Artykuł metodologiczny

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

DOI:

10.3791/53994

⸱

14 maja 2016

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę długoterminowej mikroskopii poklatkowej do długotrwałego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odpowiedź pojedynczych komórek na leki przeciwnowotworowe znacząco przyczynia się do określenia odpowiedzi populacji, a zatem jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do ogólnego wyniku. Immunoblotting, cytometria przepływowa i eksperymenty z komórkami stałymi są często wykorzystywane do badania, jak komórki reagują na leki przeciwnowotworowe. Te metody są ważne, ale mają kilka wad. Zmienność odpowiedzi na leki między komórkami nowotworowymi a normalnymi komórkami oraz między komórkami różnego pochodzenia nowotworowego, a także reakcje przejściowe i rzadkie są trudne do zrozumienia przy użyciu testów uśredniania populacji i bez możliwości bezpośredniego śledzenia i analizowania ich podłużnie. Mikroskop szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania żywych komórek. Postęp technologiczny umożliwia nam rutynowe obrazowanie komórek w rozdzielczości, która umożliwia nie tylko śledzenie komórek, ale także obserwację różnych odpowiedzi komórkowych. Szczegółowo opisujemy podejście, które pozwala na ciągłe obrazowanie poklatkowe komórek podczas odpowiedzi na lek zasadniczo tak długo, jak jest to pożądane, zwykle do 96 godzin. Korzystając z różnych wariantów tego podejścia, komórki mogą być monitorowane przez tygodnie. Dzięki zastosowaniu genetycznie kodowanych bioczujników fluorescencyjnych można śledzić liczne procesy, szlaki i reakcje. Pokazujemy przykłady, które obejmują śledzenie i kwantyfikację wzrostu komórek i progresji cyklu komórkowego, dynamiki chromosomów, uszkodzeń DNA i śmierci komórki. Omawiamy również różne warianty tej techniki i jej elastyczność oraz zwracamy uwagę na niektóre typowe pułapki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia żywych komórek i podłużne śledzenie pojedynczych komórek nie jest nową techniką. Od najwcześniejszych mikroskopów entuzjaści i naukowcy obserwowali i badali pojedyncze komórki i organizmy, ich zachowania i rozwój1-3. Słynny przykład z nieżyjącego już Davida Rogersa z Vanderbilt University w latach pięćdziesiątych XX wieku pokazuje ludzki neutrofil w rozmazie krwi goniący za bakterią Staphylococcus aureus i ostatecznie proces fagocytozy4. Ten film z żywymi komórkami jest doskonałą ilustracją tego, jak wiele procesów można zaobserwować i skorelować w jednym eksperymencie: wykrywanie gradientu chemicznego, mechanika i szybkość ruchliwości komórek, dynamika kształtów komórek, adhezja i fagocytoza patogenu.

Pojawienie się w pełni zautomatyzowanych mikroskopów i bardzo czułych kamer cyfrowych spowodowało, że coraz więcej badaczy używa mikroskopii do zadawania fundamentalnych pytań w biologii komórki, począwszy od tego, jak komórki poruszają się5,6 i dzielą7,8, po dynamikę organelli i transport błonowy9-11. Niefluorescencyjna mikroskopia jasnego pola, w tym kontrast fazowy (PC), która przyniosła Nagrodę Nobla dla Fritsa Zernike'a w 1953 roku, oraz różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) pozwalają na obserwację komórek i jąder, ale także struktur subkomórkowych, w tym wiązek mikrotubul, chromosomów, jąderek, dynamiki organelli i grubych włókien aktynowych12. Genetycznie kodowane białka fluorescencyjne i rozwój barwników fluorescencyjnych przeciwko organellom dramatycznie wpłynęły na mikroskopię poklatkową13-15. Chociaż nie jest to przedmiotem tego artykułu, obrazowanie w sferoidach komórkowych i in situ (mikroskopia przyżyciowa) przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej stanowi kolejne rozszerzenie tego podejścia, a istnieją znakomite artykuły, które wykorzystują i omawiają te podejścia16-19.

Reakcje komórek na leki przeciwnowotworowe lub produkty naturalne są determinowane na skali molekularnej i komórkowej. Zrozumienie reakcji i losów komórek po leczeniu często wymaga testów uśredniania populacji (np. immunoblotting, pomiary całej studzienki) lub ustalonych punktów czasowych z detekcją immunofluorescencyjną i cytometrią przepływową, które mierzą pojedyncze komórki. Niejednorodność odpowiedzi pojedynczych komórek na leki w populacji, w szczególności w nowotworach, może wyjaśniać pewną zmienność odpowiedzi obserwowaną w liniach komórkowych i guzach, które są leczone tym samym lekiem w momencie saturacji. Długoterminowe podejścia podłużne do śledzenia danej pojedynczej komórki lub populacji komórek są mniej powszechnym, ale bardzo skutecznym podejściem, które pozwala na bezpośrednie badanie szlaków odpowiedzi molekularnej, różnych fenotypów (np. śmierci komórki lub podziału komórki), obserwacji zmienności między komórkami w populacji oraz tego, jak te czynniki przyczyniają się do dynamiki odpowiedzi populacji20-22. Optymistycznie rzecz ujmując, możliwość obserwowania i ilościowego określania odpowiedzi pojedynczych komórek pomoże nam lepiej zrozumieć, jak działają leki, dlaczego czasami zawodzą i jak najlepiej je stosować.

Technika długotrwałej mikroskopii poklatkowej, śledzenia podłużnego i analizy reakcji na leki jest dostępna dla wielu badaczy i może być prosta, wykorzystując tylko światło przechodzące do obserwacji reakcji fenotypowych20,21. Do głównych elementów tego podejścia należą: odpowiednie przygotowanie komórek będących przedmiotem zainteresowania, zautomatyzowany mikroskop z komorą środowiskową, kamera zintegrowana z komputerem do pozyskiwania i przechowywania obrazów oraz oprogramowanie do przeglądania filmów poklatkowych oraz pomiaru i analizy komórek i wszelkich biosensorów fluorescencyjnych. Udostępniamy szczegółowy protokół z wieloma wskazówkami dotyczącymi prowadzenia mikroskopii poklatkowej hodowanych komórek nawet przez kilka dni przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej jasnego pola i/lub szerokokątnego. Protokół ten może być stosowany dla dowolnej linii komórkowej, która może być hodowana w kulturze, w celu zbadania ich reakcji na terapie przeciwnowotworowe. Podajemy przykłady danych pozyskanych i przeanalizowanych przy użyciu wielu różnych genetycznie kodowanych biosensorów fluorescencyjnych oraz przykład mikroskopii z kontrastem fazowym, pokrótce omawiamy różne typy sond, zalety i wady długoterminowego śledzenia poklatkowego i podłużnego, czego można się nauczyć dla tego podejścia, które jest trudne do zrozumienia z podejść niebezpośrednich, oraz niektóre odmiany, które, mamy nadzieję, będą interesujące i wartościowe dla niedoświadczonych badaczy, którzy tego nie zrobili z wykorzystaniem tego podejścia, a także doświadczonym badaczom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół wykorzystuje parametry zdefiniowane przez eksperymenty na rysunkach 4 i 6 dotyczące ustawień akwizycji i warunków eksperymentalnych. Wiele z tych parametrów można modyfikować w celu dopasowania do innych eksperymentów (np. czasy ekspozycji, binning, kanały fluorescencyjne itp.). Wszystkie procedury muszą być zgodne z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi oraz muszą zostać zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego. Strony internetowe producentów mikroskopów zawierają doskonałe informacje na temat obrazowania żywych komórek.

1. Mikroskopy i oprogramowanie do obrazowania

  1. Wykonuj obrazowanie żywych komórek na szerokiej gamie mikroskopów odwróconych. Najczęściej stosowanymi mikroskopami są mikroskopy szerokopolowe, epifluorescencyjne i konfokalne z wirującym dyskiem. W tym przypadku użyj zautomatyzowanego i zmotoryzowanego mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu z 200-watowym źródłem światła metalohalogenkowego.
  2. Zaopatrz się w komorę środowiskową typu stage-top lub mikroskopową. W tym przypadku należy użyć komory środowiskowej typu stage top.
  3. Korzystaj z komercyjnego oprogramowania do obsługi mikroskopów z narzędziami do wykonywania mikroskopii poklatkowej.
  4. Do analizy obrazu należy używać dostępnego na rynku oprogramowania lub ImageJ. Wiele innych narzędzi analitycznych jest dostępnych na rynku, a także programy na zamówienie, z których wiele zostało opublikowanych8,18.

2. Wizualizacja procesów komórkowych i reakcji fenotypowych

  1. Wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Sam kontrast interferencyjny różnicowy i kontrast fazowy mogą być bardzo pouczające w badaniu odpowiedzi na odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe. Procesy te mogą obejmować mitozę, ruchliwość komórek i apoptozę.
  2. Wizualizacja struktur komórkowych, organelli i procesów za pomocą biosensorów fluorescencyjnych. Sondy fluorescencyjne są przydatne w śledzeniu określonych procesów subkomórkowych. Mogą one obejmować dynamikę mikrotubul, dynamikę retikulum mitochondrialnego i endoplazmatycznego, akumulację i lokalizację białek oraz sygnalizację molekularną (np. fosforylację, wapń).

3. Przygotowanie próbek

  1. Hoduj komórki w certyfikowanych naczyniach do hodowli komórkowych w standardowym, wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych (np. 37 oC, 5% CO2, 80% wilgotności względnej).
    1. Hoduj komórki HT1080 w MEM za pomocą EBSS. Uzupełnij pożywkę o 10% v/v FBS, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v pirogronianu sodu i 1% v/v aminokwasów endogennych.
  2. Dwa dni przed obrazowaniem umieść 50 000 komórek HT1080 FUCCI w 3 dołkach 12-dołkowego naczynia ze szklanym dnem #1,5 w certyfikowanym sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Dostosuj liczbę posianych komórek, aby osiągnąć ~60% konfluencji na początku eksperymentu. W zależności od linii komórkowej i charakteru eksperymentu gęstość komórek może być mniejsza.
    Uwaga: Gęstość komórek może mieć głęboki wpływ na wzrost linii komórkowej i na wyniki eksperymentalne. Policz komórki, aby zminimalizować zmienność między eksperymentami wynikającą z gęstości.
    1. W zależności od komory środowiskowej i warunków niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu, płytki w jednodołkowych szalkach (zwykle 35 lub 60 mm), 4-dołkowych szalkach 35-milimetrowych, 6-, 12- lub 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych lub szkiełkach nakrywkowych w różnych formatach. Używaj płytek ze szklanym dnem ze szkłem #1.5, ponieważ większość soczewek obiektywowych jest zoptymalizowana pod kątem tej grubości szkła, a obrazowanie za pomocą plastiku do hodowli komórkowych jest bardzo słabe.
      Uwaga: Niektóre linie komórkowe nie rosną i nie przetrwają na szkle. W takich przypadkach szkło może być powlekane w celu zwiększenia przylegania komórek (np. polilizyna lub kolagen). Niektóre firmy produkują plastik do optycznych hodowli komórkowych, należy określić empirycznie, czy jest to realna opcja.

4. Konfiguracja komory środowiskowej

  1. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów należy ustawić komorę środowiskową tak, aby działała przy wilgotności ~80%, a temperatura w pozycji próbki wynosiła 37 oC. Większość hodowanych komórek rośnie w atmosferze 5% CO2 / zrównoważonej atmosfery powietrznej ze względu na bufor wodorowęglanu sodu w pożywce. W zależności od konfiguracji, ustaw regulator środowiskowy na 5% CO2 i zmiesza 100% CO2 z powietrzem lub użyj wstępnie zmieszanego, certyfikowanego 5% CO2 / równoważącego gazu powietrznego. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi natężeń przepływu gazu.
    Uwaga: Niektóre linie komórkowe rosną w pożywce niezależnej od CO2 , w którym to przypadku mogą być utrzymywane bez CO2 . Dostępne są również specjalnie zaprojektowane nośniki do obrazowania, które ograniczają dodawanie związków autofluorescencyjnych. Wzrost w tych pożywkach dla pożądanego typu komórki musi być wcześniej określony empirycznie.
  2. Przed obrazowaniem upewnij się, że zbiornik na wodę jest napełniony (zgodnie ze wskazówkami producenta) sterylną wodą destylowaną. Włącz komorę środowiskową do żądanego ustawienia temperatury i umieść ją we wstawce stolika mikroskopu. Aby oszczędzać gaz, nie rozpoczynaj przepływu w tym momencie.
    Uwaga: Jeśli między komorą sceniczną a wstawką sceniczną jest jakakolwiek wolna przestrzeń i/lub jakiekolwiek napięcie przewodów łączących z komorą, może to wprowadzić do eksperymentu artefakty ruchu.
    1. Połóż kawałki folii parafinowej na krawędziach otworu wstawnego stolika przed włożeniem do niego komory, aby połączyć komorę ze stolikiem i upewnij się, że żadne połączenia nie ciągną się za komorę.
  3. Pozwól, aby komora zrównoważyła się do 37 oC. Utrzymuj stabilną temperaturę, aby zapobiec wahaniom temperatury podczas obrazowania, które mogą wpływać na fizjologię komórki i powodować dryft. Osiągnięcie równowagi temperaturowej zwykle wymaga od 30 minut do 1 godziny, w zależności od środowiska.
    1. Włóż "atrapę" naczynia z wodą z dołków do komory podczas podgrzewania. Naczynie do obrazowania wypełnione wodą naśladuje próbkę, pomagając zapewnić, że komora jest wystarczająco ogrzana i ustabilizowana. Napełnianie komory wstępnie podgrzaną sterylną wodą skraca czas potrzebny do stabilizacji temperatury i minimalizuje spadek temperatury po dodaniu próbki doświadczalnej.

5. Ustawienie mikroskopu

  1. Włącz mikroskop, powiązany komputer i wszystkie wymagane urządzenia peryferyjne.
    1. W zależności od źródła światła poczekaj z włączeniem go, aż będzie potrzebne (np. dioda LED).
  2. Gdy wieżyczka obiektywu znajduje się nisko, wybierz obiektyw 20X 0,7 NA, który ma być używany.
  3. Umieść próbkę nad obiektywem - ułatwi to odnalezienie komórek, gdy próbka znajduje się w komorze.
  4. Zdefiniuj parametry obrazowania w tym momencie, jeśli są znane z poprzednich eksperymentów.

6. Transport komórek do mikroskopu i do komory

  1. Komórki, które mają być zobrazowane, należy przetransportować z inkubatora do komory środowiskowej. Upewnij się, że zostanie to zrobione szybko, aby ograniczyć wpływ atmosfery o stosunkowo niskiej zawartości CO2 i obniżonej temperatury na ogniwa. Postępuj zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu próbek i sprzątania w przypadku wycieku.
    1. Umieść komórki w szczelnie zamkniętym pojemniku styropianowym lub izolowanej torbie, aby uniknąć dużych zmian środowiskowych.
  2. Włóż próbkę naczynia do obrazowania do komory zgodnie ze wskazówkami producenta.
  3. Po zabezpieczeniu ogniw w komorze środowiskowej należy uszczelnić komorę, aby utrzymać stabilne środowisko i natychmiast włączyć źródło (źródła) gazu atmosferycznego.
    1. Ponieważ niektóre komory środowiskowe nie wykorzystują szczelnej, szczelnej pokrywy, aby opóźnić parowanie, na pożywkę wzrostową należy nałożyć sterylny, certyfikowany przez zarodki olej mineralny. Owinąć przepuszczaną gazem folię parafinową wokół krawędzi obwodowych naczynia na próbkę, uważając, aby nie zasłaniać szklanego obszaru obrazowania. Można zastosować miejscowe, wtórne metody nawilżania. Kondensacja na pokrywie naczynia na próbkę może zmniejszyć wydajność mikroskopii w jasnym polu.
  4. Aby zminimalizować skutki dryfu termicznego na wczesnym etapie eksperymentu, należy odczekać 30 minut przed rozpoczęciem filmu poklatkowego. Wymagany czas różni się w zależności od wielkości naczynia do obrazowania i innych czynników. Określ empirycznie.

7. Konfiguracja obrazowania

  1. Wybierz warunki obrazowania, które będą najlepiej reprezentować dane. Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć fototoksyczności, ograniczając czas ekspozycji, używając światła o mniejszej intensywności i wybierając sondy, które są wzbudzane przez dłuższe fale światła.
  2. Zdefiniuj płaszczyznę x, y i z oraz żądane długości fal dla każdej pozycji, która ma być obrazowana. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona liczbą pozycji i długościami fal. W przypadku długotrwałego upływu czasu większości procesów komórkowych należy uzyskać jeden obraz co 10 - 20 minut; Wyższa rozdzielczość czasowa (krótkie interwały, np. 1 min) zapewnia więcej punktów danych, a tym samym bardziej niezawodne śledzenie komórek, ale także skutkuje bardziej zintegrowaną ekspozycją na światło i większymi zestawami danych.
    1. Ponieważ HT1080 FUCCI mają dynamiczne zielone i czerwone białka fluorescencyjne (patrz reprezentatywne wyniki), należy stosować następujące czasy ekspozycji: FITC/GFP - 50 ms, Texas Red/TRITC - 40 ms, Brightfield - 20 ms. Użyj pojemnika 2 x 2.
  3. Włącz autofokus sterowany programowo przy użyciu parametrów domyślnych w ustawieniach zaawansowanych. Zdefiniuj zakres autofokusa 10 μm z zalecanym rozmiarem kroku. Pamiętaj, aby zrobić to przed rozpoczęciem filmu poklatkowego. Autofokus przy obrazach w jasnym polu i nigdy z fluorescencją w celu zmniejszenia fototoksyczności i fotowybielania.
    1. Korzystaj z systemów automatycznego ustawiania ostrości sterowanych programowo w dowolnym mikroskopie z zmotoryzowanym stolikiem i bezpośrednio skoncentruj się na próbce. Mogą jednak ograniczyć szybkość akwizycji eksperymentu. Sterowane sprzętowo systemy ciągłego ustawiania ostrości dobrze sprawdzają się w mikroskopii poklatkowej i poprawiają szybkość, umożliwiając obrazowanie większej liczby pozycji lub większą szybkość akwizycji. Polegają one jednak na wykrywaniu granicy faz powietrze-szkło i mogą stracić ostrość próbki przy różnicach w grubości szkła w całym odwiercie.
  4. Zastąp połowę pożywki pożywką zawierającą pożądane stężenie leku, które zostało podgrzane do 37 oC. Częściowa wymiana pożywki pomaga zmniejszyć dryft termiczny. Warunki w tym eksperymencie to nośnik (DMSO), 1 μM selinexor i 10 μM PD0332991,
    Uwaga: Ten krok można również wykonać po rozpoczęciu pobierania, wstrzymując i ponownie uruchamiając eksperyment. Pozwala to na podłużne śledzenie odpowiedzi pojedynczych komórek przed i po leku. Jeśli stabilność leku lub metabolizm jest problemem, wstrzymanie i wymianę nośnika można wykonać tą samą metodą. Aby przetestować degradację lub metabolizm leku, pożywki z leczonych komórek można również umieścić na komórkach naiwnych w celu zbadania działania leku.
  5. Rozpocznij film poklatkowy.
  6. W trakcie trwania filmu poklatkowego upewnij się, że obrazowane pola pozostają ostre, a komora utrzymuje wilgotność 37 oC.
    1. Dostosuj ostrość zgodnie z potrzebami, wstrzymując akwizycję w odstępie czasu między punktami czasu.
  7. W razie potrzeby dolajcie wody do komory podczas dłuższych eksperymentów. Unikać chłodzenia komory poprzez dodawanie wstępnie podgrzanej, sterylnej wody destylowanej o temperaturze 37 oC.

8. Zakończenie filmu poklatkowego

  1. Po zakończeniu eksperymentu zatrzymaj akwizycję, jeśli nie została ustawiona na automatyczne zatrzymanie.
  2. Upewnij się, że film poklatkowy został poprawnie zapisany na dysku twardym, chociaż większość pakietów oprogramowania automatycznie zapisuje się podczas akwizycji, jeśli nie zostanie prawidłowo zakończona, dane mogą zostać utracone.
  3. Wyjąć komorę z mikroskopu i wyrzucić komórki do odpadów niebezpiecznych biologicznie zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego.

9. Śledzenie podłużne i analiza danych poklatkowych

  1. Wybierz metodologię analizy, która jest odpowiednia dla procesów biologicznych, które Cię interesują. Dla konkretnych zastosowań wyprodukowano wiele wtyczek do ImageJ, programów korzystających z MatLab i niestandardowych platform. Poniższa metodologia obejmuje śledzenie jąder i analizę jądrowych sond fluorescencyjnych, jak pokazano na rysunkach 4 i 5.
  2. Otwórz stosy obrazów .tif dla używanych kanałów w ImageJ. Alternatywnie, otwórz pliki natywne z programu akwizycyjnego bezpośrednio w ImageJ za pomocą wtyczki Bioformats.
  3. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) w jądrze jednej komórki, korzystając z obrazu jasnego pola lub kanału etykiety jądrowej (jeśli jest używany) i dodaj go do menedżera ROI. Uwaga: Jeśli zobrazowane komórki mają etykietę jądrową (np. histon H2B-EGFP), wówczas automatyczne śledzenie komórek może być wykorzystane do stworzenia obszarów zainteresowania (ROI) reprezentujących poszczególne jądra w czasie.
  4. Przejdź do następnego punktu czasowego i umieść ROI w tym samym jądrze. Dodaj zwrot z inwestycji do menedżera zwrotu z inwestycji.
  5. Kontynuuj śledzenie i tworzenie ROI dla pojedynczej komórki, dopóki nie wystąpi zdarzenie komórkowe (mitoza, apoptoza itp.) lub komórka nie będzie już mogła być śledzona (tj. wyjdzie poza kadr lub eksperyment się zakończy).
  6. Po ustaleniu ROI dla komórek w czasie, gdy znajdują się w terenie, nałóż je na interesujące kanały fluorescencyjne. Zmierz średnią intensywność fluorescencji w każdym kanale dla każdego punktu czasowego. Zapisz listę ROI do późniejszego wykorzystania.
    1. W ramach ROI można dokonywać różnych pomiarów dla zastosowań w różnych eksperymentach. Kliknij przycisk Analysis (Analiza→ Ustaw pomiary..., aby wyświetlić menu umożliwiające wybór metody analitycznej (np. średnia intensywność w ramach ROI, zintegrowana intensywność itp.).
  7. Odnotowuj losy poszczególnych komórek (np. apoptoza, podział, przeżycie) podczas śledzenia. Pozwala to na tworzenie krzywych przeżycia i dalszą analizę populacji.
  8. Mając średnią intensywność dla obu kanałów, utwórz wykres punktowy, aby wyświetlić dynamikę cyklu komórkowego w odpowiedzi na terapie (Figura 5B, C).
    Uwaga: Wykresy mogą być tworzone dla poszczególnych komórek w czasie lub uśredniane dla populacji śledzonych komórek. Obrazowanie ilościowe może mieć kluczowe znaczenie dla ustalenia złożonych odpowiedzi i relacji komórkowych w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe. Długoterminowa mikroskopia poklatkowa, śledzenie podłużne i analiza danych to proces wieloetapowy, z wieloma opcjami rodzaju mikroskopii i narzędzi analitycznych, i jest zgodny z ogólnym zarysem przedstawionym na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długoterminowa mikroskopia poklatkowa i bezpośrednie śledzenie podłużne pozwalają na badanie wielu efektów przeciwnowotworowych podczas reakcji na lek. Zgodnie z ogólnym zarysem na rycinie 1 pokazano wiele przykładów komórek wyrażających zwalidowane reportery fluorescencyjne, które były leczone lekami przeciwnowotworowymi, śledzone i analizowane przy użyciu różnych podejść.

Sama mikroskopia kontrastu fazowego je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zalety mikroskopii poklatkowej i śledzenia podłużnego

Mikroskop jest idealnym instrumentem do badań podłużnych reakcji leków, ponieważ pozwala badaczom śledzić pojedyncze komórki i ich losy, a także całą populację. Zmienność odpowiedzi na lek w obrębie populacji komórek jest głównym problemem dla projektowania terapii przeciwnowotworowych. Śledzenie podłużne pojedynczych komórek pozwala badaczom obserwować tę zmienność i zacząć rozumieć podstawowe mechanizmy i konsekwencje w o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Joshua Marcus za wsparcie techniczne i Jolien Tyler, Ph.D., Dyrektor Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, za porady techniczne. Praca ta była wspierana przez fundusze z University of Colorado Boulder i University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. jest częściowo wspierana przez grant na szkolenie przeddoktoranckie z NIH (T32 GM008759). Dziękujemy firmie Karyopharm Therapeutics, Inc. za selinexor i Merck Serono za inhibitor Kinesin-5. Plazmidy FUCCI pochodzą od Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japonia) za pośrednictwem MTA. mCherry-BP1-2 pochodził z firmy Addgene. HeLa wykazujące ekspresję H2b-mCherry i β-tubuliny-EGFP pochodzą od Daniela Gerlicha (IMBA, Austriacka Akademia Nauk, Austria).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taxol (paklitaksel)SigmaT7191lek stabilizujący mikrotubule
EtopozydSelleckchemS1225inhibitor topoizomerazy II
SelinexorKaryopharm Therapeuticsnainhibitor XPO1/CRM1, prezent
Inhibitor Kinesin-5Merck Serononaprezent, dostępny również w American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
Pożywka do wzrostu komórekHyClone (Fisher) lub Mediatechdostępnych jest wiele firm
5% CO2 / powietrze równoważące, certyfikowaneAirgasZ03NI7222004379
35 mm Miska, szklane dno 20 mmCellvisD35-20-1.5-Nwiele firm
35 mm 4-dołkowa miska, szklane dno 20 mmCellvisD35C4-20-1.5-Ndostępnych jest wiele firm
35 mm Talerz z siatką szklane dnoMatTekP35G-2-14-CGRDdostępnych jest wiele firm
Multi-well, szklane dnoCellvisP12-1.5H-N dostępnychjest wiele firm
Mikroskop odwróconej epifluorescencji Olympus IX81Sterownik Olympus
Olympus IX2-UCBOlympus
PRIOR LumenPro200Prior ScientificLumen200PRO
PRIOR Proscan III KomoraPrio ScientificH117
STEVInVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Sterownik środowiskowyInVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD ze sterownikiemHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon Nikon
laserowe uruchomienie Nikon
SOLA lekki silniklumencor
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
Komora klubowa TOKAI HITTOKAI HITTIZSH
dostępnych Stopień zmotoryzowany

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
  5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391(2015).
  35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
  51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Time lapse MicroscopySingle Cell TrackingAnti cancer TherapeuticsHT1080 CellsEnvironmental ChamberFluorescent BiosensorsCell Growth AnalysisChromosome DynamicsDNA DamageCell Death

Powiązane artykuły