Artykuł metodologiczny

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

31.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54112

⸱

17 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics Program, Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Streszczenie

Nukleosomy to najmniejsza jednostka strukturalna chromatyny, składająca się ze 147 par zasad DNA owiniętych wokół oktamera białek histonowych. Funkcja histonów jest zapośredniczona przez rozległą modyfikację potranslacyjną przez niezliczoną ilość białek jądrowych. Modyfikacje te mają kluczowe znaczenie dla integralności jądrowej, ponieważ regulują strukturę chromatyny i rekrutują enzymy zaangażowane w regulację genów, naprawę DNA i kondensację chromosomów. Mimo że duża część społeczności naukowej przyjmuje techniki oparte na przeciwciałach w celu scharakteryzowania obfitości histonów PTM, podejścia te są niskoprzepustowe i stronnicze w stosunku do hiperzmodyfikowanych białek, ponieważ epitop może być zablokowany przez pobliskie modyfikacje. Protokół ten opisuje zastosowanie chromatografii nanocieczowej (nLC) i spektrometrii mas (MS) do dokładnego oznaczania ilościowego modyfikacji histonów. Metoda ta ma na celu scharakteryzowanie dużej różnorodności histonów PTM oraz względnej obfitości kilku wariantów histonów w ramach pojedynczych analiz. W tym protokole histony są derywatyzowane bezwodnikiem propionowym, a następnie trawione trypsyną w celu wytworzenia peptydów o długości 5 - 20 aa. Po trawieniu nowo odsłonięte N-końce peptydów histonowych są derywatyzowane w celu poprawy retencji chromatograficznej podczas nLC-MS. Metoda ta pozwala na względną kwantyfikację histonów PTM obejmującą cztery rzędy wielkości.

Wprowadzenie

Epigenetyka jest definiowana jako badanie dziedzicznych zmian w ekspresji genów, które powstają w wyniku innych mechanizmów niż zmiana podstawowej sekwencjiDNA 1. Regulacja epigenetyczna ma kluczowe znaczenie podczas rozwoju, ponieważ organizm ulega dramatycznym zmianom fenotypowym, mimo że jego zawartość DNA się nie zmienia. Istnieje kilka krytycznych składników wymaganych do prawidłowego utrzymania epigenetycznego, w tym modyfikacje potranslacyjne histonów (PTM), warianty histonów, niekodujące RNA, metylacja DNA i czynniki wiążące DNA, z których każdy wpływa na ekspresję genów poprzez różne mechanizmy2. Na przykład, podczas gdy metylacja DNA jest wysoce stabilną modyfikacją, która hamuje translację genów3, warianty histonów i histony PTM są znacznie bardziej dynamiczne i mogą wpływać na chromatynę na różne sposoby4.

Histononowe PTM-y są najczęściej zlokalizowane na N-końcowych ogonach, ponieważ są najbardziej narażonym i elastycznym regionem białka. Jednak rdzeń nukleosomu jest również silnie zmodyfikowany w porównaniu do przeciętnych białek5. Mimo że znaczniki histonowe zostały szeroko scharakteryzowane w ciągu ostatniej dekady, wiele powiązań między znanymi znakami histonowymi a ich funkcją jest nadal niejasnych. Wynika to w dużej mierze z faktu, że większość histonów PTM nie działa samodzielnie, ale raczej działa w tandemie z innymi PTM ("przesłuchy") w celu zmiany określonego procesu, takiego jak transkrypcja6,7. Na przykład kombinatoryczny znacznik H3S10K14ac na genie p21 aktywuje jego transkrypcję, co nie wystąpiłoby tylko w przypadku jednego z dwóch PTM8. Białko HP1 zagęszcza chromatynę, rozpoznając H3K9me2/me3 i rozprzestrzeniając modyfikację na pobliskie nukleosomy. Jednak HP1 nie może wiązać H3K9me2/3, gdy sąsiedni S10 jest fosforylowany9. Acetylacja H3K4 hamuje wiązanie białka spChp1 z H3K9me2/me3 w Schizosaccharomyces pombe10. Ponadto demetylaza lizyny histonowej PHF8 ma najwyższą skuteczność wiązania nukleosomów, gdy obecne są trzy PTM H3K4me3, K9ac i K14ac11. Przykłady te podkreślają, jak ważne jest uzyskanie globalnego przeglądu zmian PTM histonów, a nie skupianie się na pojedynczych modacjach.

Obecność wariantów sekwencji również zwiększa złożoność analizy histonów, ponieważ izotypy histonów zazwyczaj mają bardzo podobne sekwencje, ale często pełnią różne role w chromatynie. Na przykład H2A.x ma sekwencję C-końcową, która jest łatwiej fosforylowana po uszkodzeniu DNA w porównaniu z kanonicznym H2A12 i jest wymagana do inaktywacji chromosomów płci w mejozie samców myszy13; podobnie CENP-A podstawia kanoniczny histon H3 w centromerach14. Pomimo różnych funkcji, warianty te dzielą dużą część swojej sekwencji aminokwasowej z odpowiednim histonem kanonicznym, co utrudnia ich oddzielną identyfikację i ilościowe określenie.

Techniki oparte na przeciwciałach, takie jak western blotting, zostały szeroko stosowane do charakteryzowania histonów. Jednak podejścia oparte na przeciwciałach są ograniczone z następujących powodów: (i) mogą jedynie potwierdzić obecność modyfikacji i nie mogą zidentyfikować nieznanych PTM; (ii) są stronnicze ze względu na obecność współistniejących znaków, które mogą wpływać na powinowactwo do oprawy; (iii) nie są w stanie zidentyfikować znaczników kombinatorycznych, ponieważ dostępnych jest tylko bardzo niewiele przeciwciał do tego celu oraz (iv) reagują krzyżowo między bardzo podobnymi wariantami histonów lub podobnymi PTM (np. di- i trimetylacja reszt lizyny). Egelhofer i wsp. opisano, że ponad 25% komercyjnych przeciwciał nie przechodzi testów swoistości metodą dot blot lub western blot, a wśród przeciwciał swoistych ponad 20% nie przechodzi eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny15. Spektrometria mas (MS) jest obecnie najodpowiedniejszym narzędziem analitycznym do badania nowych i/lub kombinatorycznych PTM i została szeroko wdrożona w przypadku białek histonowych (przegląd w 16). Wynika to przede wszystkim z wysokiej czułości i dokładności masy MS oraz możliwości wykonywania analiz na dużą skalę.

Strategia oddolna jest najczęściej stosowaną strategią proteomiczną opartą na MS do charakteryzacji histonów i ich PTM, w której nienaruszone białko jest trawione enzymatycznie do krótkich peptydów (5 - 20 aa). To trawienie ułatwia zarówno separację LC, jak i wykrywanie stwardnienia rozsianego. Masy w zakresie 600 - 2,000 Da są zwykle łatwiejsze do zjonizowania i identyfikacji z większą dokładnością i rozdzielczością niż większe masy. Poprawia się również fragmentacja MS/MS, ponieważ krótkie peptydy są na ogół dobrze przystosowane do dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID). Jednak histony stanowią wyzwanie dla oddolnego stwardnienia rozsianego, ponieważ są wysoko wzbogacone w podstawowe reszty aminokwasowe, a mianowicie lizynę i argininę. Dlatego trawienie trypsyny prowadzi do wytwarzania peptydów, które są zbyt małe do zatrzymania LC i jednoznacznej lokalizacji PTM. Aby obejść ten problem, nasz protokół obejmuje N-końcową derywatyzację chemiczną lizyny i peptydu17. Stosowanie bezwodnika propionowego jest zalecane do wydajnej derywatyzacji chemicznej w porównaniu z innymi odczynnikami 18. Taka derywatyzacja blokuje grupy ɛ-aminowe reszt niemodyfikowanych i monometylolizyny, umożliwiając trypsynie przeprowadzenie proteolizy tylko na C-końcu reszt argininy. Derywatyzowane aminy nie mogą wymieniać protonów z roztworem, a zatem peptydy są na ogół naładowane tylko podwójnie lub potrójnie, co ułatwia wykrywanie MS i MS/MS. Co więcej, derywatyzacja N-końcowa zwiększa hydrofobowość peptydów, a tym samym retencję chromatograficzną z odwróconymi fazami. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania histonów i przygotowania ich do analizy PTM za pomocą proteomiki oddolnej (ryc. 1). Strategia ta pozwala na ilościowe określenie pojedynczych znaczników histonów i znaczników kombinatorycznych dla histonów PTM, które są stosunkowo blisko w sekwencji aminokwasów.

Protokół

1. Zbiór komórek z hodowli

  1. Jeśli komórki były hodowane w zawiesinie, zbieraj komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 rcf przez 5 minut. Jeśli przylega, odessać i wyrzucić pożywkę komórkową. Przepłukać przyłączone komórki PBS bez Ca2+ i Mg2+ (określane jako PBS w przyszłości). Inkubować komórki w trypsynie lub trypsyno-EDTA (0,025% - 0,5% w zależności od linii komórkowej) z objętością wystarczającą do pokrycia powierzchni płytek w temperaturze 37 °C, aż do oderwania się komórek (czas różni się dla różnych linii komórkowych).
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 rcf przez 5 minut. Umyć komórki jeszcze dwa razy w PBS i zebrać przez odwirowanie.
  3. Oszacuj objętość upakowanych komórek w przybliżeniu na podstawie podziałki zaznaczonej na probówkach 1,8 ml lub probówkach stożkowych 15 ml.
    Uwaga: Na tym etapie komórki z hodowli można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.

2. Izolacja jąder od nienaruszonych komórek

  1. Rozmrozić komórki na lodzie.
  2. Rozmrozić bufor izolacji jądrowej (NIB, tabela 1).
  3. Przygotować około 5 ml buforu NIB (tabela 1) na każde 100 μl objętości wypełnionej komórki. Na każdy 1 ml buforu NIB dodać inhibitory proteazy i środki stabilizujące w następujący sposób: 1 μl 1 M DTT, 2,5 μl 200 mM AEBSF, 2 μl 2,5 μM mikrocystyny i 2 μl 5 M maślanu sodu. Od tego momentu NIB z inhibitorami będzie określany jako NIB.
    Uwaga: Jeśli badana jest fosforylacja histonów, należy dołączyć proteazę wolną od EDTA i koktajl inhibitorów fosfatazy.
  4. Usunąć piątą objętość tak przygotowanego buforu NIB i dodać alternatywę NP-40 (tabela 1) do końcowego stężenia 0,2%. Pozostała czwarta piąta objętość zostanie wykorzystana do prania.
  5. Umyj osad komórkowy w granulce 1:10 ogniwa do NIB bez NP-40 Alternatywny stosunek (v/v). Usunąć supernatant przez odwirowanie w temperaturze 700 rcf przez 5 min.
  6. Zdaj lizę osadu komórkowego, umieszczając go na lodzie i dodając osad komórkowy 1:10 do NIB z 0,2% NP-40 Alternative (v / v).
  7. W przypadku ekstrakcji z próbek tkanek homogenizować za pomocą moździerza i tłuczka lub homogenizatorów z beczki lub z odbić. Wyhodowane komórki można homogenizować przez delikatne pipetowanie.
  8. Inkubować homogenizowane komórki na lodzie przez 5 - 10 minut. Komórki ulegną lizie i uwolnią jądra.
  9. Wirować w temperaturze 1 000 rcf przez 5 - 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad zawiera głównie jądra komórkowe, podczas gdy supernatant zawiera głównie składniki cytoplazmatyczne. W razie potrzeby zachowaj frakcję cytoplazmatyczną.
  10. Umyj osad jądrowy, delikatnie zawieszając go ponownie w NIB 1:10 (v/v) bez NP-40 Alternative.
    Uwaga: Ten etap mycia ma na celu wyłącznie usunięcie śladów detergentów przed ekstrakcją histonów z jąder.
  11. Wirować w temperaturze 1 000 rcf przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  12. Powtórz kroki 2.10 - 2.11 co najmniej dwa razy, aby całkowicie usunąć NP-40 Alternative. Usunięcie NP-40 Alternative jest oczywiste, ponieważ delikatne pipetowanie na etapie mycia nie tworzy już pęcherzyków powietrza.
  13. Do ekstrakcji histonów z tkanek:
    1. Opłucz świeżo lub rozmrożoną zamrożoną tkankę w lodowatej stalówce.
    2. Przenieś tkankę na szalkę Petriego umieszczoną na lodzie z NIB, tylko tyle, aby tkanka była mokra.
    3. Pokrój w kostkę na najmniejsze kawałki (< 1 mm) za pomocą żyletki, aby zwiększyć kontakt powierzchniowy w celu izolacji jąder.
    4. Przenieś zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonego homogenizatora i umyj w NIB, pipetując w górę iw dół.
    5. Usunąć bufor przez odwirowanie w temperaturze 300 rcf przez 5 minut.
    6. Dodaj NIB zawierający NP-40 Alternative do komórek w stosunku komórka:bufor 1:10 (v/v) i homogenizuj przez 5 - 10 uderzeń.
    7. Sprawdź lizę komórek i powtórz homogenizację w razie potrzeby. Dobrym wskaźnikiem, że komórki zostały poddane lizie, jest zmniejszenie objętości osadu. Osad powinien zawierać tylko jądra.
    8. Wirować przy 700 rcf przez 5 minut i oszczędzać pelet. Ten osad można ekstrahować 1 - 2 razy więcej w 1:10 (v / v) NIB zawierającego NP-40 Alternative; Na tym etapie histony są ekstrahowane z chromatyny, a osad znacznie się skurczył.
    9. Umyć dwa razy 2 - 3 ml NIB bez NP40 Alternatywnie usunąć ślady detergentu.
      Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być ponownie zawieszona w minimalnej objętości NIB + 5% glicerolu i przechowywana w temperaturze -80 °C.

3. Ekstrakcja i oczyszczanie histonów z jąder

Uwaga: Histony są bardzo bogate w podstawowe reszty aminokwasowe, co pozwala im ściśle oddziaływać ze szkieletem kwasu fosforowego DNA. Histony są jednymi z najbardziej podstawowych białek w jądrze, co pozwala na ich ekstrakcję w lodowatym kwasie siarkowym (0,2 M H2SO4) przy minimalnym zanieczyszczeniu białkami niehistonowymi, które wytrącają się w mocnym kwasie. Wysoko skoncentrowany TCA (do końcowego stężenia 33%) może być następnie wykorzystany do wytrącenia histonów z kwasu siarkowego. TCA jest przechowywany w 100% w brązowej butelce w temperaturze 4 °C.

  1. Zawiesić jądra komórkowe w schłodzonym w stosunku 1:5 (v/v) 0,2 M H2SO4 (Tabela 1) przez delikatne pipetowanie.
  2. Inkubować próbkę ze stałą rotacją lub delikatnym wstrząsaniem przez 2-4 godziny w temperaturze 4 °C. Zazwyczaj, w przypadku próbek zawierających więcej niż 500 μl osadów komórkowych, ekstrakcja trwa 2 godziny w celu ekstrakcji histonów; dłuższa inkubacja może spowodować ekstrakcję innych podstawowych białek. W przypadku mniejszych granulek jądrowych (< 200 μl) ekstrakcja trwająca 4 godziny zapewnia lepszą wydajność.
  3. Wirować w temperaturze 3 400 rcf w temperaturze 4 °C przez 5 min.
  4. Przenieść supernatant do nowej probówki.
  5. Powtórz kroki 3.3 - 3.4, aby usunąć wszelkie nierozpuszczalne materiały.
  6. Aby wytrącić histony, należy dodać schłodzony 100% TCA (Tabela 1) do zebranego supernatantu (teraz zawierającego histony) w stosunku 1:3 (v/v), w celu uzyskania końcowego stężenia TCA 33%. Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.
    Uwaga: Próbki staną się mętne po dodaniu TCA, co wskazuje na obecność histonów.
  7. Inkubować mieszaninę na lodzie przez co najmniej 1 godzinę. W przypadku mniejszych początkowych rozmiarów granulek zaleca się opady w nocy.
  8. Wirować przy 3 400 rcf przez 5 min. Histony pokrywają boki rurek, a także osadzają się na dnie. Na samym dnie probówki tworzy się również biała, nierozpuszczalna osadka, która zawiera głównie białka niehistonowe i inne biomolekuły. Usunąć supernatant przez aspirację, ostrożnie, nie skrobając boków ani osadu.
  9. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przepłukać probówkę lodowatym acetonem + 0,1% HCl (Tabela 1) tak, aby pokryć wytrącone białka pokrywające boki i dno.
  10. Wirować przy 3,400 rcf przez 2 minuty i odsysać supernatant, ostrożnie, nie skrobając boków ani osadu.
  11. Powtórz kroki 3.9 - 3.10, używając 100% lodowatego acetonu.
  12. Suchy pellet z przepływem powietrza lub za pomocą wirówki próżniowej, lub po prostu pozostawiając otwartą rurkę. Aceton szybko odparowuje.
  13. Rozpuść histony w ddH2O (woda podwójnie destylowana) w minimalnej możliwej objętości, aby całkowicie rozpuścić białą warstwę. Histony są łatwo rozpuszczalne w wodzie. W przypadku granulek w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zwykle wystarcza 100 μl ddH2O do zebrania histonów.
  14. Wirować w temperaturze 3 400 rcf przez 2 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki.

4. Ocena stężenia i czystości białka

  1. Do pomiaru stężenia białka należy użyć BCA, testu białka Bradforda lub analizy aminokwasów (AAA). Nie należy stosować technik, które przyjmują absorbancję przy 280 nm, ponieważ histony są ubogie w reszty aminokwasów aromatycznych.
  2. Sprawdź czystość wyekstrahowanych histonów za pomocą analizy SDS-PAGE z 15% żelem akrylowym i barwieniem Coomassie (opcjonalnie).
  3. Jeśli pożądane są warianty pojedynczych histonów o wysokiej czystości, należy kontynuować frakcjonowanie wariantów histonów metodą HPLC-UV (sekcja 5). Jeśli nie, przejdź bezpośrednio do przygotowania próbki do analizy PTM histonów od dołu do góry (sekcja 6).

5. Separacja wariantów histonów za pomocą HPLC z odwróconą fazą (opcjonalnie)

Uwaga: Warianty histonów o wysokiej czystości można uzyskać przez frakcjonowanie surowej mieszaniny histonów przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami sprzężonymi z detektorem UV. Te oczyszczone histony są przydatne w badaniach, które wymagają większej czułości i czystości. Jednak w przypadku standardowej charakterystyki histonu PTM ten krok można pominąć, ponieważ analiza jest wystarczająco czuła i wyczerpująca. Frakcjonowanie nienaruszonych wariantów histonów wymaga w idealnym przypadku co najmniej 100 - 300 μg materiału wyjściowego.

  1. Podłączyć odpowiednią kolumnę C18 5 μm do HPLC w zależności od początkowego stężenia histonów: przy około 100 μg histonów użyć kolumny o wymiarach 2,1 mm x 250 mm o natężeniu przepływu 0,2 ml/min; przy około 300 μg histonach użyć kolumny o wymiarach 4,6 x 250 mm o natężeniu przepływu 0,8 ml/min. Przygotować bufor A i B przy użyciu dedykowanych naczyń szklanych w następujący sposób:
    1. Przygotuj bufor A: 5% acetonitrylu klasy HPLC, 0,1% TFA w wodzie klasy HPLC.
    2. Przygotuj bufor B: 95% acetonitryl klasy HPLC, 0,1% TFA w wodzie klasy HPLC.
  2. Podłącz kolumnę do detektora UV i ustaw absorbancję na 210 - 220 nm.
  3. Zakwasić próbkę histonu rozpuszczoną w wodzie 100% TFA, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1-1% TFA.
  4. Równoważyć kolumnę ze 100% buforem A przez co najmniej 15 minut przy zalecanym natężeniu przepływu, które odpowiada w przybliżeniu objętościom trzech kolumn. Użyj tego sygnału, aby ustawić zerowy poziom absorbancji detektora UV.
  5. Przygotuj probówki o odpowiedniej wielkości do zbierania frakcji ręcznie lub w automatycznym kolektorze próbek.
  6. Wstrzyknąć próbkę o stężeniu około 1 μg/μl lub wyższym. Próbki rozpuszczone w większych objętościach mogą zmieniać równowagę kolumny podczas ładowania i prowadzić do mniejszej retencji.
  7. Uruchom gradient, zaprogramowany w następujący sposób: od 0 do 30% B w 1 minutę, od 30 do 60% B w 90 minut i 60 do 90% B w 1 minutę.
  8. Zbierać frakcje (przykładowy chromatogram pokazany na rysunku 2) w odstępach 1-minutowych za pomocą automatycznego kolektora frakcji. Zbierz frakcje w probówkach o odpowiednim rozmiarze, aby pomieścić całą objętość.
  9. Wysuszyć frakcjonowane próbki w koncentratorze próżniowym.
    Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Wysuszone frakcje histonowe mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez krótki czas (1 - 2 dni) lub w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez długi czas.

6. Chemiczna derywatyzacja histonów przy użyciu bezwodnika propionowego do analizy bottom-up

  1. Próbki histonów rozpuścić w 40 μl 50 mM NH4HCO3, pH 8,0 (zalecana ilość: 50 - 100 μg). Jeśli próbki były w czystym ddH2O, dodaj skoncentrowany NH4HCO3 do 50 mM, pH 8,0.
  2. Zwilż końcówkę pipety P10 w próbce, aby sprawdzić pH za pomocą pasków wskaźnikowych pH bez strat próbki. NH4OH i kwas mrówkowy można użyć do dostosowania pH do 8,0,
    Uwaga: Poniższa część protokołu (kroki 6.3 - 6.7) powinna być wykonywana w partiach składających się maksymalnie z trzech do czterech próbek, aby utrzymać reaktywność bezwodnika propionowego.
  3. Użyj dygestorium do kolejnych etapów, w których stosuje się bezwodnik propionowy. Przygotować świeży odczynnik propionylacyjny, mieszając bezwodnik propionowy z acetonitrylem w stosunku 1:3 (v/v). Dodać odczynnik propionylacji do próbki w stosunku 1:4 (v/v). W przypadku 40 μl histonów dodać 10 μl odczynnika propionylacyjnego.
    Uwaga: Na tym etapie można zaobserwować białe zanieczyszczenia. Zawiera on jednak głównie sole i kwas propionowy, a zatem nie trzeba podejmować żadnych konkretnych działań.
  4. Szybko dodaj NH4OH, aby przywrócić pH 8,0 do roztworu. Uwaga: Bezwodnik propionowy reagujący z wolnymi aminami peptydów wytwarza kwas propionowy, który obniża pH. Zwykle dodanie NH4OH do próbki w stosunku 1:5 (v/v) jest odpowiednie do przywrócenia pH 8,0; np. 8 μl NH4OH do 40 μl próbki.
  5. Natychmiast wymieszaj przez wirowanie.
  6. Sprawdź pH zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 6.2.
    Uwaga: Gdy pH jest większe niż 10,0, możliwe jest znakowanie innych reszt aminokwasowych o wyższym pKa.
  7. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  8. Powtórzyć kroki 6.3 - 6.7, ściśle wykonując reakcję dla nie więcej niż 3 lub 4 próbek na partię odczynnika propionylacyjnego.
  9. Próbki należy suszyć do 10 - 20 μl w koncentratorze próżniowym. Powoduje to odparowanie nieprzereagowanego bezwodnika propionowego, acetonitrylu, kwasu octowego i amoniaku uwalnianego z NH4OH. Jeśli próbki całkowicie wyschną, nie wystąpią znaczące straty próbki.
    Uwaga: Zamiast acetonitrylu można stosować izopropanol. Jednak acetonitryl ma niższe napięcie powierzchniowe, a tym samym szybsze parowanie.
  10. Zawiesić lub rozcieńczyć próbki za pomocąddH2O aż do uzyskania 40 μl końcowej objętości.
  11. Powtórz kroki 6.2 - 6.9. Podwójna runda propionylacji histonów zapewnia > 95% zakończenia reakcji.
  12. Napełnij butlę bezwodnika propionowego argonem, aby zapobiec tworzeniu się kwasu octowego w kontakcie z wilgocią w butelce.
    Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C rozpuszczona w ddH2O lub wysuszona.

7. Trawienie proteolityczne z trypsyną

  1. Zawiesić histony w 50 mM NH4HCO3, aby osiągnąć optymalne stężenie 1 μg/μl lub wyższe. Bardziej rozcieńczone próbki prowadzą do niższej wydajności trypsyny.
    Uwaga: Histony na tym etapie muszą mieć pH 8,0 Jeśli nadal jest kwaśny, dodaj sól NH4HCO3 do próbki za pomocą końcówki pipety.
  2. Dodaj trypsynę do próbek histonów w stosunku 1:10 (wag./wag.).
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 - 8 godzin.
  4. Zatrzymać trawienie przez zamrożenie w temperaturze -80 °C.
  5. Wysuszyć próbkę do 10 - 20 μl w koncentratorze próżniowym.
    Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.

8. Propionylacja peptydów histonowych na N-końcach

Uwaga: W tej sekcji opisano derywatyzację N-końców peptydów powstałych w wyniku trawienia trypsyny. Taki zabieg poprawia retencję HPLC najkrótszych peptydów (np. aminokwasu 3 - 8 histonu H3), ponieważ grupa propionylowa zwiększa hydrofobowość peptydów.

  1. Zawiesić próbki w 30 μl 100 mM NH4HCO3.
  2. Powtórz kroki 6.1 - 6.9.
    Uwaga: To normalne, że suszenie próbek w próżni na tym etapie zajmuje więcej czasu.
  3. Zawiesić lub rozcieńczyć próbki 50 - 100 μl ddH2O + 0,1% TFA lub 0,5% kwasu octowego. Uwaga: Kwas octowy jest zalecany do długiego przechowywania, ponieważ TFA ułatwia utlenianie metioniny w dłuższej perspektywie. Z drugiej strony, TFA jest zalecane, jeśli przechylanie etapu (sekcja 9) jest wykonywane tego samego dnia, ponieważ TFA pomaga w lepszym zatrzymywaniu chromatograficznym.
    Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.

9. Odsalanie próbek za pomocą końcówek etapowych

Uwaga: Na tym etapie w próbce znajduje się sól. Sole utrudniają analizę HPLC-MS, ponieważ jonizują podczas elektrorozpylania, tłumiąc sygnał z peptydów. Sole mogą również tworzyć addukty jonowe na peptydach, zmniejszając intensywność sygnału dla peptydu nieaddukowanego. Ponieważ addukowany peptyd będzie miał inną masę, peptyd nie zostanie prawidłowo zidentyfikowany ani określony ilościowo.

  1. Za pomocą końcówki do pipet P1000 przedziurkuj krążek z materiałem C18 z dysku do ekstrakcji do fazy stałej. Wypchnij minidysk z końcówki P1000 za pomocą kapilary ze stopionej krzemionki i umieść minidysk na dnie końcówki pipety P100 / 200. Upewnij się, że dysk jest dobrze zaklinowany w dolnej części końcówki (Rysunek 3).
    Uwaga: Końcówka P1000 ma dość mały otwór do przebicia dysku C18. Właściwe jest wycięcie ostatniego centymetra końcówki, aby uzyskać otwór o większej średnicy.
  2. Użyj dwóch stempli C18 w tej samej końcówce P100/P200 w przypadku odsalania ponad 25 μg próbki.
  3. Użyj adaptera wirówki, aby przytrzymać końcówki etapu na miejscu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml lub 2 ml. Używaj powolnych (300 - 400 rcf) obrotów; Rozpuszczalniki zwykle przechodzą przez żywicę w czasie krótszym niż minuta.
  4. Przepłukać żywicę, wirując 50 μl 100% acetonitrylu, aby aktywować materiał C18 i usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
  5. Wyrównać krążek przez przepłukanie 80 μl 0,1% TFA przez powolne wirowanie.
  6. Zakwasić próbkę do pH 4,0 lub niższego kwasem octowym. Sprawdź pH za pomocą pasków pH, aby zminimalizować utratę próbki. Załadować próbkę na dysk przez powolne wirowanie.
  7. Przepłukać próbkę, przepłukując 70 - 80 μl 0,1% TFA przez powolne odwirowywanie.
  8. Elutę próbki przez przepłukiwanie 70 μl 75% acetonitrylu i 0,5% kwasu octowego przez powolne wirowanie. Pobrać próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml.
  9. Sucha próbka w koncentratorze próżniowym.
    Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.

10. Analiza peptydów histonowych

Uwaga: Platformę nLC-MS należy skonfigurować tak, jak w przypadku tradycyjnej analizy peptydów. Zaleca się stosowanie kolumny przepływowej 200 - 300 nl (kolumna analityczna o średnicy wewnętrznej 75 μm, cząstki C18), ponieważ stanowią one doskonały kompromis między czułością a stabilnością. Metoda pozyskiwania MS może być kombinacją akwizycji zależnej od danych (DDA) z ukierunkowanymi skanami19 lub akwizycją niezależną od danych (DIA)20,21, obie opisane w reprezentatywnych wynikach i na rysunku 4.

  1. Przygotować HPLC — A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie o czystości HPLC; B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu klasy HPLC.
  2. Zaprogramować metodę HPLC w następujący sposób: od 0 do 30% buforu B w ciągu 30 min, od 30 do 100% B przez następne 5 min i przy izokratycznym 100% B przez 8 min. Jeżeli HPLC nie jest zaprogramowany do automatycznego równoważenia kolumny przed załadowaniem próbki, należy uwzględnić następujące elementy: nachylenie od 100 do 0% B w ciągu 1 minuty i przepływ izokratyczny przy 0 % B przez 10 minut. Ustawić natężenie przepływu analizy na 250 - 300 nl/min.
  3. Zaprogramuj metodę akwizycji MS tak, aby wykonywała DDA w połączeniu z ukierunkowanymi skanami19 lub DIA 20,21 (rysunek 4). Upewnij się, że cykl pracy MS pozwala na jedno pełne skanowanie MS co ~ 2 sekundy, aby mieć wystarczającą liczbę punktów danych do przekroju piku chromatograficznego, co umożliwia dokładniejsze określenie ilościowe. Uwaga: W przypadku chromatografii C18 średnia podstawowa szerokość piku wynosi około 30 sekund dla gradientu opisanego powyżej.
  4. Załadować około 1 μg próbki do kolumny HPLC.
  5. Uruchom metodę HPLC-MS/MS zgodnie z programem.
    Uwaga: W protokole nie zalecamy podawania szczegółów dotyczących kolumn, instrumentów MS ani parametrów MS, ponieważ każda optymalna konfiguracja opracowana przez indywidualne laboratorium proteomiczne będzie odpowiednia dla tej metody. Laboratoria proteomiczne powinny korzystać ze zoptymalizowanej konfiguracji, ponieważ peptydy histonowe oddzielają się jako tradycyjne peptydy.

11. Analiza danych

  1. Zaimportuj surowe pliki MS do oprogramowania, aby przeprowadzić integrację obszaru szczytu. Uwaga: EpiProfile22 jest zalecany, ponieważ jest zoptymalizowany pod kątem peptydów histonowych; Wykorzystując wiedzę o czasie retencji elucji chromatograficznej, przeprowadza niezawodną ekstrakcję obszaru piku znanych peptydów histonowych. Alternatywnie, Skyline23 to kolejne idealne oprogramowanie do tego celu.
    1. Oblicz względną obfitość danego peptydu, dzieląc jego obszar przez całkowity obszar tego peptydu we wszystkich jego zmodyfikowanych formach. Uwaga: W przypadku analizy odkrywczej zaleca się, aby Mascot zidentyfikował widma zmodyfikowanych peptydów histonowych. Wydajność tego narzędzia została opisana niedawno24. Wszystkie inne wyszukiwarki baz danych dla proteomiki są również użyteczne, ale w naszych testach zapewniały niższą wydajność.

Wyniki

Jako przykład przeanalizowano histony wyekstrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) ze stymulacją kwasem retinowym (RA) i bez niej, zaczynając od 200 µl osadu komórkowego. Obecność RA w hodowli komórkowej prowadzi do różnicowania ESC. Z osadu komórkowego wyekstrahowano około 50 - 100 µg histonów, co jest ilością w zupełności wystarczającą do przeprowadzenia wielokrotnych wtrysków peptydów histonowych do układu LC-MS. Po derywatyzacji, trawieniu i odsoleniu próbki naniesiono w trybie szeregowym na kolumnę C18 75 µm x 15 cm (średnica cząstek 3 µm, wielkość porów 300 Å) przy użyciu wysokosprawnego systemu nanochromatografii cieczowej z chipami mikroprzepływowymi sprzężonego z hybrydowym spektrometrem mas liniowa pułapka czterobiegunowa – orbitrap. Akwizycję MS przeprowadzono metodą DIA. Równolegle próbki przeanalizowano metodą DDA przy użyciu nano-przepływowego układu UHPLC sprzężonego z hybrydowym spektrometrem mas pułapka jonowa-orbitrap (dane nie pokazano). W każdym cyklu wykonano jeden pełny pomiar MS orbitrap w zakresie skanowania od 290 do 1 400 m/z, z rozdzielczością 60 000 (przy 200 m/z) i AGC wynoszącym 106. Następnie zastosowano tryb akwizycji zależnej od danych z dynamicznym wykluczaniem przez 30 s. Skanowania MS/MS przeprowadzano dla jonów prekursorowych, zaczynając od najbardziej intensywnych. Jony o stanie naładowania równym jeden zostały wykluczone z MS/MS. Zastosowano okno izolacji o szerokości 2 m/z. Jony fragmentowano za pomocą dysocjacji indukowanej zderzeniowo (CID) z energią zderzenia 35%. Detekcję w pułapce jonowej przeprowadzono w normalnym trybie zakresu skanowania i normalnej szybkości skanowania z AGC wynoszącym 104.

Surowe dane MS przeanalizowano przy użyciu oprogramowania do ekstrakcji chromatogramów jonów prekursorowych i fragmentacyjnych, a mianowicie Skyline23 oraz EpiProfile22. Program EpiProfile został zoptymalizowany pod kątem peptydów histonowych, ponieważ integruje inteligentną ekstrakcję pól powierzchni pików w oparciu o wcześniejszą wiedzę na temat czasu retencji peptydów. Z kolei Skyline jest zoptymalizowany do analiz DIA, dlatego przedstawione rysunki DIA (Rysunki 4 oraz 5A) są zrzutami ekranu z tego oprogramowania. Z wyekstrahowanego chromatogramu jonowego pobierana jest powierzchn pod krzywą, która służy do oszacowania obfitości każdego peptydu. Powierzchn piku chromatograficznego obliczono dla jonów [M + H]+, [M + 2H]2+ oraz [M + 3H]3+ tego samego peptydu, mimo że w większości przypadków formą dominującą był jon [M + 2H]2+. Pozwala to na określenie surowej obfitości danej zmodyfikowanej formy peptydu. Aby uzyskać względną obfitość PTM, sumę wszystkich różnych form zmodyfikowanych peptydu histonowego przyjęto za 100%, a powierzchn konkretnego peptydu podzielono przez całkowitą powierzchn wszystkich form zmodyfikowanych tego peptydu histonowego.

Peptydy histonowe występują w różnych formach izobarycznych (Rysunek 5). Peptydy izobaryczne, np. K18ac i K23ac, mogą być kwantyfikowane wyłącznie na poziomie MS/MS, gdzie ich unikalne jony fragmentacyjne są wykorzystywane do określenia stosunku gatunków izobarycznych (Rysunek 5A oraz 5B). Stosunek ten służy do podziału pola powierzchni piku chromatograficznego pomiędzy oba gatunki. Przy zastosowaniu DDA formy izobaryczne zostały uwzględnione na liście mas docelowych, ponieważ peptydy te muszą być wybierane do fragmentacji przez cały czas ich elucji, co nie miałoby miejsca w standardowym eksperymencie DDA. Rozróżnienie względnej obfitości gatunków izobarycznych jest następnie przeprowadzane poprzez monitorowanie profilu elucji jonów fragmentacyjnych. Z kolei akwizycja typu DIA nie wymaga stosowania żadnej listy inkluzyjnej. Jednak ten rodzaj metody akwizycji nie jest kompatybilny z tradycyjnym przeszukiwaniem baz danych, co może uniemożliwić odkrycie nieznanych zmodyfikowanych peptydów.

Acetylację lizyny (+ 42,011 Da) odróżniono od niemal izobarycznej trimetylacji (+ 42,047 Da), stosując wysoką rozdzielczość detekcji MS (> 30 000). Ponadto acetylacja jest bardziej hydrofobowa niż trimetylacja, co prowadzi do późniejszego eluowania peptydów acetylowanych w porównaniu do odpowiednich peptydów trimetylowanych. Niezmodyfikowana forma tego samego peptydu eluuje jeszcze później, ze względu na to, że lizyna jest propionylowana. Podsumowując, kolejność hydrofobowości dla peptydu z jednym miejscem modyfikowalnym to: di- i trimetylowany < acetylowany < niezmodyfikowany (propionylowany) < monometylowany (propionylowany).

W hESCs zaobserwowano wyraźny spadek liczby acetylowanych peptydów po stymulacji do różnicowania (Rysunek 6A oraz 6B). Nie było to zaskakujące, ponieważ wcześniejsze wyniki wskazywały na wyższy poziom acetylacji w ESCs w porównaniu z komórkami różnicującymi się25, co odzwierciedla ogólnie permisywny charakter chromatyny pluripotentnej. Koncentrując się na histonie H3, ilościowo określono 35 różnych form zmodyfikowanych (Rysunek 6C). Należy jednak zaznaczyć, że liczba proteoform histonów, które można badać za pomocą tej metody, przekracza 200, wliczając w to wszystkie warianty histonów i modyfikacje o niskiej liczebności (dane nie pokazano). Ponadto nasza analiza wykazała, że można uzyskać wysoką powtarzalność między powtórzeniami technicznymi, o czym świadczy niewielka wielkość słupków błędu (reprezentujących ± odchylenie standardowe). Podsumowując, ta sekcja opisuje sposób wyznaczania względnej liczebności zmodyfikowanych peptydów histonowych przy użyciu danych nLC-MS.

Schemat procesu oczyszczania histonów; obejmuje analizę LC-MS, pochodnowanie oraz etapy frakcjonowania.
Rysunek 1: Schemat analizy histonów metodą Bottom-up MS/MS. Przedstawiono dziesięć etapów analizy histonów wraz z szacunkowym czasem wymaganym dla każdego kroku. Numery sekcji podano w nawiasach, zgodnie z zapisem w manuskrypcie. Sekcję 5, opisującą frakcjonowanie próbek w celu wyizolowania poszczególnych wariantów histonów, można pominąć, chyba że wymagana jest wysoce czuła analiza konkretnego wariantu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny i wyniki elektroforezy w żelu; analiza rozdziału białek i wizualizacja prążków.
Rycina 2: Odwrócona chromatografia cieczowa wysokoprzepływowa (RP-HPLC) do frakcjonowania wariantów histonów oraz żel Coomassie. (A) Chromatogram LC-UV przedstawiający rozdział nienaruszonych histonów. Warianty histonu H3 można odróżnić na podstawie czasu ich elucji. Frakcje mogą być zbierane ręcznie lub za pomocą automatycznego kolektora frakcji. (B) Żel Coomassie trzech powtórzeń oczyszczania histonów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Kroki metody chromatografii papierowej; użycie pipety; analiza rozdziału substancji rozpuszczonych; eksperyment laboratoryjny.
Rysunek 3: Wykonanie wkładu do końcówki typu stage-tip. Za pomocą końcówki pipety P1000 należy wyciąć dysk z materiału C18 z dysku do ekstrakcji w fazie stałej (drugi panel). Minidysk utknie w końcówce (środkowy panel), dzięki czemu można go wcisnąć do mniejszej końcówki pipety P100/200, używając dowolnego rodzaju małej kapilary. W tym przykładzie wykorzystano rurkę z topionej krzemionki o średnicy zewnętrznej 700 µm. Minidysk należy wcisnąć na dno końcówki pipety P100/200, aż nie będzie można go przesunąć dalej (ostatni panel). Tak przygotowana końcówka stage-tip jest gotowa do odsalania histonów, ponieważ posiada wystarczającą pojemność, aby zatrzymać ilość materiału próbki niezbędną do wykonania wielu powtórzeń. Konkretnie, jeden minidysk wystarcza na 15 - 20 µg próbki. Jeśli wymagana jest większa ilość próbki, można zapakować kilka dysków jeden na drugim. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Spektrometria mas DDA vs DIA: chromatogram XIC porównujący jony prekursorowe i fragmentowe na wykresach.
Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie metod DDA i DIA. W przypadku DDA cykl skanowania MS charakteryzuje się sekwencyjnym wyborem jonów prekursorowych do fragmentacji MS/MS w zależności od ich intensywności i stanu ładunku. Po sfragmentowaniu jon prekursorowy zostaje wpisany na listę wykluczeń, aby uniknąć powtarzającego się wyboru tego samego peptydu, co pozwala spektrometrowi mas na analizę sygnałów o niższej obfitości. Ta metoda akwizycji jest preferowaną techniką w proteomice w trybie odkrywania (discovery mode). Kwantyfikacja jest osiągana poprzez całkowanie sygnału pełnego skanowania danego jonu obok zidentyfikowanego widma MS/MS. W DIA cały zakres m/z jest fragmentowany w każdym cyklu skanowania. Podejście to jest mniej odpowiednie dla trybu odkrywania, ale generuje profil chromatograficzny wszystkich jonów, zarówno prekursorowych, jak i produktowych. Prowadzi to do bardziej wiarygodnej kwantyfikacji i lepszego rozróżnienia form izobarycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki chromatografii białek; wykresy czasu retencji w funkcji intensywności; tabela sekwencji peptydów; wykres analizy.
Rysunek 5: Ilościowe oznaczenie peptydów izobarycznych. (A) Przykład dwóch peptydów izobarycznych często występujących w analizie histonów. Wyekstrahowany chromatogram jonowy (XIC) ich masy prekursorowej i izotopów względnych (powyżej) jest identyczny. Jednakże XIC jonów produktowych (poniżej) pozwala na rozróżnienie dwóch form izobarycznych. Należy zauważyć, że do oszacowania względnej zawartości obu gatunków należy używać wyłącznie unikalnych jonów fragmentacyjnych. (B) Przedstawienie unikalnych jonów fragmentacyjnych dla dwóch opisanych peptydów (zaznaczonych na czerwono). (C) Lista powszechnie analizowanych peptydów u Homo sapiens posiadających co najmniej jeden ekwiwalent izobaryczny. Wskazano warianty sekwencji między wymienionymi peptydami histonowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza modyfikacji histonów, wykresy słupkowe i powierzchniowe porównujące obfitość w hESC +RA vs. hESC -RA.
Rycina 6: Reprezentatywne wyniki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z i bez traktowania kwasem retinowym. (A) Względna kwantyfikacja peptydu histony H3 KQLATKAAR (aa 18 - 26) we wszystkich jego zmodyfikowanych proteoformach. Względną obfitość oszacowano przyjmując wszystkie proteoformy jako 100% (nie pokazano względnego procentu peptydu niemodyfikowanego). (B) Względna kwantyfikacja peptydu histony H3 KSTGGKAPR (aa 9 - 17). (C) Względna obfitość wykrytych peptydów dla kanonicznej histony H3 z i bez traktowania komórek kwasem retinowym. Rycina wskazuje, w którym z dwóch traktowań dane modyfikacje są bardziej obfite (> 50%). Ogólnie wykazujemy, że acetylacja histony H3 w większości reszt lizyny ulega zmniejszeniu po indukcji różnicowania komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Roztwór nrSkład
1Roztwór stokowy buforu do izolacji jąder (NIB) przygotowuje się w następujący sposób i przechowuje w zamrożonych alikwotach po 100 ml w temperaturze -20 °C; rozmrożone NIB można przechowywać w 4 °C  przez kilka tygodni: 15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl22, 1 mM CaCl22oraz 250 mM sacharozy. pH buforu należy dostosować do wartości 7,5 za pomocą HCl. 
2Inhibitory proteaz (należy dodać do buforów bezpośrednio przed użyciem): 1 M ditiotreitol (DTT) w ddH2O2O (1 000x); 200 mM AEBSF w ddH2O2O (400x)
3inhibitor fosfatazy (dodać świeżo do buforów przed użyciem): 2.5 µM Mikrocystyna w 100% etanolu (500x)
4inhibitor HDAC (dodać świeży do buforów przed użyciem): 5 M maślan sodu, otrzymany poprzez miareczkowanie 5 M kwasu masłowego przy użyciu NaOH do pH 7,0 (500x)
5Alternatywa dla NP-40: 10% v/v w ddH2O2O
60,2 M H2SO4 w ddH2O2O
7Kwas trichlorooctowy (TCA): 100% m/v w ddH2O2O
8Aceton + 0,1% kwas solny (HCl): 0,1% v/v HCl w acetonie

Tabela 1. Roztwory.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem kosztów, czasu i wydajności. Inne preparaty są możliwe, ale mają one ograniczenia, zwłaszcza w przypadku sprzężenia z analizą SM. Na przykład protokół ekstrakcji o wysokiej zawartości soli może być stosowany do oczyszczania histonów26 zamiast wytrącania TCA (sekcja 3). Protokół o wysokiej zawartości soli jest z natury łagodniejszy, ponieważ nie używa mocnego kwasu. Zachowuje to labilne kwasowo PTM i zwiększa wydajność ekstrahowanych histonów, ponieważ wytrącanie TCA współwytrąca wiele innych białek wiążących chromatynę. Jednak ekstrakcja o wysokiej zawartości soli prowadzi do tego, że próbki zawierają zbyt skoncentrowaną sól dla HPLC-MS/MS. W alternatywnym preparacie trawienie histonów można przeprowadzić bez propionylacji (sekcja 6 - 8), na przykład poprzez skrócenie czasu inkubacji trypsyny i stosunku enzymu do substratu27 lub zastosowanie ArgC jako enzymu trawiącego28-30. Zaleca się jednak derywatyzację bezwodnikiem propionowym, ponieważ prowadzi to do wytwarzania większej ilości peptydów hydrofobowych, które są lepiej zatrzymywane podczas chromatografii cieczowej.

W przypadku derywatyzacji chemicznej oceniono różne bezwodniki kwasów organicznych i kompleksowo omówiono ich zalety18. Niemniej jednak bezwodnik propionowy okazał się najlepszym kompromisem między wydajnością, zminimalizowanymi produktami ubocznymi i poprawioną hydrofobowością peptydów. Potencjalnie bezwodnik propionowy można kupić w postaci znakowanej izotopowo; pozwala to na analizę multipleksową ze względu na możliwość mieszania wielu próbek i rozróżniania ich na poziomie MS na podstawie różnych mas przekazanych z ciężkiej etykiety. Jednak analiza ta prowadzi do zwiększenia złożoności chromatogramu LC-MS i zmniejszenia ilości próbki, którą można wstrzyknąć dla każdego pojedynczego warunku.

W związku z tym należy zwrócić uwagę na niektóre krytyczne aspekty protokołu. Poniższe informacje powinny służyć jako lista kontrolna w celu znalezienia błędów w wykonaniu procedury w przypadku uzyskania wyników negatywnych. Po pierwsze, po wytrąceniu jąder osad należy dokładnie przemyć NIB bez NP-40 Alternative (sekcja 2.10) aż do całkowitego usunięcia detergentu (zauważalnego przez brak pęcherzyków podczas mieszania). Niezastosowanie się do tego zagroziłoby ekstrakcji histonów kwasami. Po drugie, po wytrąceniu histonów za pomocą TCA (sekcja 3.9) kluczowe znaczenie ma przemycie osadu acetonem. Obecność stężonego kwasu może zaszkodzić następnemu etapowi, jeśli propionylacja i trawienie (sekcja 6.1) są wykonywane bezpośrednio. Nie byłoby to problematyczne w przypadku przeprowadzenia frakcjonowania histonów (sekcja 5). Po trzecie, ważne jest, aby reakcja propionylacji została przeprowadzona szybko (sekcja 6.3 - 6.7). W tym celu należy unikać stosowania tej samej mieszaniny propionylacji (bezwodnik propionowy + acetonitryl) dla więcej niż 3-4 kolejnych próbek. Dodatkowo pH jest najważniejszym aspektem trawienia trypsyny (sekcja 7). Jeśli nie około 8,0 (7,5 - 8,5), trawienie będzie nieefektywne. Może się tak zdarzyć, ponieważ na tym etapie próbka będzie bogata w kwas propionowy. NH4OH można dodawać do czasu, gdy będzie to konieczne. Również dla badaczy zaznajomionych z przepływami pracy proteomiki normalne będzie zakwaszenie próbki w celu zakończenia trawienia trypsyny. Nie należy tego robić, ponieważ zagrozi to następującej reakcji, tj. propionylacji N-końców peptydu (sekcja 8.1). Wreszcie, w tym samym problemie, ważne jest, aby pamiętać o analizie danych, że niezmodyfikowane peptydy nie są w rzeczywistości niezmodyfikowane; wszystkie wolne reszty lizyny i N-końce zostaną zajęte przez propionylację (56,026 Da). W związku z tym przeprowadzenie ekstrakcji chromatografii jonowej o masie odpowiadającej jednoznacznie sekwencji peptydowej nie doprowadziłoby do uzyskania żadnych wyników.

Ograniczenia metody są głównie związane z niezdolnością do wykrywania kombinatorycznych PTM, ze względu na krótkie sekwencje peptydowe, oraz z błędami w osiąganiu prawdziwej obfitości modyfikacji, ze względu na fakt, że peptydy w różnych zmodyfikowanych formach mogą jonizować z różną wydajnością. Pierwszy problem można rozwiązać, łącząc tę technikę z podejściem środkowym lub odgórnym (omówionym w 16). Ten rodzaj analizy, nawet jeśli jest technicznie trudniejszy, jest idealny do badania częstotliwości współistnienia modyfikacji. Co więcej, pozwala to na lepszą dyskryminację wariantów histonów, co nie zawsze jest możliwe do osiągnięcia przy użyciu metody bottom-up, ponieważ niektóre peptydy mają tę samą sekwencję w różnych wariantach histonów. Drugi problem, związany ze skutecznością jonizacji, można rozwiązać za pomocą biblioteki syntetycznych peptydów31. Takie podejście zapewnia dokładniejsze oszacowanie względnej obfitości histonów PTM. Jednak w większości eksperymentów pożądanym wynikiem są względne zmiany danych modyfikacji między analizowanymi warunkami. W tym przypadku taka korekta nie jest konieczna, ze względu na fakt, że wszystkie próbki mają takie samo odchylenie.

Podsumowując, protokół ten pozwala na analizę histonów PTM, które można wykonać w ciągu 3 dni przy użyciu nLC sprzężonego z tandemowym MS. Porównania z technikami innymi niż MS, tj. przy użyciu strategii opartych na przeciwciałach, jak omówiono we Wprowadzeniu, nie są odpowiednie, ponieważ nie mogą osiągnąć nawet zbliżonego poziomu przepustowości. Ponadto techniki oparte na przeciwciałach nie pozwalają na odkrycie nowych modyfikacji, ale opierają się wyłącznie na potwierdzaniu i ilościowym określaniu przewidywanych znaków. Spekulujemy zatem, że oddolna proteomika peptydów histonowych zyska popularność w laboratoriach proteomicznych ze względu na intuicyjne korzyści płynące ze znajomości regulacji znaczników histonowych, które są protagonistami w dostrajaniu ekspresji genów, a tym samym wpływają na regulację proteomu. Co więcej, opisany protokół zawiera najnowsze ulepszenia w przygotowaniu próbek i oprogramowaniu do analizy danych, które sprawiają, że analiza histonów jest bardziej trywialna również dla laboratoriów, które nigdy nie miały doświadczenia z charakterystyką tego typu hipermodyfikowanych peptydów.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z grantów NIH (DP2OD007447, R01GM110174 i R01AI118891).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trypsyna 0,25% EDTAInvitrogen25200056Do zbierania komórek
PBSInvitrogen14200075
TrisRoche77-86-1
Chlorek potasuFisher ScientificBP366-500
Chlorek soduSigmaS9888
Chlorek magnezu sześciowodnySigmaM9272
Chlorek wapnia, bezwodnySigmaC1016
SacharozaFisher ScientificBP220-1
DTTInvitrogen15508-013
AEBSFEMD Millipore Corp101500
MicrocystynaSigmaM4194
Maślan soduSigmaB5887
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt, wolny od EDTA (100x) Fisher Scientific78445
NP-40 AlternatywnyCALBIOCHEM492016
Kwas siarkowy, klasa ACSFisher Chemical7664-93-9
Kwas trichlorooctowySigmaT6399
AcetonSigma179124
HClOdczynnik Bradford Fisher ChemicalA144-500
Biorad500-0006
30% akrylamid/bis 29:1 — 500 mlKolumna Biorad1610156
CoomassieFisher Scientific20278
C18 (5 µ m) 2.1  mm x 250  mmGrace218TP52
Kolumna C18 (5 µ m) 4,6  mm x 250  mmGrace218TP54
Acetonitryl klasy HPLCFisher ChemicalA955-4
Woda klasy HPLCFisher ScientificW6 4
TFAFisher ScientificA11650
Wodorowęglan amonuSigmaA6141
wodorotlenek amonuSigma338818
propionowy bezwodnikSigma240311
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaPRV5113Do trawienia histonów dla MS
Kwas octowySigma49199
C18 dysk ekstrakcyjnyEmpore2215
Kwas mrówkowySigmaF0507

Bibliografia

  1. Waddington, C. H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters. Nature. 150, 563-565 (1942).
  2. Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 31 (1), 27-36 (2010).
  3. Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293 (5532), 1089-1093 (2001).
  4. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  5. Tessarz, P., Kouzarides, T. Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 703-708 (2014).
  6. Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol. 15 (2), 172-183 (2003).
  7. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  8. Simboeck, E., et al. A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors. J Biol Chem. 285 (52), 41062-41073 (2010).
  9. Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature. 438 (7071), 1176-1180 (2005).
  10. Xhemalce, B., Kouzarides, T. A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly. Genes Dev. 24 (7), 647-652 (2010).
  11. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142 (6), 967-980 (2010).
  12. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  13. Fernandez-Capetillo, O., et al. H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis. Dev Cell. 4 (4), 497-508 (2003).
  14. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. Embo J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
  15. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  16. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  17. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  18. Sidoli, S., et al. Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis. Proteomics. 15 (9), 1459-1469 (2015).
  19. Lin, S., Garcia, B. A. Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry. Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).
  20. Sidoli, S., et al. SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications. Mol Cell Proteomics. , (2015).
  21. Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. J Proteome Res. , (2015).
  22. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  23. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  24. Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications. J Proteome Res. 13 (10), 4470-4478 (2014).
  25. Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11493-11498 (2013).
  26. Vonholt, C., et al. Isolation and Characterization of Histones. Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).
  27. Zhang, K. L., et al. Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 306 (2), 259-269 (2002).
  28. Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells. Plos One. 6 (1), e15960(2011).
  29. Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications. Proteomics. 4 (5), 1382-1396 (2004).
  30. Zhao, X. L., et al. Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury. J Proteome Res. 13 (4), 2175-2186 (2014).
  31. Lin, S., et al. Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2450-2466 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Deratywizacja histon wtrawienie trypsynbezwodnik propionowynano LC MSanaliza PTM histon wbiologia chromatynyodsalanie peptyd w

Powiązane artykuły