Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

27 listopada 2016

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

Streszczenie

Kaspazy są kluczowymi mediatorami apoptotycznej śmierci komórek poprzez ich aktywność proteolityczną. Kiedy kaspazy są aktywowane w komórkach do poziomów wykrywalnych przez dostępne technologie, ogólnie zakłada się, że apoptoza następuje wkrótce potem. Kaspazy mogą rozszczepiać wiele składników funkcjonalnych i strukturalnych, powodując szybkie i całkowite zniszczenie komórek w ciągu kilku minut. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że w normalnych zdrowych komórkach te same kaspazy pełnią inne funkcje, przypuszczalnie na niższych poziomach enzymatycznych. Badania nad nieapoptotyczną aktywnością kaspazy były utrudnione przez trudności z wykryciem niskich poziomów aktywności kaspazy i śledzeniem ostatecznego losu komórek in vivo. Tutaj ilustrujemy użycie ultraczułego reportera kaspazy, CaspaseTracker, który trwale oznacza komórki, które doświadczyły aktywności kaspazy u całych zwierząt. Ten dwukolorowy bioczujnik CaspaseTracker in vivo dla Drosophila melanogaster przejściowo wyraża czerwone białko fluorescencyjne (RFP), aby wskazać niedawną lub trwającą aktywność kaspazy, i trwale wyraża zielone białko fluorescencyjne (GFP) w komórkach, które doświadczyły aktywności kaspazy w dowolnym momencie w przeszłości, ale nie umarły. Co ważne, ten zależny od kaspazy bioczujnik in vivo z łatwością ujawnia obecność nieapoptotycznej aktywności kaspazy w tkankach układów narządowych u dorosłej muchy. Wykazano to za pomocą całych sekcji poszczególnych muszek w celu wykrycia aktywności biosensorów w zdrowych komórkach w mózgu, jelitach, kanalikach malpighiego, wpustie, przewodach jajnikowych i innych tkankach. CaspaseTracker wykrywa nieapoptotyczną aktywność kaspazy w długowiecznych komórkach, ponieważ aktywność biosensora jest wykrywana w dorosłych neuronach i innych tkankach co najmniej 10 dni po aktywacji kaspazy. Ten bioczujnik służy jako ważne narzędzie do odkrywania ról i mechanizmów molekularnych nieapoptotycznej aktywności kaspazy u żywych zwierząt.

Wprowadzenie

Kaspazy to proteazy cysteinowe, które pośredniczą w apoptotycznej śmierci komórki, rozszczepiając wiele białek wewnątrzkomórkowych po kluczowych resztach asparaginianu. Na przykład kaspazy inicjujące aktywują kaspazy efektorowe, depreparują nukleazy DNA, rozszczepiają składniki cytoszkieletu i zmieniają skład lipidowy błon komórkowych, aby szybko rozmontować komórki i stymulować ich rozpoznawanie i pochłanianie przez sąsiednie komórki, które pozbywają się zwłok komórkowych. 1-4 Szacuje się, że miliardy komórek umierają dziennie w ludzkim ciele, a apoptoza jest ważnym mechanizmem śmierci komórek nowotworowych wywołanej chemioterapią. 5 Inny zestaw kaspaz może powodować śmierć komórki przez różne procesy nieapoptotyczne w celu stymulacji odporności wrodzonej. 6 Dlatego większość badań nad kaspazami skupia się na ich prośmiercionośnych funkcjach.

Interesujące, wczesne dowody w tej dziedzinie ujawniły, że te same kaspazy odpowiedzialne za promowanie śmierci komórki mają również funkcje niezwiązane ze śmiercią. Pionierskie badania wykazały, że kaspazy biorą udział w różnych funkcjach komórkowych w zdrowych komórkach, w tym w regulacji proliferacji i migracji komórek podczas embriogenezy. 7-9 Kaspazy są wymagane do indywidualizacji spermatyd u Drosophila10,11, do blokowania alternatywnego szlaku nekroptotycznej śmierci komórek u myszy12,13 oraz do przetwarzania mikroRNA u C. elegans. W prawdopodobnie najdłużej żyjących komórkach neurony, kaspazy i inne mechanizmy apoptotyczne są zaangażowane w regulację aktywności neuronalnej poprzez przycinanie zakończeń synaptycznych, proces uważany za niezbędny do wzmocnienia innych synaps do uczenia się i pamięci. 16-18 Możliwe, że kaspazy ułatwiają przycinanie synaps poprzez rodzaj mini-apoptozy maleńkich wypustek neuronalnych bez śmierci całej komórki. 19 Kaspazy mogą jednak pełnić alternatywne funkcje, niezwiązane ze zdarzeniami podobnymi do apoptozy. 20,21 Podwójne role w życiu i śmierci nie są charakterystyczne wyłącznie dla kaspaz; Białka z rodziny BCL-2 i cytochrom c odgrywają rolę w energetyce komórkowej w zdrowych komórkach, ale są również częścią rdzenia szlaku apoptotycznego, który jest aktywowany przez wiele rodzajów stresu komórkowego. Chociaż nie zostało to udowodnione, wydaje się logiczne, że ewolucja powiązała pracę dzienną z pracą śmiercią w obrębie tych samych cząsteczek, aby zapewnić szybką eliminację nieodpowiednich lub niepożądanych komórek.

Obecnie nie są znane molekularne mechanizmy nieapoptotycznej aktywności kaspazy, a zakres nieapoptotycznej aktywności kaspazy podczas rozwoju embrionalnego i w tkankach dorosłych również nie jest znany. Dużym wyzwaniem jest trudność w odróżnieniu pracy dziennej od pracy na śmierć w przypadku kaspaz. W przeciwieństwie do apoptozy i pyroptozy, gdy aktywność kaspazy jest wzmacniana przez kaskadę proteolityczną, oczekuje się, że dzienne zadania kaspaz będą występować na znacznie niższych poziomach aktywności enzymatycznej, prawdopodobnie poniżej wykrytych przez wiele dostępnych technologii.

Przed prezentowaną tutaj pracą, inni opracowali różne biosensory kaspazy do różnych celów. Bioczujniki SCAT (np. ECFP-DEVD-Venus) szybko wykrywają aktywność kaspazy w czasie rzeczywistym w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych za pomocą FRET. 26,27 Po rozszczepieniu kaspazy, ugrupowanie GFP Apoliner (mCD8-RFP-DQVD-nucGFP) ulega relokalizacji subkomórkowej w ciągu kilku minut, gdy jego pęta błony komórkowej jest rozszczepiane przez kaspazy. 28 Podobnie, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) przemieszcza się z cytozolu do jądra po rozszczepieniu kaspazy. Niedawno chromofor w iCasper został sprytnie zmodyfikowany tak, aby fluoryzował po rozszczepieniu przez kaspazy, co pozwoliło na wykrycie aktywności biosensorów w czasie rzeczywistym w neuronach zarodków Drosophila, ale przede wszystkim w związku ze śmiercią komórki rozwojowej. 31 Zależna od kaspazy śmierć neuronów węchowych podczas starzenia się została wykazana przez immunodetekcję rozszczepionej przez kaspazę formy biosensorów CPV (np. mCD8-PARP-Venus). 32,33 Co ważne, aktywowana forma kaspazy-3 została wykryta przy braku śmierci komórki przez wrażliwe barwienie immunologiczne w kolcach hodowanych neuronów oraz w somie przy użyciu zależnej od kaspazy fluorescencji jądrowego barwnika reporterowego CellEvent, ale napotkano trudności z powodu fototoksyczności, chociaż śmierć komórki była opóźniona do czasu po eliminacji kręgosłupa. 19 W związku z tym potrzebne są nowe biosensory kaspazy do wykrywania i śledzenia komórek o podstawowej aktywności kaspazy in vivo.

Aby przezwyciężyć te trudności, stworzyliśmy nowatorski dwukolorowy biosensor kaspazy, nazwany CaspaseTracker. Strategia ta łączy zmodyfikowaną wersję wrażliwego na kaspazę biosensora Apoliner28 z systemem rekombinazy Drosophila G-TRACE FRT 34 w celu trwałego znakowania i śledzenia komórek in vivo. 35 System G-TRACE aktywowany przez Gal4 pozwala na bardzo niskie poziomy kaspaz do aktywacji CaspaseTracker, co skutkuje ekspresją RFP w cytoplazmie i stałą ekspresją GFP ukierunkowaną jądrowo w każdej komórce, która kiedykolwiek doświadczyła aktywności kaspazy. 35 System ten może oznaczać komórki przez całe życie u całych zwierząt za pomocą Drosophila melanogaster, łatwego w obsłudze i szeroko stosowanego systemu modelowego do badania kaspaz i śmierci komórek. 36-38 Rozdział 36-38

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie muchy CaspaseTracker

  1. Aby przygotować muchy CaspaseTracker (DQVD) do eksperymentów, wykonaj następujące krzyżowanie: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; Bezzałogowy statek powietrzny-FLP; Ubi>Stop>GFP-nls), przenosząc 7-10 dziewiczych samic (lub samców) much przenoszących substrat biosensora kaspazy mCD8-DIAP1-Gal4 napędzany promotorem ubikwityny35 wraz z taką samą liczbą samców (lub samic) much G-TRACE, które mają równoważnik drugiego chromosomu CyO, aby uniknąć śmiertelności homozygotycznej kombinacji G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP i Ubi>Stop>GFP-nls)34. Umieść muchy w fiolce ze świeżą żywnością ze świeżą pastą drożdżową jako źródłem białka.
  2. Inkubować pilniki w temperaturze 18 °C przez 5 do 7 dni (maksymalnie 2 tygodnie), a następnie usunąć muchy rodzicielskie z fiolki, aby uniknąć przepełnienia nowym potomstwem i założyć nowe fiolki hodowlane.
  3. Kontynuować inkubację w temperaturze 18 °C aż do momentu, gdy muchy potomne zbliżą się do siebie. Wybierz potomstwo non-CyO [non-curly wing] o prawidłowym genotypie CaspaseTracker, które jest transgeniczne dla elementów CaspaseTracker i G-TRACE35.
  4. Równocześnie, generuj równolegle kontrolne rodzicielskie nietransgeniczne muchy w118 i muchy niewrażliwe na kaspazę (DQVA), aby zweryfikować określoną fluorescencję CaspaseTracker RFP i GFP.
  5. Wykonaj genotypowanie PCR, aby potwierdzić pliki za pomocą CaspaseTracker przy użyciu starterów: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, dając produkt 3,897 pz. Do genotypowania loci G-Trace należy użyć następujących starterów dla GFP (474 pz), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC GC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; dla zapytania ofertowego (258 bp), 5'-GGC, TGC, TTC, ATC, TAC, AAG, GTG, AAG, TTC, ATC, GG, 3'-GAT, GTC, CAG, CTT, GGA, GTC, CCAT, GTC, GTA, GTA, GC; i dla Flpase (655 pz), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Do genotypowania Gal4 w wektorze pUWR (554 pz), 5'-GAA, GCA, CCT, CCT, CGC, ATC, GCT, CAG, TCA, TCA, CGC, CGC, 3'-TGG, AAT, TGG, GGT, ACG, TCT, AGA.

2. Przygotowanie, barwienie i montaż tkanek

  1. W przypadku preparacji much należy unikać przywierania wypreparowanych tkanek do plastikowych końcówek pipet i probówek wirówkowych, końcówek płaszcza i probówek z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w wodzie.
  2. Wypreparuj muchy na silikonowej poduszce za pomocą kleszczy.
    1. Aby uniknąć uszkodzenia końcówek kleszczyków na twardej powierzchni podczas wykonywania sekcji tkanek, należy przeprowadzić sekcję na powierzchni silikonowej. Aby wykonać silikonowe płytki preparacyjne, stopić silikon w zestawie komercyjnym zgodnie z instrukcjami producenta (Lista materiałów). Po stopieniu silikonu dodaj 3 do 4 ml do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Naczynia silikonowe można ponownie wykorzystać.
    2. Znieczulij muchę CO2 i przenieś ją na silikonową płytkę z 1 ml zimnego PBS. Wprowadzić CO2 do fiolki zawierającej muchę za pomocą dmuchawki, a następnie przenieść znieczuloną muchę do podkładki z zapasem CO2.
    3. Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać głowę muchy, i drugiej pary kleszczy, aby pociągnąć klatkę piersiową w przeciwnym kierunku, aby odłączyć głowę muchy od pokrycia ciała bez uszkadzania połączenia między głową a jelitem przednim.
    4. Użyj 2 par kleszczy, aby usunąć skrzydła i nogi z klatki piersiowej.
    5. Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać klatkę piersiową, a drugiej pary kleszczy, aby pociągnąć brzuch, aby ponownie oddzielić go od klatki piersiowej, nie uszkadzając połączenia między jelitem przednim a środkowym.
    6. Przeprowadź sekcję narządów wewnętrznych, w tym mózgu, jelit, kanalików malpighiego i jajników, jak wykazano wcześniej. 39-41 Rozdział 39-41
    7. Usuń wszystkie kawałki naskórka i ciałka tłuszczowe za pomocą kleszczy, ponieważ tkanki te wytwarzają silną autofluorescencję. Cierpliwość i praktyka są wymagane, aby przygotować kompletny układ narządów, jak pokazano.
  3. Przenieś wypreparowane tkanki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i utrwal tkanki 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut z rotacją w ciemności, aby uniknąć wybielania RFP i GFP w tkankach. Unikaj długotrwałego utrwalania, które może zagrozić późniejszym wynikom barwienia.
  4. Usunąć paraformaldehyd za pomocą delikatnego pipetowania i przemyć 3 razy 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej.
  5. Przepuszczalność tkanek za pomocą 0,5 ml PBST w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając. Krótsze inkubacje mogą powodować niepełną przepuszczalność i pogarszać wyniki barwienia.
    1. Jeśli konieczne jest zmniejszenie barwienia tła, należy rozważyć inkubację tkanek w 0,5 ml PBST z 1% BSA, zamiast PBS.
  6. Umyj chusteczki 3 razy 0,5 ml PBST.
  7. Do barwienia jąder i aktyny nitkowatej (F-aktyny) należy nałożyć 0,5 ml PBST z 10 μg/ml niebieskiego barwnika jądrowego Hoechst 33342 i 0,3 μM barwienia F-aktyną Alexa Fluor 633 Phalloidin i inkubować jednocześnie z tkankami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem w ciemności. Unikaj długotrwałego barwienia, ponieważ zwiększy to tło.
    1. W celu barwienia immunologicznego inkubować utrwalone i przepuszczalne tkanki z 0,1% Triton X-100 w 0,5 ml PBS przez noc w temperaturze 4 °C, wybarwić przeciwciałem anty-ELAV w rozcieńczeniu 1:100 lub w rozcieńczeniu anty-kaspazy-3 w stosunku 1:200 przez noc w temperaturze 4 °C (300 μL). Następnie należy zastosować odpowiednie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:100 i inkubować przez 1 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Zobacz Listę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje o przeciwciałach.
  8. Umyj chusteczki 3 razy, każdy przez 5 minut w 0,5 ml PBST z delikatnym obracaniem.
  9. Za pomocą pipety usuń cały PBST, a następnie dodaj 200 μl środka mocującego przeciw wybielaniu (patrz materiały), aby całkowicie pokryć tkanki przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc. Optymalne tkanki, które w pełni wchłonęły środek mocujący, opadną na dno tuby.
  10. Wstępnie oczyść szkiełko szkiełkowe wodą lub 70% etanolem i przenieś chusteczki ze środkiem montażowym na szkiełko podstawowe.
  11. Ostrożnie umieść szklaną osłonę na chusteczkach. Nałóż wazelinę na szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć zniszczenia tkanki przez nadmierną kompresję. Usuń dodatkowy środek montażowy za pomocą bibuły.
  12. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe, nakładając lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wycieku środków mocujących z chusteczek.

3. Mikroskopia konfokalna

  1. Użyj odwróconego konfokalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. Można jednak również używać mikroskopów pionowych. Aby obrazować tkanki za pomocą kafelków, utrzymuj stabilną temperaturę pokojową, aby uniknąć dryfu ostrości i przesunięcia płaszczyzny x-y z powodu rozszerzalności cieplnej i kurczenia się składników. Systemy kontroli warunków środowiskowych i systemy kompensacji dryftu ostrości pomagają uniknąć tego problemu spowodowanego utratą równowagi termicznej systemu mikroskopu.
  2. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Wykonaj kilka obrazów testowych w niskiej rozdzielczości (125 x 125 pikseli) i określ odpowiednią liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego obszaru zainteresowania (ROI).
  3. Ustaw system skanowania mikroskopu tak, aby rejestrował obrazy o rozdzielczości skanowania, takiej jak 500 x 500 pikseli. Wybierz obiektyw, taki jak obiektyw planapochromatyczny 20X NA 0,8 lub 63X NA 1,4 do analizy tkanek przez szklane szkiełka nakrywkowe, tak aby każdy z obrazów (płytek) zachodził na siebie ze wszystkich stron na 20%.
  4. Ustaw sekwencję obrazu od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia, ponieważ światło o długiej długości fali powoduje mniejsze wybielanie zdjęć. Sekwencja od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia to: (i) 633 nm dla F-aktyny falloidyny i przeciwciał przeciwko aktywowanym kaspazom, (ii) 561 nm dla RFP, (iii) 488 nm dla GFP i (iv) 405 nm dla barwienia jądrowego Hoechsta.
  5. Podczas obrazowania zminimalizuj ekspozycję komórek na fluorescencyjne wzbudzenie laserowe podczas procesu obrazowania, aby uniknąć fotowybielania poprzez zmniejszenie intensywności lasera w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów tkanek.
  6. Po zebraniu obrazów połącz je za pomocą oprogramowania mikroskopowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Istnieją dwa kluczowe komponenty, które pozwalają CaspaseTracker wykrywać aktywność kaspazy w normalnych, zdrowych komórkach (Rycina 1a). Pierwszym z nich jest 146-aminokwasowy polipeptyd podatny na cięcie przez kaspazy, opracowany na wzór biosensora kaspaz Apoliner (Rycina 1b).28 Polipeptyd ten pochodzi z DIAP1 (Drosophila inhibitor of apoptosis) i zawiera pojedynczą, naturalnie występującą sekwencję rozpoznawania kaspazy, która jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj ilustrujemy budowę i wewnętrzne działanie CaspaseTracker, które ułatwiają wykrywanie rozległej podstawowej aktywności kaspazy w zdrowych tkankach. Kluczowymi etapami wykrywania nieapoptotycznej aktywności kaspazy in vivo są: 1) generowanie much za pomocą transgenu biosensora, 2) weryfikacja funkcji reporterowej specyficznej dla kaspazy za pomocą odpowiednich kontroli, 3) ćwiczenie technik preparacyjnych w celu obserwacji wszystkich układów narządów wewnętrznych dorosłej Drosophila oraz 4) odróżnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Polan Santos i Darrenowi Obbardowi za ilustracje Drosophila na Ryc. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena za użycie insekty JHMRI. Praca ta była wspierana przez stypendium Fundacji Badań nad Naukami Przyrodniczymi (H.L.T.), Komitet ds. Grantów Uniwersyteckich Hong Kong AoE/B-07/99 (MCF) oraz granty NIH NS096677, NS037402 i NS083373 (J.M.H.). Ho Lam Tang jest stypendystką Fundacji Nauk Przyrodniczych (Life Sciences Research Foundation) i Kay Curci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały eksploatacyjne i odczynniki
VectashieldProdukty wektoroweH-1000Kleszcze montażowe
Ted Pella#505 (110mm, #5)Pęseta Dumont klasa biologiczna, stal nierdzewna
Wiszące prowadnice upuszczaneFisher Scientific12-565BSzkiełka szklane
Sondy molekularneHoechst 33342H1399Barwienie DNA
Alexa Fluor 633Sondy molekularneA22284Barwienie aktyny
Rat-Elav-7E8A10 przeciwciało anty-elavBadania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)Identyfikator rejestru przeciwciał:  AB_528218 Barwnik do Drosophla pan-neuronal ELAV
Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3 (Asp175)Technologia sygnalizacji komórkowej9661Barwnik do aktywnego fragmentu kaspazy-3
Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong GoldLife TechnologiesP36934w celu zachowania fluoroforów 
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961w celu zachowania fluoroforów 
SylGard 182 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning Kod produktu: 0001023934do płytek
Equipment
LSM780 mikroskop konfokalnyCarl ZeissN/AObrazowanie
Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000Carl ZeissN/ADrosophila preparacja
AmScope Światłowodowy podwójny oświetlacz mikroskopu na gęsiej szyi, 150  WAmScopeWBM99316Źródło światła
falloidyny # sekcyjnych

Bibliografia

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8(2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265(2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15(2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437(2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015(2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52(2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223(2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408(2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Drosophila melanogasterbiosensor CaspaseTrackerreporter fluorescencyjnymikroskopia konfokalnasekcja tkanekkrzyżówka genetycznaekspresja RFP GFProzszczepienie kaspazy
In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.