Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53995

⸱

20 września 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Streszczenie

Ludzkie pierwotne cytotrofoblasty kosmkowe są bardzo użytecznym źródłem komórek pierwotnych do badania funkcji łożyska i mechanizmów regulacyjnych oraz do zrozumienia chorób związanych z ciążą. W tym protokole ludzkie pierwotne cytotrofoblasty kosmkowe świeżo wyizolowane z łożyska za pomocą standardowego protokołu DNaza / trypsyna są mikroporowane małym interferującym RNA (siRNA). Takie podejście zapewniło większą skuteczność transfekcji siRNA w porównaniu z metodą opartą na lipofekcji. Transfekowane komórki mogą być następnie analizowane za pomocą standardowego Western blot w ciągu 3-4 dni po transfekcji. Ponadto, przy użyciu hodowanych pierwotnych cytotrofoblastów kosmkowych, zoptymalizowano analizę testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i przeprowadzono ją na ekstraktach od 1 do 4 dni. Wykorzystanie tych hodowanych komórek pierwotnych i opisany protokół pozwalają na ocenę wpływu określonych genów i czynników transkrypcyjnych w procesie różnicowania kosmków cytotrofoblastów w warstwę komórkową podobną do syncytiotrofoblastów. Jednak ograniczony okres czasu dopuszczalny w hodowli wyklucza stosowanie metod wymagających więcej czasu, takich jak tworzenie stabilnej populacji komórek. Dlatego badanie tej populacji komórek wymaga wysoce zoptymalizowanych protokołów transferu genów.

Wprowadzenie

Dysfunkcja łożyska u człowieka jest związana z rozwojem kilku chorób związanych z ciążą, takich jak stan przedrzucawkowy i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu 1. Ważnym składnikiem komórkowym łożyska są trofoblasty, które można sklasyfikować jako cytotrofoblasty kosmkowe lub kosmkowe. Po fuzji cytotrofoblasty kosmkowe dalej różnicują się w warstwę syncytiotrofoblastu, wielojądrzastą strukturę komórkową odgrywającą ważną rolę w wymianie płodowo-matczynej i produkcji hormonów 2. Ludzkie pierwotne cytotrofoblasty kosmkowe i ich zróżnicowane odpowiedniki stanowią ważne próbki biologiczne i pozwalają naukowcom badać szereg procesów związanych z łożyskiem, takich jak fuzja komórek, w hodowli. Ponadto prowadzone są znaczne wysiłki w celu zidentyfikowania markerów, które ułatwią odpowiednie leczenie i udoskonalą terapie profilaktyczne specyficzne dla chorób związanych z ciążą. Laboratoria rutynowo izolują pierwotne ludzkie cytotrofoblasty kosmkowe ze świeżych łożysk, stosując standardową procedurę izolacji opartą na trawieniu trypsyną kosmków łożyska 3. Ponieważ hodowane cytotrofoblasty tracą zdolność do namnażania się i szybkiego różnicowania w warstwie podobnej do syncytiotrofoblastów po hodowli 4, potrzebne są bardzo skuteczne metody transfekcji i zoptymalizowane podejścia do analizy. Wcześniejsze badania określiły optymalne warunki transfekcji tych pierwotnych cytotrofoblastów 5. W artykule przedstawiono inną metodę transfekcji siRNA, która została wcześniej przetestowana w tym typie komórki 6. W porównaniu z podejściem opartym na lipofekcji, ta metoda mikroporacji poprawia transfekcję, co ocenia się na podstawie stopnia wyciszenia określonych genów.

Badania nad promotorem i ekspresją genów również pozwalają lepiej zrozumieć funkcję łożyska. Chociaż jest to trudniejsze w użyciu ze względu na krótki czas, w którym można hodować pierwotne cytotrofoblasty kosmków, można jednak zająć się analizami promotorów przy użyciu standardowych protokołów, jak opublikowano wcześniej 7. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) jest jedną z tych powszechnie stosowanych metod in vitro, pozwalającą na szybkie i łatwe monitorowanie interakcji DNA-białko. Ekstrakty jądrowe z tych pierwotnych trofoblastów wykorzystano do przetestowania regionu promotora Syncytyny-2 pod kątem określonych interakcji. Wyniki pokazały, że czynniki związane mogą być wykrywane w różnych punktach czasowych hodowli oraz w specyficzny i powtarzalny sposób.

Dane przedstawione w tym protokole potwierdzają, że nasze podejście do transfekcji i protokół EMSA mogą być używane do izolowanych pierwotnych cytotrofoblastów kosmkowych i będą bardzo przydatne do badania różnorodnych funkcji kosmkowych cytotrofoblastów w normalnych lub patologicznych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komisja bioetyczna UQAM zatwierdziła te protokoły, które są zgodne z wytycznymi komisji etycznej szpitala St-Luc Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montreal, Kanada). Uczestnicy podpisali formularz świadomej zgody.

1. Przygotowanie pożywki i izolacja pierwotnych kosmków cytotrofoblastów

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną dla pierwotnych cytotrofoblastów kosmkowych u ludzi, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco o 25 mM HEPES, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Przefiltrować przygotowane podłoże przez sterylny filtr 0,22 μm i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C w porcjach 50 ml.
  2. Wyizolować pierwotne cytotrofoblasty kosmkowe ze świeżych łożysk zgodnie ze standardowymi protokołami 3.
    1. Za pomocą szczypiec usuń błonę płodu z tkanki, delikatnie ją zdrapując, uważając, aby nie usunąć tkanki kosmkowej. Pozostałe kosmki łożyskowe pokrój w kostkę o wymiarach około 3 x 3 cm za pomocą skalpela i nożyczek. Dokładnie umyj wodą zawierającą 0,9% NaCl, aby usunąć krew matki.
      1. Trzymając każdą kostkę szczypcami, ostrożnie usuń kosmkową tkankę z pozostałych naczyń i tkanki włóknistej za pomocą nożyczek.
      2. Na 15 do 30 mg tkanki kosmkowej trawić czterokrotnie w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) zawierającym trypsynę (od 9,6 x 105 do 1,8 x 106 U; stężenie końcowe 1,2 mg/ml) i dezoksyrybonukleazę I (DNazę I) (stężenie końcowe 200 μg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z ciągłym wstrząsaniem><. Uwaga: Użyć 150 ml całkowitej objętości na pierwsze trawienie, 100 ml na drugie trawienie i 75 ml na dwa pozostałe trawienia.
    2. Zebrać sklarowany sklarowany składnik osadu i odwirować przy sile 1,250 x g przez 15 minut bez przerwy. Usunąć supernatant i komórki zawiesić w 1 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 1% penicyliny/streptomycyny.
    3. Warstwy rozproszonych komórek ułożyć na nieciągłym gradiencie krzemionki pokrytym poliwinylopirolidonem o stężeniu 5% - 70% (patrz Tabela 1 w celu przygotowania gradientu) i wirować przez 23 minuty przy 507 x g bez hamulca. Usunąć warstwę o gęstości od 1,017 do 1,033 przez aspirację i zebrać warstwy między 40% a 50% w gradiencie za pomocą nowej pipety. Dokładnie przemyć komórki 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 1% penicyliny/streptomycyny.
      Uwaga: Zebrana frakcja odpowiada gęstościom od 1,048 do 1,062, w której znajdują się trofoblasty.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Krótko wymieszaj komórki i dodaj 10 μl do nowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 10 μl błękitu trypanowego i ponownie delikatnie wymieszaj. Sporządzić zawiesinę komórek i napełnić komory hemocytometru. Policz komórki pod obiektywem 10X.
    5. Umieścić 1 x 106 i 4,5 x 106 komórek w oddzielnych probówkach do użycia odpowiednio w sekcjach 1.3 i 2. Pozostałe komórki wysiać w gęstości 1,5 x 106 komórek/basenik w uzupełnionej pożywce DMEM i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez maksymalnie 4 dni w przypadku innych doświadczeń.
  3. Ocena czystości izolowanych pierwotnych cytotrofoblastów kosmkowych
    1. Odwirować 1 x 106 świeżo wyizolowanych cytotrofoblastów w probówkach do mikrowirówek o sile 300 x g. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odwirować komórki przy 300 x g i usunąć PBS przez aspirację.
    2. Dodać 1 ml zimnego metanolu do komórek i inkubować w temperaturze -20 °C przez 20 min. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i usunąć metanol przez aspirację.
      Uwaga: Podczas pracy z metanolem należy używać maski kanistrowej, okularów ochronnych i gumowych rękawic.
    3. Dodać 1 ml PBS w temperaturze pokojowej w celu nawodnienia komórek, odwirować przy 300 x g i usunąć PBS przez aspirację.
    4. Inkubować komórki w PBS zawierającym FBS (rozcieńczenie 1:50 [v/v]) i odczynnik blokujący FcR (1:10) przez 45 minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania niespecyficznego wiązania.
    5. Przemyć dwukrotnie 500 μl PBS o temperaturze pokojowej, odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i usunąć PBS przez aspirację. Zawieś komórki w PBS o temperaturze pokojowej 100 μl.
    6. Inkubować komórki z mysim izotiocyjanianem monoklonalnej fluoresceiny (FITC) sprzężonym z klonem LP5K (1:200) przeciwko ludzkiemu przeciwciału cytokeratyny-7 (1:200) lub kontrolnemu niespecyficznemu przeciwciału dopasowanemu izotypowi w PBS zawierającym 0,2% BSA przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj komórki w PBS.
    7. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej 3. Do dalszych eksperymentów należy stosować preparaty komórkowe, które wykazują co najmniej 96% komórek CK-7-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.

2. Transfekcja siRNA ludzkich pierwotnych kosmków cytotrofoblastów

  1. Transfekcja ludzkich pierwotnych cytotrofoblastów kosmków za pomocą urządzenia do mikroporacji
    1. Przygotować płytki 6-dołkowe zawierające 2 ml uzupełnionej pożywki DMEM do inkubacji mikroporowanych komórek.
    2. Po wyizolowaniu pierwotnych cytotrofoblastów (patrz punkt 1.2) pobrać porcję komórek w zawiesinie i określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    3. Przenieść 1,5 x 106 komórek do probówki mikrowirówkowej i komórek osadu przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyć komórki 1 ml PBS (DPBS) firmy Dulbecco (bez Mg2+, Ca2+) i granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 100 μl buforu do resuspensji.
      Uwaga: Unikaj utrzymywania zawiesiny komórek dłużej niż 15-30 minut w temperaturze pokojowej, aby zmaksymalizować żywotność komórek i wydajność transfekcji.
    5. Dodać 300 ng siRNA Syncytyny-2 (lub siRNA zaszyfrowanego w grupie kontrolnej) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odessać mieszaninę komórka-siRNA za pomocą pipety do transfekcji o pojemności 100 μl. Włóż pipetę do stacji (patrz Lista materiałów) i poddaj ogniwa pojedynczemu impulsowi o napięciu 1 300 V o długości 30 ms.
    6. Natychmiast przenieść komórki na płytki 6-dołkowe (przygotowane w kroku 2.1.1) zawierające wstępnie podgrzane podłoże o temperaturze 37 °C, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
    7. Powtórzyć kroki 2.1.5 i 2.1.6 dla pozostałych próbek.
    8. Delikatnie kołysz płytką przez 30 sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze CO2 przez 24 do 48 godzin. Odświeżyć pożywkę hodowlaną 24 godziny po transfekcji.
    9. Oceń skuteczność transfekcji za pomocą analizy Western blot (patrz kroki od 3 do 6).
  2. Lipofekcja siRNA w ludzkich pierwotnych cytotrofoblastach
    1. Po wyizolowaniu cytotrofoblastów kosmkowych wysiać komórki w gęstości 1,5 x 106 komórek na studzienkę na płytkach 6-dołkowych w 2 ml pożywki hodowlanej i inkubować przez 18 godzin.
    2. Rozcieńczyć 300 ng siRNA specyficznego dla Syncytyny-2 (lub siRNA zaszyfrowanego w grupie kontrolnej) i 5 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml w całkowitej objętości 10 μl pożywki wolnej od antybiotyków i surowicy. Inkubować przez 5 minut.
    3. Wymieszać rozcieńczone odczynniki i inkubować przez dodatkowe 20 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć kompleks transfekcyjny. Dodać do mieszanki 90 μl pożywki bez antybiotyków i surowicy do końcowej objętości 100 μl.
    4. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytek 6-dołkowych (krok 2.2.1). Do każdej studzienki dodać 2 ml świeżej pożywki i 100 μl mieszanki transfekcyjnej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 24–48 godzin. Odświeżyć pożywkę hodowlaną 24 godziny po transfekcji.
    5. Oceń skuteczność transfekcji za pomocą analizy Western blot (patrz kroki od 3 do 6).

3. Przygotowanie lizatów z hodowli całych komórek

  1. Wyjmij pożywkę i wypłucz każdą studzienkę (z kroków 2.1.8 i 2.2.4) za pomocą wstępnie podgrzanego DPBS (bez Mg2+, Ca2+). Odessać DPBS i dodać 500 μl 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 1-3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 . Przerwać leczenie trypsyną, dodając 500 μl surowicy zawierającej pożywkę wzrostową.
    Uwaga: Użyć odpowiedniej objętości podłoża w zależności od rodzaju kolby/naczynia: 1 ml na 107 komórek/100 mm naczynie/150 cm2 kolby; 0,5 ml na 5 x 10 6 komórek /60 mm naczynie / 75 cm2 kolby.
  2. Przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, komórki osadu przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umyć komórki DPBS (wolne od Mg2+, Ca2+) i komórki osadu przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu. Umieść rurkę na lodzie. Zawiesić osad w 50-200 μlowatym, lodowatym buforze do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (patrz Tabela 2 dla składu buforu) zawierającym świeżo dodane inhibitory proteazy i fosfatazy w stężeniu końcowym 1x. Krótko zmieszaj rurkę i pozostaw na lodzie na 30 minut.
  4. Wirować w temperaturze 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie umieścić probówkę na lodzie. Za pomocą pipety przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki trzymanej na lodzie. Wyrzuć granulkę.

4. Przygotowanie ekstraktów jądrowych z hodowanych komórek

  1. Dla każdej studzienki (etap 1.2.5) przemyć wyhodowane cytotrofoblasty dwukrotnie 1 ml wstępnie podgrzanego DPBS (wolne od Mg2+, Ca2+). Odessać DPBS i dodać 500 μl 0,25% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 1-3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorzeCO2 i przerwać leczenie trypsyną, dodając 500 μl surowicy zawierającej pożywkę wzrostową.
  2. Przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, komórki osadu przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umyć komórki DPBS (wolne od Mg2+, Ca2+) i komórki osadu przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć cały sklarat sklarowany, nie naruszając osadu i umieścić probówkę na lodzie.
  3. Ekstrahuj białko jądrowe zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczyć stężenie białka w każdej próbce za pomocą testu ilościowego białka (test Bradforda lub test kwasu bicinchoninowego (BCA)).

5. Przygotowanie próbki i elektroforeza

  1. Określ stężenie białka dla każdego ekstraktu komórkowego za pomocą testu ilościowego białka (na przykład Bradford 8 lub BCA 9).
  2. Zgodnie z instrukcjami producenta (jeśli przeciwciała mogą być stosowane w warunkach redukcji i denaturacji), dodać równą objętość 2x buforu do próbki Laemmli (Tabela 2) do 20-30 μg białka całkowitego.
  3. Gotować lizaty komórkowe w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Podwielokrotność 50-100 μl lizatu, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania, a pozostałe probówki przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  4. Podczas podgrzewania próbek należy przygotować 1 l 1x działającego buforu (Tabela 2).
  5. Obracaj próbki w temperaturze 16 000 x g przez kilka sekund i umieść je na lodzie.
  6. Załaduj równą ilość białka do każdej studzienki 12% żelu SDS-PAGE (patrz Tabela 2 dla składu żelu) wraz z markerem masy cząsteczkowej. Uruchom żel na 1 do 2 godzin przy napięciu 100 V.

6. Przenoszenie białka z żelu do błony

  1. Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) metanolem na 1 minutę i przepłucz 1x buforem transferowym/10% roztworem metanolu. Zgodnie z instrukcjami producenta przenosić na 30 minut do 1 godziny w zależności od wielkości białka.
    Uwaga: Skuteczność nanoszenia można ocenić za pomocą barwienia czerwienią Ponceau przed etapem blokowania.

7. Barwienie przeciwciał

  1. Zablokować membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C przy użyciu 5% roztworu blokującego.
  2. Inkubować błonę z przeciwciałami anty-Syncytiny-2 (4 μg/ml; 1:5 000) 6 lub z dehydrogenazą antygliceraldehydo-3-fosforanową (GAPDH; 0,4 μg/ml; 1:500) w 5% roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C (anty-Syncytina-2) lub przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć membranę trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanym trisem (TBST; skład buforu znajduje się w tabeli 2) przez 5 minut.
  3. Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem anty-króliczym lub anty-mysim sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (1:10 000) w 5% buforze blokującym w TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyć membranę trzykrotnie w TBST przez 5 minut, a następnie spłukać w TBS. Wykrywaj sygnały za pomocą substratu do bibuły na bazie chemiluminescencji.

8. Znakowanie radioaktywne jednoniciowych oligonukleotydów

  1. Reakcja fosforylacji
    1. W probówce do mikrowirówek dodać 50 ng oligonukleotydu do przodu wraz z 1x buforem kinazy polinukleotydowej T4, 1 kinazą polinukleotydową T4 i 20 μCi (γ-32P) ATP i uzupełnić objętość reakcyjną do 20 μl wodą wolną od nukleaz.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zatrzymać reakcję przez dodanie 5 μl 0,5 M EDTA. Uzupełnić objętość do 50 μl wodą wolną od nukleaz.
  2. Usuwanie nieinkorporowanych nukleotydów z oligonukleotydów
    1. Przygotować kolumnę G-25 zrównoważoną buforem TE (tabela 2) zgodnie z instrukcjami producenta. Umieścić kolumnę w świeżej, wolnej od DNaz probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Powoli dodać 50 μl sondy (z kroku 8.1.2) na żywicę, uważając, aby nie naruszyć łoża żywicy. Wirować przez 2 minuty przy 350 x g, aby zebrać oczyszczoną próbkę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Umyć kolumnę G-25 36 μl wody wolnej od nukleaz i wirować przez 2 minuty w temperaturze 350 x g, aby zebrać ją w probówce do mikrowirówki.
  3. Hybrydyzacja z oligonukleotydem nici komplementarnej
    1. Przenieść znakowaną radioizotopowo sondę (86 μl) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 200 ng odwróconego oligonukleotydu i 1x buforu do wyżarzania (Tabela 2). Podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i pozostawić na noc w temperaturze pokojowej do schłodzenia.
    2. Przygotować nieradioaktywne dwuniciowe oligonukleotydy, dodając 50 ng nieznakowanych oligonukleotydów do przodu i do tyłu oraz 1x buforu do wyżarzania w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Uzupełnić objętość do 100 μl wodą wolną od nukleaz. Ogrzewać i przechowywać w temperaturze pokojowej zgodnie z opisem w kroku 8.3.1.

9. Przygotowanie niedenaturującego żelu poliakrylamidowego dla EMSA

  1. Przygotuj 4% natywny żel (10 x 12 cm) za pomocą grzebienia o średnicy 1,5 mm (patrz Tabela 2 dla składu żelu). Wyczyść wszystkie szklane płytki wodą destylowaną.
    Uwaga: Bardzo ważne jest, aby płytki były całkowicie wolne od detergentu jonowego, takiego jak SDS.
  2. Natychmiast wlać roztwór akrylamidu między płytki i pozostawić do rozpoczęcia polimeryzacji (około 30 min).
  3. Zmontuj aparat do elektroforezy i napełnij zbiornik 0,5x TBE. Uruchom żel przez 30 minut do 1 godziny przy napięciu 150 V przed załadowaniem próbki.

10. Reakcja wiązania DNA

  1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 10 μg ekstraktu jądrowego (krok 4.3) do 1x buforu wiążącego Gel Shift (Tabela 2) i uzupełnić końcową objętość do 10 μl wodą wolną od nukleaz. Jako kontrolę przygotuj probówkę bez ekstraktu jądrowego. Do reakcji konkurencji dodać 1 μl zimnego niespecyficznego lub swoistego dwuniciowego oligonukleotydu (etap 8.3.2).
  2. Do każdej reakcji dodać 1 μl sondy radioaktywnej z kroku 8.3.1. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodać 1 μl 10x buforu ładującego żel na reakcję i załadować każdą próbkę na żel przygotowany w sekcji 9.
  3. Uruchom żel przez 1 1/2 do 2 godzin przy napięciu 150 V. Po migracji owiń żel i szkło w folię spożywczą i umieść w kasecie naświetlającej pod ekranem luminoforowym. Pozostaw kasetę w temperaturze 4 °C na 24 godziny.
  4. Wyjmij ekran z kasety naświetlającej i włóż do urządzenia do obrazowania luminoforowego w celu skanowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do izolacji ludzkich pierwotnych cytotrofoblastów kosmkowych w celu przeprowadzenia zestawu doświadczeń przedstawionych w sekcji Protokół wykorzystano świeże łożyska z ciąż donoszonych. Po ich izolacji w pierwszej kolejności przeanalizowano czystość cytotrofoblastów z wykorzystaniem markera cytokeratyny 7 (Rysunek 1). Preparaty komórkowe barwiono przeciwciałem monoklonalnym przeciwko cytokeratynie 7. Rysunek 1 przedstawia wyniki typowego eksperymentu po o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania nad funkcją i rozwojem łożyska u człowieka zostały znacznie ulepszone dzięki protokołom mającym na celu optymalizację izolacji różnych populacji komórek łożyska. Jedną z najlepiej zbadanych populacji komórek łożyska pozostają kosmkowe cytotrofoblasty, których badanie przyniosło ogromne korzyści dzięki zoptymalizowanym protokołom umożliwiającym wydajną i niezawodną izolację. Umożliwiło to przeprowadzenie szeregu eksperymentów, takich jak transfekcja i badania promotorów. Korzystając z wcześniej opisanego protokołu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z National Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (#298527) (BB). CT był wspierany przez instytucjonalne stypendium FARE. AV było wspierane przez stypendium doktoranckie NSERC Grahama Bella. BB był kierownikiem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie Retrowirusologii Człowieka (Tier 2). Podziękowania dla Beatrix Beisner za pomoc w poprawieniu tekstu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HBSS bez  Ca2+, Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma#14060-057
DMEM Wysoki poziom glukozy bez HepesGibco#12100-061
Hepes (1 M)Gibco#15630-080
Penicylina-Streptomycyna-Neomycyna (100x)Gibco#15640-055
Amfoterycyna B Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O Sigma#M
Płodowa surowica bydlęcaGibco#16170-078 
Percoll Sigma#P-1644Do gradientu gęstości
Syncytin-2 siRNATechnologie Ambion Life#AM16708
Zaszyfrowane siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Trypsyna, typ I Sigma#T8003 DharmaFECT
Lipotransfekcja  odczynniki GEhealthcare# T-2001-01
Trypsyna / EDTATechnologie życia#25300-062
Koktajl inhibitorów proteazyRoche Diagnostic#11873580001
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
Przeciwciało anty-królicze IgG, związane z HRP Sygnalizacja komórkowa#7074
BM Chemiluminescencyjny substrat Western Blotting (POD)Roche Diagnostic#11500708001
DPBS Technologie życiowe#14287-080
Kinaza polinukleotydowa T4NEB#M0201S
ATP, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AkrylmidSigma 
TEMEDLife technologies#17919
Nadsiarczan amonuSigma 
Klon przeciwciała anty-ludzkiego cytokeratyny-7 LP5K, FITC sprzężonyz MilliporeCBL194FRozcieńczenie 1:200
FcR odczynnik blokujący Miltenyi Biotec130-059-901Rozcieńczenie 1:10
Cytometr przepływowy BD System AcuriAparat Becton Dickinson
Microporator MP-100 Cyfrowy bufor do
bio reprodukcji R (Neon Transfection System 100  &mikro; l Zestaw)Technologie życiaMPK10096
membrana PVDF MilliporeIPVH00010 Aktywacja metanolem
Przeciwciało anty-ludzkie GAPDHSanta Cruz Biotechnologysc-1371791:500
Przeciwciało anty-królicze kozy sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) lub przeciwciało anty-mysieSygnalizacja komórkowa#70741:10,000
Peroksydaza chrzanowa (HRP)-sprzężona z kozą przeciwciało anty-mysieSygnalizacja komórkowa#7076 1:10 000
NE-PER Odczynnik do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznejThermo Scientific#78833
Kolumna G-25 GE Healthcare#27-5325-01
Urządzenie do obrazowania chemiluminescencji i fluorescencjiMontré al BiotechFusion FX5
4% natywny żelDomowy
PBSDomowej roboty1x
Osobisty system obrazowania molekularnego (PMI)BioRad
#A9099#A3678

Bibliografia

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468(2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Technika mikroporacjianaliza EMSAcytometria przepływowaWestern blotsiRNA przeciwko syncytynie-2oddziaływanie białko-DNAizolacja pierwotnych komórekżywotność komórek
Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.