMI/10% FBS na 6-dołkowej płytce hodowlanej. Bezpośrednio po posianiu dodać 100 nM PMA i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.
      UWAGA: Po 48 godzinach komórki THP-1, które pomyślnie przeszły różnicowanie, będą przylegać i rozprzestrzeniać się na dno studni, przyjmując okrągłą morfologię.
    2. Usuń PMA, myjąc raz 1x PBS i zastąp świeżym RPMI/10% FBS. Poczekaj kolejne 48 godzin, aż komórki będą gotowe do użycia w teście.
  2. Zrównoważyć komory wstępnie powlekane matrycą, umieszczając je w studzience zawierającej 500 μl samej pożywki (bez surowicy) i dodając 500 μl samej pożywki do góry. Inkubować komory przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Komory wstępnie powlekane zostały zakupione od producenta; patrz Tabela materiałów/wyposażenia.
  3. Aby delikatnie odłączyć komórki (znakowane fluorescencyjnie linie komórkowe glejaka i mikroglej/makrofagi), usuń pożywkę z komórek przez aspirację. Umyj komórki na naczyniu za pomocą 2 mM EDTA/PBS. Dodać 500 μl 2 mM EDTA/PBS i inkubować przez 5 - 10 minut w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Zawiesić komórki w 5 ml pożywki zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
  5. Wirować przez 5 minut przy 120 x g.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce MSFM/0,3% BSA (dla komórek GL261 i mikrogleju) lub RPMI/0,3% BSA (dla komórek U87 i THP-1) tak, aby stężenie komórek było równe 1 x 106 komórek/ml. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.
  7. Dodać 500 μl pożywki/0,3% BSA na dołek z płytki 24-dołkowej.
  8. Usunąć pożywkę z komór, które były zrównoważone przez co najmniej 2 godziny (krok 2.2). Umieść komory w studzience zawierającej 500 μl pożywki/0,3% BSA (krok 2.7).
  9. Jeśli inhibitory są stosowane do badania ich wpływu na inwazję glejaka stymulowaną makrofagami/mikroglejem, dodaj odpowiednie stężenie zarówno do dolnej, jak i górnej części komory.
    UWAGA: Stężenia inhibitora CSF-1R stosowanego do pełnego hamowania inwazji glejaka GL261 stymulowanej mikroglejem można znaleźć w odnośniku 9.
  10. W zależności od użytych linii komórkowych dodaj komórki do górnej komory zgodnie z opisem w dwóch następnych krokach: glejak mysi (2.10.1) i glejak ludzki (2.10.2).
    1. Wymieszaj 1,5 x 105 komórek GL261 (glejak) (150 μl) i 5 x 104 mysich mikroglejów (50 μl) (szczegóły dotyczące podłoża patrz krok 2.6). Zwiększyć objętość do 500 μl, dodając 300 μl MSFM/0,3% BSA. Dodać mieszaninę komórek do górnej komory i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.
      UWAGA: Mysi mikroglej izoluje się od nowonarodzonych myszy, jak opisano w 16.

Wymieszaj 7,5 x 104 komórki U87 (glejak) (75 μl) i 2,5 x 104 komórki THP1 (makrofagi) (25 μl). Zwiększ objętość 500 μl, dodając 400 μl RPMI/0,3% BSA. Dodaj mieszaninę komórek do górnej komory. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.

  1. Po inkubacji usunąć komórki z górnej części komory przez delikatne aspiracje i utrwalić komory, umieszczając w 3,7% formaldehydzie w PBS. Pozostawić komory do pozostania w utrwalaczu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Usunąć utrwalacz przez delikatne zassanie i zastąpić 500 μl 1x PBS. Przejdź do sekcji 4 w celu analizy obrazu.
    UWAGA: Eksperyment można w tym momencie wstrzymać i zapisać do obrazowania w 1x PBS. Sygnały barwnika fluorescencyjnego można wykryć do 2 tygodni po utrwaleniu.

3. Test inwazji "3D" - osadzanie glejaka i makrofagów/mikrogleju w matrycy

  1. Rozmrozić matrycę w temperaturze 4 °C przez noc. Wykonaj wszystkie dalsze manipulacje za pomocą matrycy na lodzie w masce.
  2. Przygotować matrycę o stężeniu 10 mg/ml w pożywce (MSFM lub RPMI) z 0,3% BSA na lodzie.
    UWAGA: Stężenie podstawowe matrycy wynosi zwykle około 15 mg/ml.
  3. Aby przygotować komórki (oznaczone w kroku 1) do zawiesiny w matrycy, należy usunąć pożywkę z komórek przez aspirację. Umyj komórki na naczyniu za pomocą 2 mM EDTA/PBS. Dodać 500 μl 2 mM EDTA/PBS do komórek i inkubować przez 5 - 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Zawiesić komórki w 5 ml pożywki zawierającej 0,3% BSA.
  5. Wirować przez 5 minut przy 120 x g.
  6. Odessać supernatant z osadu. Zawiesić osad w pożywce/0,3% BSA tak, aby stężenie komórek było równe 1 x 106 komórek/ml. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.
  7. Dodać 1,5 x 105 komórek GL261 (w 150 μl) + 5 x 104 komórek mikrogleju (w 50 μl) do probówki do mikropęcherzyków o pojemności 1,5 ml. Dodaj 2 x 105 komórek GL261 (200 μl) do osobnej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Same komórki GL261 bez mikrogleju służą jako kontrola.
  8. Wiruj komórki w mikrofudze przez 5 minut w temperaturze 120 x g.
  9. Zawieś komórki w zimnej matrycy o objętości 200 μl na lodzie.
  10. Umieść 50 μl (50 000 komórek) na środku górnej komory wkładu komory o wielkości porów 8 μM.
  11. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby nastąpiła polimeryzacja.
  12. Dodać 200 μl pożywki bez surowicy do górnej komory i 700 μl surowicy zawierającej pożywkę do dolnej studzienki.
  13. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.
  14. Po inkubacji usunąć komórki z górnej części komory przez delikatne aspiracje i utrwalić komory, umieszczając w 3,7% formaldehydzie w PBS. Pozostawić komory do pozostania w utrwalaczu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Usunąć utrwalacz przez delikatne zassanie i zastąpić 500 μl 1x PBS. Przejdź do sekcji 4 w celu analizy obrazu.

4. Testy obrazowe

  1. Usunąć komory z 3,7% formaldehydu i umyć w dobrze zawierającym świeże 500 μl 1x PBS.
    UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia komór.
  2. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką delikatnie oczyść nieinwazyjne komórki z górnej części filtra (strona skierowana do wnętrza komory), zeskrobując powierzchnię filtra. Zacznij delikatnie i stopniowo zwiększaj ciśnienie. Zrób to co najmniej 3 razy na komorę.
  3. Umieść komory w naczyniu ze szklanym dnem lub pozostaw na talerzu 24-dołkowym.
  4. Umieścić próbkę na stoliku epifluorescencyjnego lub laserowego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę i oprogramowanie do przechwytywania obrazu 9,10.
  5. Zrób kilka 10- lub 20-krotnych zdjęć reprezentatywnych pól.
  6. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, policz liczbę komórek glejaka, które przeszły przez filtr do spodu 9,10.
  7. W przypadku obrazowania testu inwazji "3D" (opisanego w sekcji 3), wygeneruj serię stosu Z za pomocą fluorescencyjnego laserowego mikroskopu konfokalnego 5-6. Aby zobrazować inwazyjną populację komórek na spodniej stronie filtra, postępuj zgodnie z krokami protokołu 4.2 - 4.6 opisanymi powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisane tutaj metody, wykazaliśmy, że mikroglej i makrofagi mogą znacząco stymulować inwazję komórek glejaka wielopostaciowego. Zastosowano dwa różne testy inwazyjności, które przedstawiono na Rysunku 1. Na Rysunku 2 komórki GL261 konstytutywnie ekspresujące białko fluorescencyjne mCherry wysiano na uprzednio powlekane komory z mikroglejem i bez niego na 48 h. Komórki GL261 same w sobie wykazywały minimalną inwazyjność, jednak w hodowli z mikrogl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wysoce inwazyjny charakter gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości i glejaka sprawia, że te nowotwory mózgu są bardzo śmiertelne. Dlatego niezwykle ważne jest zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów inwazji glejaka. Wiele już w wieku 17 lat dowiedziano się o procesie inwazji glejaka. Korzystając z formatów testów opisanych w tym artykule, nasze laboratorium wykazało zarówno w modelach mysich, jak i ludzkich, że makrofagi związane z nowotworem mogą stymulować inwazję komórek glejaka od 5 do 10 ra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Konstantinowi Dobrenisowi za dostarczenie mysiego mikrogleju do tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora inwazyjna Corning BioCoat Matrigel: z BD Matrigel MatrixCorning/Fisher ScientificCat: 354481
Pożywka wolna od makrofagów (MSFM) (500 ml)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Sondy molekularneC34552
CellTracker Zielony CMFDADye Life Technologies/Sondy molekularneC2925
Linia komórkowa GL261National Cancer Institute (NCI)
Linia komórkowa U87Amerykańska kolekcja kultur typu tkankiHTB-14
THP-1Amerykańska kolekcja kultur typu tkankiATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)Life Technologies/Gibco11875-093
Roztwór formaldehyduSigma AldrichF1635
Corning Transwell wkładki do hodowli komórek z poliwęglanu (8 &mikro; M pore) 48 w opakowaniu.CorningCLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu, PathClearTrevigen3445-005-01
Surowica cielęca płodu (FBS)Life TechnologiesKat: 10500064
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi cieplnemuFisherscientificBP1600-100
0,5 m EDTAThermoFisher Scientific15575-020
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)Sigma AldrichP8139-1MG
Linia komórkowa

Bibliografia

  1. Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
  2. Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
  3. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
  4. Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
  5. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  6. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  7. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  8. Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
  9. Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
  10. Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
  11. Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
  12. House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
  13. Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
  14. Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
  15. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  16. Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
  17. Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
  18. See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stymulacja makrofag wkokultura mikroglejutest in vitromikroskopia fluorescencyjnainwazja kom rekr nicowanie THP 1komory pokryte macierzinhibitory farmakologicznemikro rodowisko guza
Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.