Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54066

⸱

23 czerwca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, 2Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Science, 3Institute of Plant Sciences, Agricultural Research Organization, Volcani Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Streszczenie

Krioskaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) próbek z zamarzaniem pozwala na badanie struktur biologicznych w warunkach zbliżonych do rodzimych. W tym miejscu opisujemy technikę badania supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych (tylakoidalnych) w próbkach liści. Osiąga się to poprzez zamrażanie tkanek liści pod wysokim ciśnieniem, szczelinowanie zamrażalne, powlekanie dwuwarstwowe i wreszcie obrazowanie kriogeniczne. Zastosowanie metody powlekania dwuwarstwowego pozwala na uzyskanie obrazów o dużym powiększeniu (>100 000X) przy minimalnym uszkodzeniu wiązki zamrożonych i uwodnionych próbek, a także przy minimalnych efektach ładowania. Korzystając z opisanych procedur, zbadano zmiany w supramolekularnym rozmieszczeniu kompleksów białkowych anteny fotosystemu i zbierających światło, które zachodzą podczas odwadniania rośliny zmartwychwstania Craterostigma pumilum, in situ.

Wprowadzenie

Fotosynteza tlenowa, pochodząca od starożytnych cyjanobakterii, została odziedziczona przez glony i rośliny lądowe w wyniku endosymbiotycznych zdarzeń, które doprowadziły do rozwoju organelli chloroplastowych. We wszystkich współczesnych fototrofach tlenowych fotosyntetyczny transport elektronów oraz generowanie siły napędowej protonów i mocy redukcyjnej odbywa się w spłaszczonych pęcherzykach przypominających worki, zwanych błonami "tylakoidalnymi". Błony te zawierają kompleksy białkowe, które przeprowadzają reakcje fotosyntezy sterowane światłem i zapewniają pożywkę do transdukcji energii. Błony tylakoidalne roślin i (niektórych) glonów są zróżnicowane na dwie odrębne domeny morfologiczne: ściśle przylegające obszary błony zwane "grana" i nieułożone błony, które łączą się ze sobą, zwane "blaszkami zrębu"1. Począwszy od wczesnych lat siedemdziesiątych XX wieku, przeprowadzono różne badania szczelinowania zamrażalno-szczelinowego błon tylakoidalnych roślin i glonów. Po pęknięciu przez zamrożenie błony pękają wzdłuż swojego hydrofobowego rdzenia2, tworząc powierzchnię egzoplazmatyczną (EF) i powierzchnię protoplazmatyczną (PF), w zależności od przedziału komórkowego, z którym graniczy półbłona, jak pierwotnie ukuto przez Brantona i wsp. W 1975r. 3. Tyrakooidy roślinne i glony mają cztery różne powierzchnie pęknięcia: EFs, EFu, PFs i PFu, przy czym "s" i "u" oznaczają odpowiednio "ułożone" i "nieułożone" obszary błony. Kompleksy białek błonowych, które nie są podzielone ani uszkodzone, mają tendencję do pozostawania po stronie E lub P błony. Wstępne obserwacje, że różne powierzchnie pęknięć tylakoidów zawierają cząstki o różnych rozmiarach i gęstościach4, oraz liczne badania, które nastąpiły później, doprowadziły do identyfikacji i korelacji między obserwowanymi cząstkami a kompleksami białek błonowych, które przeprowadzają reakcje świetlne5-13 (patrz także przeglądy14,15).

Eksperymenty z zamrażaniem i pękaniem błon tylakoidowych są zazwyczaj przeprowadzane na preparatach chloroplastów lub izolowanych błon tylakoidów (ale patrz16,17), ryzykując jakiekolwiek zmiany w organizacji strukturalnej i/lub supramolekularnej, które mogą wystąpić podczas procedury izolacji. Po złamaniu repliki są przygotowywane przez odparowanie platyny/węgla (Pt/C), następnie przez grubą warstwę węgla (C), a na końcu trawienie materiału biologicznego18. Repliki są wizualizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Tradycyjna technika zamrażania-pękania-repliki nadal służy jako ważne narzędzie do badania supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych i ich adaptacji do różnych, np. świetlnych, warunków19-23.

W naszym ostatnim badaniu homoiochlorofilowej rośliny zmartwychwstania Craterostigma pumilum24, chcieliśmy zbadać zmiany w supramolekularnej organizacji błon tylakoidowych, jak również w ogólnej organizacji komórek, podczas odwodnienia i ponownego nawodnienia. Wyjątkowość homoiochlorofilnych gatunków wskrzeszenia polega na tym, że są one w stanie przetrwać warunki wysuszenia w swoich tkankach wegetatywnych (liściach), zachowując przy tym swój aparat fotosyntetyczny. Gdy woda jest dostępna, rośliny te odzyskują siły i wznawiają aktywność fotosyntetyczną w ciągu kilku godzin do kilku dni25. W tym badaniu obrazowanie krioskaningowe EM (SEM) próbek liści popękanych przez lód połączono z zamrażaniem wysokociśnieniowym w celu kriounieruchomienia próbki. Procedury te umożliwiają wizualizację zamrożonych, uwodnionych próbek biologicznych w stanie zbliżonym do ich stanu ojczystego26. Jedną z głównych zalet jest to, że próbki są badane bezpośrednio po szczelinowaniu zamrażalniczym i powlekaniu, bez następujących po sobie etapów. Jest to szczególnie istotne dla badań roślin o różnej względnej zawartości wody (RWC), ponieważ ich stan uwodnienia jest utrzymywany podczas przygotowania. Jednak jedną z krytycznych wad jest to, że zamrożone uwodnione próbki mogą ulegać uszkodzeniu wiązki podczas obrazowania, zwłaszcza gdy są skanowane przy dużych powiększeniach, co jest wymagane do dokładnego pomiaru wielkości kompleksów fotosyntetycznych. Aby temu zaradzić, zastosowano metodę zwaną "powlekaniem dwuwarstwowym" (DLC)27,28 w połączeniu ze specyficznymi warunkami obrazowania kriogenicznego. W rezultacie uzyskano próbki, które są znacznie mniej wrażliwe na wiązkę i pozwoliły na wyjaśnienie cennych informacji na temat organizacji supramolekularnej białek fotosyntetycznych i innych składników komórkowych rośliny zmartwychwstania C. pumilum przy dużych powiększeniach in situ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Krioutrwalanie tkanek liściowych przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem

Uwaga: Ta sekcja opisuje, jak przeprowadzić zamrażanie tkanek liści pod wysokim ciśnieniem w eksperymencie z zamrażaniem i pękaniem. W celu zapoznania się z uwagami dotyczącymi próbek roślin, patrz29. Można to dostosować do innych rodzajów tkanek lub próbek z pewnymi modyfikacjami.

  1. Używając rogu żyletki, podrap spód wnęki 0.1 mm aluminiowej płytki o średnicy 0.1/0.2 mm (Rysunek 1). Przygotuj co najmniej kilkanaście płytek krwi (6 próbek). Uważaj, aby nie tworzyć śladów noża na obwodzie dysku.
    1. Po zarysowaniu umyj dyski w absolutnym etanolu, pozostaw do wyschnięcia i przechowuj w czystym naczyniu.
  2. Przygotuj zamrażarkę wysokociśnieniową zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnij komorę alkoholową zamrażarki wysokociśnieniowej izopropanolem.
  3. Przygotuj domowe urządzenie do infiltracji wspomaganej próżnią, aby zastąpić gaz znajdujący się w tkance liścia płynem.
    1. Szczelnie przymocować końcówkę pipety o pojemności 200 μl do końca strzykawki o pojemności 10 ml. Odetnij ~1 cm końcówki. Zrób otwór w nakrętce probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby ściśle dopasować odciętą końcówkę. Podciśnienie można wytworzyć wewnątrz probówki, pociągając za tłok strzykawki.
  4. Odetnij mały kawałek liścia z rośliny za pomocą żyletki i za pomocą pęsety umieść liść w probówce mikrowirówkowej wypełnionej do połowy 1-heksadecenem. Naciekaj płynem przestrzenie międzykomórkowe liścia, delikatnie pociągając za tłok, aby wytworzyć podciśnienie, przytrzymaj przez około 30 sekund, a następnie powoli zwolnij tłok.
  5. Usuń kawałek liścia z rurki za pomocą pęsety. Przytnij liść żyletką, jeśli jest grubszy niż 0,2 mm i wytnij mały kawałek, który zmieści się w płytce krwi.
  6. Umieść czystą płytkę krwi porysowaną stroną do góry w uchwycie zamrażarki, a następnie umieść w niej wycięty kawałek liścia. Wypełnij pozostałą przestrzeń otaczającą liść 1-heksadecenem. Zamknij kanapkę za pomocą innej płytki, tak aby zadrapania były skierowane w stronę liścia.
  7. Zamknij i dokręć uchwyt, a następnie włóż go do komory maszyny. Następnie naciśnij przycisk "Jet", aby zamrozić (~2 100 barów przez 300 - 500 ms) i szybko przenieś uchwyt do ciekłego azotu. Ostrożnie wyjmij zamrożoną kanapkę z uchwytu za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety, uważając, aby nie złamać kanapki.
    Uwaga: Zamknięte mrożone kanapki można natychmiast zamrozić lub przechowywać w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania. Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać odzieży ochronnej i okularów ochronnych.

2. Pękanie zamrażające i powłoka dwuwarstwowa27,28

  1. Przygotować maszynę do szczelinowania zamrażalniczego do użycia, w tym oba pistolety do odparowywania platyny/węgla (Pt/C), jak i węgla, zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw pistolet Pt/C pod kątem 45 stopni, a pistolet węglowy pod kątem 90 stopni.
    1. Wstępnie zaprogramuj schemat powlekania warstwy Pt/C o długości 2 nm (szybkość powlekania 0,02 - 0,04 nm/s) i warstwy węgla o długości 6 nm (przy ~0,1 nm/s).
      1. Wprowadź ustawienia na ekranie maszyny do zamrażania i pękania. Wybierz numer użytkownika, w którym zostanie zapisany schemat powlekania.
      2. Wybierz Pt/C dla "Warstwy 1". Wybierz ramy czasowe, np. 5 min (aby przekroczyć niezbędny czas potrzebny na wykonanie powłoki). Użyj strzałek góra-dół, aby zdefiniować grubość 2 nm.
      3. Naciśnij przycisk "Warstwa", aby przejść do warstwy 2. Powtórzyć krok 2.1.1.2, z wyjątkiem wyboru węgla i zdefiniowania grubości 6 nm.
    2. Przetestuj i dostosuj działanie pistoletu.
      1. Wybierz "Warstwa 1". Wybierz pistolet Pt/C, naciskając przycisk "GUN1" i naciśnij przycisk "ON" na jednostce sterującej parowaniem maszyny do zamrażania i szczelinowania. Monitoruj szybkość parowania i reguluj ją za pomocą pokręteł napięcia i emisji, aż do osiągnięcia szybkości 0,02 - 0,04 nm/s. Naciśnij "OFF", aby wyłączyć pistolet Pt/C.
      2. Wybierz "Warstwa 2". Powtórz 2.1.2.1, z wyjątkiem wyboru "GUN2" i dostosowania do szybkości parowania ~0,1 nm/s.
  2. Schłodzić etap systemu zamrażania i pękania do temperatury -140 °C lub -160 °C (odpowiednio dla liści uwodnionych lub odwodnionych). Podłącz wahadłowiec do kriotransferu próżniowego do maszyny i napełnij jego komorę ciekłym azotem. Ciśnienie w chłodzonej komorze zamrażania i pękania wynosi zwykle od 1 do 8 x 10-7 mbar.
  3. Włóż uchwyt na próbkę szczelinowania zamrażającego (odpowiedni do płytek krwi 3 mm) do stacji załadowczej. Zalać komorę stacji załadowczej ciekłym azotem.
  4. Załaduj dwie zamrożone kanapki na uchwyt jedna po drugiej za pomocą pęsety o wysokiej precyzji. Dokręć pierwszą kanapkę w uchwycie, a następnie odwróć uchwyt, aby sprawdzić, czy jest dobrze dopasowany na swoim miejscu. Powtórz dla drugiej kanapki.
  5. Odłączyć schłodzony czółenek od maszyny do szczelinowania zamrażalniczego i podłączyć go do stacji załadowczej. Otwórz zawór wahadłowy, włóż ramię chowane do uchwytu i zablokuj je na miejscu. Ponownie włóż ramię z uchwytem do czółenka i zamknij zawór wahadłowy za pomocą pokrętła stacji ładowania. Przymocuj czółenko do maszyny zamrażającej i łamającej i włóż uchwyt do komory za pomocą ramienia chujnego. Odłącz czółenko od maszyny.
  6. Ustaw nóż do mikrotomów z pęknięciami zamrażalniczymi na taką wysokość, aby strącił górne płytki kanapek.
  7. Za pomocą noża do mikrotomów szybko połam kanapki, a następnie natychmiast podnieś je, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek przez zanieczyszczenia przylegające do noża, a następnie przekręć schłodzoną migawkę nad nowo odsłoniętą płaszczyzną, aby osłonić próbki przed możliwym zanieczyszczeniem cząsteczkami wody w komorze.
  8. Pokryj próbki platyną i węglem.
    1. Wprowadź "Warstwę 1" na ekranie. Włącz pistolet Pt/C, naciskając przycisk "GUN1", a następnie przycisk "ON". Zbadaj szybkość parowania, a gdy osiągnie ona 0,02 - 0,04 nm/s, jednocześnie naświetl próbki i naciśnij przycisk "Zmierz", aby monitorować grubość osadzonej warstwy.
      Uwaga: Pistolet wyłączy się automatycznie, gdy grubość osiągnie wstępnie wybraną wartość.
    2. Przykryj próbki przesłoną po zakończeniu parowania Pt/C.
    3. Naciśnij przycisk "Warstwa", aby przejść do "Warstwy 2". Powtórzyć kroki 2.8.1 i 2.8.2, z wyjątkiem wyboru "GUN2" (dla węgla) i szybkości parowania ~0,1 nm/s.
  9. Podgrzać stopień systemu zamrażania i szczelinowania do temperatury -120 °C.

3. Krioskaningowa mikroskopia elektronowa

  1. Przygotuj skaningowy mikroskop elektronowy do prac kriogenicznych.
    1. Z menu głównego wybierz Stage/Stage Initialise i potwierdź.
    2. Wybierz Narzędzia/Idź do panelu i otwórz panel "Śluza powietrzna", wybierając go z listy. Kliknij przycisk "Zamknij zawór komory kolumny". Odpowietrzyć komorę mikroskopu, klikając przycisk Odpowietrznik w zakładce "Próżnia".
    3. Wybierz Narzędzia/Idź do panelu i otwórz panel "Lista punktów etapu". Wybierz pozycję kriowymiany, aby przesunąć stolik do odpowiednich współrzędnych w celu przyjęcia uchwytu próbki. Uwaga: "Pozycja kriowymiany" jest ustawiona tak, aby była wyrównana z pozycją jednostki transferu podciśnienia.
    4. Otwórz komorę na próbkę w czystych rękawiczkach i włóż stolik kriogeniczny do głównego stolika mikroskopu. Zamknij komorę i kliknij przycisk Pompa pod zakładką "Próżnia".
    5. Schłodzić mikroskop do temperatury -120 °C. Napełnić mikroskop Dewara ciekłym azotem. Aktywuj funkcję podgrzewania w jednostce sterującej kriotransferem do -120 °C, gdy temperatura stage spadnie poniżej -120 °C.
  2. Przymocuj czółenko do kriotransferu do mikroskopu i przenieś uchwyt próbki za pomocą ramienia chowanego do stolika kriogenicznego mikroskopu (jak w kroku 2.5). Odłącz czółenko od mikroskopu.
  3. Kliknij przycisk "Otwórz zawór komory kolumny" w panelu śluzy powietrznej.
  4. Ostrożnie przesuń uchwyt próbki blisko soczewki obiektywu (odległość robocza 1 - 2 mm) za pomocą joysticka. Wybierz przysłonę 10 μm w zakładce "Przysłony". Kliknij dwukrotnie pole EHT w zakładce "Pistolet". Wprowadź 10 (kV) jako wartość docelową EHT i kliknij przycisk OK. Kliknij dolną zakładkę EHT i wybierz opcję "EHT On".
  5. Wybierz "InLens" z listy rozwijanej Detektory w zakładce "Detektory". Zoptymalizuj warunki obrazowania (ostrość, jasność i kontrast, wyrównanie wiązki, astygmatyzm) zgodnie z potrzebami.
  6. Kliknij zakładkę "Skanowanie". Wybierz szybkie skanowanie ("Szybkość skanowania = 1", co odpowiada czasowi skupienia wynoszącemu 100 ns na piksel), aby zminimalizować uszkodzenia wiązki, oraz "Rozdzielczość przechowywania" 1 024 x 768 pikseli. Wybierz "Średnia linii" z listy rozwijanej "Redukcja szumów". Dostosuj wartość N do 20 - 30 wierszy wyszukiwania. Przesuń próbkę za pomocą funkcji "Punkt centralny" (naciskając Control Tab na klawiaturze), aby wyszukać obszary z pękniętymi komórkami i chloroplastami (rysunki 2A i 2B).
  7. Uzyskuj obrazy pękniętych chloroplastów przy małych powiększeniach (50 - 70 kX) (ryc. 2C i 2D). Użyj funkcji "Center Feature" (naciskając Control-Shift-tab na klawiaturze), aby powiększyć interesujące powierzchnie pęknięć chloroplastów i uzyskać obrazy w dużych powiększeniach (100 - 200 kX, rysunki 3 i 4). Użyj tych samych parametrów, co w kroku 3.6 do akwizycji obrazu, ale zmień wartość Średnia linii na N >100, aby uzyskać redukcję szumów30.
    1. Naciśnij przycisk Zamrożenie na głównej jednostce sterującej mikroskopu lub w zakładce "Skanowanie", aby zatrzymać skanowanie i zapisać obraz, naciskając przycisk "Zapisz TIFF".

4. Analiza obrazu

Uwaga: Ta sekcja opisuje krótką procedurę segmentacji cząstek membrany z obrazów SEM z zamrażania i pękania przy użyciu pakietu open source Fiji31. Podobne wyniki można uzyskać za pomocą innych programów do analizy obrazu.

  1. Otwórz obraz z Fidżi, przeciągając plik obrazu do głównego okna programu. Przekonwertuj obraz na 8-bitowy, wybierając opcję Obraz/Typ/8-bitowy. Wybierz Obraz/Regulacja/Jasność/Kontrast i dostosuj w razie potrzeby (Rysunek 5A).
  2. Za pomocą narzędzia Linia prosta narysuj linię o rozmiarze skali osadzonego obrazu. Wybierz opcję Analizuj/Ustaw skalę. Wprowadź odpowiednie informacje o skali (Znana odległość i Jednostka długości) i kliknij przycisk OK. Zapisz ten skorygowany przeskalowany obraz.
  3. Wybierz opcję Proces/Filtry/Rozmycie gaussowskie (promień 1,5 nm) i kliknij przycisk OK (Rysunek 5B).
  4. Wybierz opcję Image/Adjust/Auto Local Threshold (Obraz / Dostosuj/Automatyczny próg lokalny) (przy użyciu metody Niblack) i kliknij przycisk OK (Rysunek 5C).
  5. Wybierz opcję Edit/Invert (Edytuj/Odwróć), a następnie Process/Binary (Binarny/Zlewnia) (Rysunek 5D).
  6. Narysuj obramowanie wokół obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne. Dodaj wybór do menedżera ROI, wybierając opcję Edytuj/Zaznaczenie/Dodaj do menedżera lub klikając "T".
  7. Wybierz opcję Edytuj/Wyczyść na zewnątrz (Rysunek 5E).
  8. Wybierz Analizuj/Ustaw pomiary, wybierz odpowiednie parametry (np. obszar, dopasowanie elipsy).
  9. Wybierz opcję Analizuj/Analizuj cząstki. Wprowadź odpowiedni zakres dla wielkości cząstek i zaznacz 'Wyświetl wyniki', 'Dodaj do menedżera' i w razie potrzeby opcję 'Wyklucz na krawędziach' i kliknij OK. Wynik przedstawiono na rysunku 5F.
  10. Otwórz zapisany plik z obrazem w skali (krok 4.2). Wybierz opcję "Pokaż wszystko" i odznacz opcję "Etykiety" w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Przejrzyj wybrane cząstki umieszczone na oryginalnym obrazie i ręcznie dodaj lub usuń zaznaczenia za pomocą przycisków "Dodaj" lub "Usuń" w Menedżerze ROI. Popraw wszelkie niezbędne wybory, korzystając z narzędzia Zaznaczanie odręczne i przycisku "Aktualizuj" w Menedżerze ROI (rysunki 5G i 5H).
  11. Analizuj dane za pomocą uzyskanych pomiarów. W oknie Wyniki kliknij przycisk Wyniki/Podsumowanie, aby uzyskać, na przykład, średnią powierzchnię oraz średnią oś główną i pomocniczą cząstek wymienionych w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij opcję Wyniki/Rozkład, wybierz parametr (np. Powierzchnia) i kliknij przycisk OK, aby wyświetlić histogram dla tego parametru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia obrazy cryo-SEM płytek zawierających zamrożone pod wysokim ciśnieniem i rozłamane metodą mrożenia fragmenty liści Craterostigma pumilum. W niektórych próbkach uzyskano rozległe obszary rozłamanych komórek (Rycina 1A). W innych fragment liścia pozostaje ściśle związany z górną tarczą i zostaje od niej oddzielony wraz z nią (Rycina 1B). Jednakże, nawet w drugim przypadku, część tkanki liścia może pozostać przyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika opisana w niniejszej pracy pozwala na badanie pękniętych przez zamrożenie błon w kontekście dobrze zachowanych wysokociśnieniowych zamrożonych tkanek roślinnych za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej. Główną zaletą stosowania tych procedur jest to, że przygotowanie próbki jest czysto fizyczne; Nie są konieczne żadne czynności związane z chemikaliami lub odwodnieniem. Tym samym pozwala na badanie struktur biologicznych w stanie zbliżonym do rodzimego26,32. Zaletą stosowania tkanek liści jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Andresowi Kaechowi (Uniwersytet w Zurychu) za pomocne rady dotyczące obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Prace te były wspierane przez Dwunarodowy Fundusz Badań i Rozwoju Rolnictwa Stanów Zjednoczonych i Izraela (grant nr. US-4334-10, Z.R.), Izraelska Fundacja Naukowa (grant nr 1034/12, Z.R.) oraz Human Frontier Science Program (RGP0005/2013, Z.R.). Badania mikroskopii elektronowej przeprowadzono w Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging w Instytucie Naukowym Weizmanna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Etanol absBio-Lab052505
IsopropanolBio-Lab162605
1-heksadecenSigma-AldrichH7009
0,1/0,2 Płytki krwiBiuro Inżynieryjne M. Wohlwend GmbH, Szwajcaria241Płytki krwi mają średnicę 3 mm i grubość 0,5 mm (typ A) z wgłębieniami o głębokości 0,1/0,2 mm (o średnicy 2 mm). Podobne płytki krwi można uzyskać od Leica Microsystems.
Pęseta o wysokiej precyzjiMikroskopia elektronowa Sciences72706-01Dumont (Szwajcaria) Pęseta Durostar typu #5; Można go zastąpić inną precyzyjną pęsetą.
Zamrażarka wysokociśnieniowaBal-TecHPM 010Alternatywy dla zamrażania wysokociśnieniowego: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
System zamrażania i pękaniaLeica MicrosystemsEM BAF 060
Etap ładowania przygotowania kriogenicznegoLeica Microsystems16770228
Uchwyt na próbki do uniwersalnego szczelinowania zamrażalniczegoLeica Microsystems16LZ04746VNUchwyt zaciskowy do nośników próbek o średnicy 3 mm
Próżniowy wózek kriotransferowyLeica MicrosystemsEM VCT 100
Skaningowy mikroskop elektronowyZeissUltra 055
Stolik Cryo SEMLeica Microsystems16770299905
Oprogramowanie do pozyskiwania obrazówSmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Oprogramowanie do analizy obrazuFiji/Image J, National Institute of Healthhttp://fiji.sc/Fiji

Bibliografia

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694(2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika mro enia i upaniaorganizacja b on tylakoid wmro enie wysokoci nieniowepowlekanie dwuwarstwowepowierzchnie prze omu chloroplast wrozmieszczenie fotosystemu IIefekty odwodnieniaro lina zmartwychwstania
Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.