Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Summary

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Abstract

Nukleosomy to najmniejsza jednostka strukturalna chromatyny, składająca się ze 147 par zasad DNA owiniętych wokół oktamera białek histonowych. Funkcja histonów jest zapośredniczona przez rozległą modyfikację potranslacyjną przez niezliczoną ilość białek jądrowych. Modyfikacje te mają kluczowe znaczenie dla integralności jądrowej, ponieważ regulują strukturę chromatyny i rekrutują enzymy zaangażowane w regulację genów, naprawę DNA i kondensację chromosomów. Mimo że duża część społeczności naukowej przyjmuje techniki oparte na przeciwciałach w celu scharakteryzowania obfitości histonów PTM, podejścia te są niskoprzepustowe i stronnicze w stosunku do hiperzmodyfikowanych białek, ponieważ epitop może być zablokowany przez pobliskie modyfikacje. Protokół ten opisuje zastosowanie chromatografii nanocieczowej (nLC) i spektrometrii mas (MS) do dokładnego oznaczania ilościowego modyfikacji histonów. Metoda ta ma na celu scharakteryzowanie dużej różnorodności histonów PTM oraz względnej obfitości kilku wariantów histonów w ramach pojedynczych analiz. W tym protokole histony są derywatyzowane bezwodnikiem propionowym, a następnie trawione trypsyną w celu wytworzenia peptydów o długości 5 - 20 aa. Po trawieniu nowo odsłonięte N-końce peptydów histonowych są derywatyzowane w celu poprawy retencji chromatograficznej podczas nLC-MS. Metoda ta pozwala na względną kwantyfikację histonów PTM obejmującą cztery rzędy wielkości.

Introduction

Epigenetyka jest definiowana jako badanie dziedzicznych zmian w ekspresji genów, które powstają w wyniku innych mechanizmów niż zmiana podstawowej sekwencji^{DNA 1}. Regulacja epigenetyczna ma kluczowe znaczenie podczas rozwoju, ponieważ organizm ulega dramatycznym zmianom fenotypowym, mimo że jego zawartość DNA się nie zmienia. Istnieje kilka krytycznych składników wymaganych do prawidłowego utrzymania epigenetycznego, w tym modyfikacje potranslacyjne histonów (PTM), warianty histonów, niekodujące RNA, metylacja DNA i czynniki wiążące DNA, z których każdy wpływa na ekspresję genów poprzez różne mechanizmy². Na przykład, podczas gdy metylacja DNA jest wysoce stabilną modyfikacją, która hamuje translację genów³, warianty histonów i histony PTM są znacznie bardziej dynamiczne i mogą wpływać na chromatynę na różne sposoby⁴.

Histononowe PTM-y są najczęściej zlokalizowane na N-końcowych ogonach, ponieważ są najbardziej narażonym i elastycznym regionem białka. Jednak rdzeń nukleosomu jest również silnie zmodyfikowany w porównaniu do przeciętnych białek⁵. Mimo że znaczniki histonowe zostały szeroko scharakteryzowane w ciągu ostatniej dekady, wiele powiązań między znanymi znakami histonowymi a ich funkcją jest nadal niejasnych. Wynika to w dużej mierze z faktu, że większość histonów PTM nie działa samodzielnie, ale raczej działa w tandemie z innymi PTM ("przesłuchy") w celu zmiany określonego procesu, takiego jak transkrypcja^6,7. Na przykład kombinatoryczny znacznik H3S10K14ac na genie p21 aktywuje jego transkrypcję, co nie wystąpiłoby tylko w przypadku jednego z dwóch PTM⁸. Białko HP1 zagęszcza chromatynę, rozpoznając H3K9me2/me3 i rozprzestrzeniając modyfikację na pobliskie nukleosomy. Jednak HP1 nie może wiązać H3K9me2/3, gdy sąsiedni S10 jest fosforylowany⁹. Acetylacja H3K4 hamuje wiązanie białka spChp1 z H3K9me2/me3 w Schizosaccharomyces pombe¹⁰. Ponadto demetylaza lizyny histonowej PHF8 ma najwyższą skuteczność wiązania nukleosomów, gdy obecne są trzy PTM H3K4me3, K9ac i K14ac¹¹. Przykłady te podkreślają, jak ważne jest uzyskanie globalnego przeglądu zmian PTM histonów, a nie skupianie się na pojedynczych modacjach.

Obecność wariantów sekwencji również zwiększa złożoność analizy histonów, ponieważ izotypy histonów zazwyczaj mają bardzo podobne sekwencje, ale często pełnią różne role w chromatynie. Na przykład H2A.x ma sekwencję C-końcową, która jest łatwiej fosforylowana po uszkodzeniu DNA w porównaniu z kanonicznym H2A¹² i jest wymagana do inaktywacji chromosomów płci w mejozie samców myszy¹³; podobnie CENP-A podstawia kanoniczny histon H3 w centromerach¹⁴. Pomimo różnych funkcji, warianty te dzielą dużą część swojej sekwencji aminokwasowej z odpowiednim histonem kanonicznym, co utrudnia ich oddzielną identyfikację i ilościowe określenie.

Techniki oparte na przeciwciałach, takie jak western blotting, zostały szeroko stosowane do charakteryzowania histonów. Jednak podejścia oparte na przeciwciałach są ograniczone z następujących powodów: (i) mogą jedynie potwierdzić obecność modyfikacji i nie mogą zidentyfikować nieznanych PTM; (ii) są stronnicze ze względu na obecność współistniejących znaków, które mogą wpływać na powinowactwo do oprawy; (iii) nie są w stanie zidentyfikować znaczników kombinatorycznych, ponieważ dostępnych jest tylko bardzo niewiele przeciwciał do tego celu oraz (iv) reagują krzyżowo między bardzo podobnymi wariantami histonów lub podobnymi PTM (np. di- i trimetylacja reszt lizyny). Egelhofer i wsp. opisano, że ponad 25% komercyjnych przeciwciał nie przechodzi testów swoistości metodą dot blot lub western blot, a wśród przeciwciał swoistych ponad 20% nie przechodzi eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny¹⁵. Spektrometria mas (MS) jest obecnie najodpowiedniejszym narzędziem analitycznym do badania nowych i/lub kombinatorycznych PTM i została szeroko wdrożona w przypadku białek histonowych (przegląd w ¹⁶). Wynika to przede wszystkim z wysokiej czułości i dokładności masy MS oraz możliwości wykonywania analiz na dużą skalę.

Strategia oddolna jest najczęściej stosowaną strategią proteomiczną opartą na MS do charakteryzacji histonów i ich PTM, w której nienaruszone białko jest trawione enzymatycznie do krótkich peptydów (5 - 20 aa). To trawienie ułatwia zarówno separację LC, jak i wykrywanie stwardnienia rozsianego. Masy w zakresie 600 - 2,000 Da są zwykle łatwiejsze do zjonizowania i identyfikacji z większą dokładnością i rozdzielczością niż większe masy. Poprawia się również fragmentacja MS/MS, ponieważ krótkie peptydy są na ogół dobrze przystosowane do dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID). Jednak histony stanowią wyzwanie dla oddolnego stwardnienia rozsianego, ponieważ są wysoko wzbogacone w podstawowe reszty aminokwasowe, a mianowicie lizynę i argininę. Dlatego trawienie trypsyny prowadzi do wytwarzania peptydów, które są zbyt małe do zatrzymania LC i jednoznacznej lokalizacji PTM. Aby obejść ten problem, nasz protokół obejmuje N-końcową derywatyzację chemiczną lizyny i peptydu¹⁷. Stosowanie bezwodnika propionowego jest zalecane do wydajnej derywatyzacji chemicznej w porównaniu z innymi odczynnikami ¹⁸. Taka derywatyzacja blokuje grupy ɛ-aminowe reszt niemodyfikowanych i monometylolizyny, umożliwiając trypsynie przeprowadzenie proteolizy tylko na C-końcu reszt argininy. Derywatyzowane aminy nie mogą wymieniać protonów z roztworem, a zatem peptydy są na ogół naładowane tylko podwójnie lub potrójnie, co ułatwia wykrywanie MS i MS/MS. Co więcej, derywatyzacja N-końcowa zwiększa hydrofobowość peptydów, a tym samym retencję chromatograficzną z odwróconymi fazami. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania histonów i przygotowania ich do analizy PTM za pomocą proteomiki oddolnej (ryc. 1). Strategia ta pozwala na ilościowe określenie pojedynczych znaczników histonów i znaczników kombinatorycznych dla histonów PTM, które są stosunkowo blisko w sekwencji aminokwasów.

Protocol

1. Zbiór komórek z hodowli

1. Jeśli komórki były hodowane w zawiesinie, zbieraj komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 rcf przez 5 minut. Jeśli przylega, odessać i wyrzucić pożywkę komórkową. Przepłukać przyłączone komórki PBS bez Ca²⁺ i Mg²⁺ (określane jako PBS w przyszłości). Inkubować komórki w trypsynie lub trypsyno-EDTA (0,025% - 0,5% w zależności od linii komórkowej) z objętością wystarczającą do pokrycia powierzchni płytek w temperaturze 37 °C, aż do oderwania się komórek (czas różni się dla różnych linii komórkowych).
2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 rcf przez 5 minut. Umyć komórki jeszcze dwa razy w PBS i zebrać przez odwirowanie.
3. Oszacuj objętość upakowanych komórek w przybliżeniu na podstawie podziałki zaznaczonej na probówkach 1,8 ml lub probówkach stożkowych 15 ml.
   Uwaga: Na tym etapie komórki z hodowli można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.

2. Izolacja jąder od nienaruszonych komórek

1. Rozmrozić komórki na lodzie.
2. Rozmrozić bufor izolacji jądrowej (NIB, tabela 1).
3. Przygotować około 5 ml buforu NIB (tabela 1) na każde 100 μl objętości wypełnionej komórki. Na każdy 1 ml buforu NIB dodać inhibitory proteazy i środki stabilizujące w następujący sposób: 1 μl 1 M DTT, 2,5 μl 200 mM AEBSF, 2 μl 2,5 μM mikrocystyny i 2 μl 5 M maślanu sodu. Od tego momentu NIB z inhibitorami będzie określany jako NIB.
   Uwaga: Jeśli badana jest fosforylacja histonów, należy dołączyć proteazę wolną od EDTA i koktajl inhibitorów fosfatazy.
4. Usunąć piątą objętość tak przygotowanego buforu NIB i dodać alternatywę NP-40 (tabela 1) do końcowego stężenia 0,2%. Pozostała czwarta piąta objętość zostanie wykorzystana do prania.
5. Umyj osad komórkowy w granulce 1:10 ogniwa do NIB bez NP-40 Alternatywny stosunek (v/v). Usunąć supernatant przez odwirowanie w temperaturze 700 rcf przez 5 min.
6. Zdaj lizę osadu komórkowego, umieszczając go na lodzie i dodając osad komórkowy 1:10 do NIB z 0,2% NP-40 Alternative (v / v).
7. W przypadku ekstrakcji z próbek tkanek homogenizować za pomocą moździerza i tłuczka lub homogenizatorów z beczki lub z odbić. Wyhodowane komórki można homogenizować przez delikatne pipetowanie.
8. Inkubować homogenizowane komórki na lodzie przez 5 - 10 minut. Komórki ulegną lizie i uwolnią jądra.
9. Wirować w temperaturze 1 000 rcf przez 5 - 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad zawiera głównie jądra komórkowe, podczas gdy supernatant zawiera głównie składniki cytoplazmatyczne. W razie potrzeby zachowaj frakcję cytoplazmatyczną.
10. Umyj osad jądrowy, delikatnie zawieszając go ponownie w NIB 1:10 (v/v) bez NP-40 Alternative.
    Uwaga: Ten etap mycia ma na celu wyłącznie usunięcie śladów detergentów przed ekstrakcją histonów z jąder.
11. Wirować w temperaturze 1 000 rcf przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
12. Powtórz kroki 2.10 - 2.11 co najmniej dwa razy, aby całkowicie usunąć NP-40 Alternative. Usunięcie NP-40 Alternative jest oczywiste, ponieważ delikatne pipetowanie na etapie mycia nie tworzy już pęcherzyków powietrza.
13. Do ekstrakcji histonów z tkanek:
    1. Opłucz świeżo lub rozmrożoną zamrożoną tkankę w lodowatej stalówce.
    2. Przenieś tkankę na szalkę Petriego umieszczoną na lodzie z NIB, tylko tyle, aby tkanka była mokra.
    3. Pokrój w kostkę na najmniejsze kawałki (< 1 mm) za pomocą żyletki, aby zwiększyć kontakt powierzchniowy w celu izolacji jąder.
    4. Przenieś zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonego homogenizatora i umyj w NIB, pipetując w górę iw dół.
    5. Usunąć bufor przez odwirowanie w temperaturze 300 rcf przez 5 minut.
    6. Dodaj NIB zawierający NP-40 Alternative do komórek w stosunku komórka:bufor 1:10 (v/v) i homogenizuj przez 5 - 10 uderzeń.
    7. Sprawdź lizę komórek i powtórz homogenizację w razie potrzeby. Dobrym wskaźnikiem, że komórki zostały poddane lizie, jest zmniejszenie objętości osadu. Osad powinien zawierać tylko jądra.
    8. Wirować przy 700 rcf przez 5 minut i oszczędzać pelet. Ten osad można ekstrahować 1 - 2 razy więcej w 1:10 (v / v) NIB zawierającego NP-40 Alternative; Na tym etapie histony są ekstrahowane z chromatyny, a osad znacznie się skurczył.
    9. Umyć dwa razy 2 - 3 ml NIB bez NP40 Alternatywnie usunąć ślady detergentu.
       Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być ponownie zawieszona w minimalnej objętości NIB + 5% glicerolu i przechowywana w temperaturze -80 °C.

3. Ekstrakcja i oczyszczanie histonów z jąder

Uwaga: Histony są bardzo bogate w podstawowe reszty aminokwasowe, co pozwala im ściśle oddziaływać ze szkieletem kwasu fosforowego DNA. Histony są jednymi z najbardziej podstawowych białek w jądrze, co pozwala na ich ekstrakcję w lodowatym kwasie siarkowym (0,2 M H₂SO₄) przy minimalnym zanieczyszczeniu białkami niehistonowymi, które wytrącają się w mocnym kwasie. Wysoko skoncentrowany TCA (do końcowego stężenia 33%) może być następnie wykorzystany do wytrącenia histonów z kwasu siarkowego. TCA jest przechowywany w 100% w brązowej butelce w temperaturze 4 °C.

1. Zawiesić jądra komórkowe w schłodzonym w stosunku 1:5 (v/v) 0,2 M H₂SO₄ (Tabela 1) przez delikatne pipetowanie.
2. Inkubować próbkę ze stałą rotacją lub delikatnym wstrząsaniem przez 2-4 godziny w temperaturze 4 °C. Zazwyczaj, w przypadku próbek zawierających więcej niż 500 μl osadów komórkowych, ekstrakcja trwa 2 godziny w celu ekstrakcji histonów; dłuższa inkubacja może spowodować ekstrakcję innych podstawowych białek. W przypadku mniejszych granulek jądrowych (< 200 μl) ekstrakcja trwająca 4 godziny zapewnia lepszą wydajność.
3. Wirować w temperaturze 3 400 rcf w temperaturze 4 °C przez 5 min.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki.
5. Powtórz kroki 3.3 - 3.4, aby usunąć wszelkie nierozpuszczalne materiały.
6. Aby wytrącić histony, należy dodać schłodzony 100% TCA (Tabela 1) do zebranego supernatantu (teraz zawierającego histony) w stosunku 1:3 (v/v), w celu uzyskania końcowego stężenia TCA 33%. Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.
   Uwaga: Próbki staną się mętne po dodaniu TCA, co wskazuje na obecność histonów.
7. Inkubować mieszaninę na lodzie przez co najmniej 1 godzinę. W przypadku mniejszych początkowych rozmiarów granulek zaleca się opady w nocy.
8. Wirować przy 3 400 rcf przez 5 min. Histony pokrywają boki rurek, a także osadzają się na dnie. Na samym dnie probówki tworzy się również biała, nierozpuszczalna osadka, która zawiera głównie białka niehistonowe i inne biomolekuły. Usunąć supernatant przez aspirację, ostrożnie, nie skrobając boków ani osadu.
9. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przepłukać probówkę lodowatym acetonem + 0,1% HCl (Tabela 1) tak, aby pokryć wytrącone białka pokrywające boki i dno.
10. Wirować przy 3,400 rcf przez 2 minuty i odsysać supernatant, ostrożnie, nie skrobając boków ani osadu.
11. Powtórz kroki 3.9 - 3.10, używając 100% lodowatego acetonu.
12. Suchy pellet z przepływem powietrza lub za pomocą wirówki próżniowej, lub po prostu pozostawiając otwartą rurkę. Aceton szybko odparowuje.
13. Rozpuść histony w ddH₂O (woda podwójnie destylowana) w minimalnej możliwej objętości, aby całkowicie rozpuścić białą warstwę. Histony są łatwo rozpuszczalne w wodzie. W przypadku granulek w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zwykle wystarcza 100 μl ddH₂O do zebrania histonów.
14. Wirować w temperaturze 3 400 rcf przez 2 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki.

4. Ocena stężenia i czystości białka

1. Do pomiaru stężenia białka należy użyć BCA, testu białka Bradforda lub analizy aminokwasów (AAA). Nie należy stosować technik, które przyjmują absorbancję przy 280 nm, ponieważ histony są ubogie w reszty aminokwasów aromatycznych.
2. Sprawdź czystość wyekstrahowanych histonów za pomocą analizy SDS-PAGE z 15% żelem akrylowym i barwieniem Coomassie (opcjonalnie).
3. Jeśli pożądane są warianty pojedynczych histonów o wysokiej czystości, należy kontynuować frakcjonowanie wariantów histonów metodą HPLC-UV (sekcja 5). Jeśli nie, przejdź bezpośrednio do przygotowania próbki do analizy PTM histonów od dołu do góry (sekcja 6).

5. Separacja wariantów histonów za pomocą HPLC z odwróconą fazą (opcjonalnie)

Uwaga: Warianty histonów o wysokiej czystości można uzyskać przez frakcjonowanie surowej mieszaniny histonów przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami sprzężonymi z detektorem UV. Te oczyszczone histony są przydatne w badaniach, które wymagają większej czułości i czystości. Jednak w przypadku standardowej charakterystyki histonu PTM ten krok można pominąć, ponieważ analiza jest wystarczająco czuła i wyczerpująca. Frakcjonowanie nienaruszonych wariantów histonów wymaga w idealnym przypadku co najmniej 100 - 300 μg materiału wyjściowego.

1. Podłączyć odpowiednią kolumnę C₁₈ 5 μm do HPLC w zależności od początkowego stężenia histonów: przy około 100 μg histonów użyć kolumny o wymiarach 2,1 mm x 250 mm o natężeniu przepływu 0,2 ml/min; przy około 300 μg histonach użyć kolumny o wymiarach 4,6 x 250 mm o natężeniu przepływu 0,8 ml/min. Przygotować bufor A i B przy użyciu dedykowanych naczyń szklanych w następujący sposób:
   1. Przygotuj bufor A: 5% acetonitrylu klasy HPLC, 0,1% TFA w wodzie klasy HPLC.
   2. Przygotuj bufor B: 95% acetonitryl klasy HPLC, 0,1% TFA w wodzie klasy HPLC.
2. Podłącz kolumnę do detektora UV i ustaw absorbancję na 210 - 220 nm.
3. Zakwasić próbkę histonu rozpuszczoną w wodzie 100% TFA, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1-1% TFA.
4. Równoważyć kolumnę ze 100% buforem A przez co najmniej 15 minut przy zalecanym natężeniu przepływu, które odpowiada w przybliżeniu objętościom trzech kolumn. Użyj tego sygnału, aby ustawić zerowy poziom absorbancji detektora UV.
5. Przygotuj probówki o odpowiedniej wielkości do zbierania frakcji ręcznie lub w automatycznym kolektorze próbek.
6. Wstrzyknąć próbkę o stężeniu około 1 μg/μl lub wyższym. Próbki rozpuszczone w większych objętościach mogą zmieniać równowagę kolumny podczas ładowania i prowadzić do mniejszej retencji.
7. Uruchom gradient, zaprogramowany w następujący sposób: od 0 do 30% B w 1 minutę, od 30 do 60% B w 90 minut i 60 do 90% B w 1 minutę.
8. Zbierać frakcje (przykładowy chromatogram pokazany na rysunku 2) w odstępach 1-minutowych za pomocą automatycznego kolektora frakcji. Zbierz frakcje w probówkach o odpowiednim rozmiarze, aby pomieścić całą objętość.
9. Wysuszyć frakcjonowane próbki w koncentratorze próżniowym.
   Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Wysuszone frakcje histonowe mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez krótki czas (1 - 2 dni) lub w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez długi czas.

6. Chemiczna derywatyzacja histonów przy użyciu bezwodnika propionowego do analizy bottom-up

1. Próbki histonów rozpuścić w 40 μl 50 mM NH₄HCO₃, pH 8,0 (zalecana ilość: 50 - 100 μg). Jeśli próbki były w czystym ddH₂O, dodaj skoncentrowany NH₄HCO₃ do 50 mM, pH 8,0.
2. Zwilż końcówkę pipety P10 w próbce, aby sprawdzić pH za pomocą pasków wskaźnikowych pH bez strat próbki. NH₄OH i kwas mrówkowy można użyć do dostosowania pH do 8,0,
   Uwaga: Poniższa część protokołu (kroki 6.3 - 6.7) powinna być wykonywana w partiach składających się maksymalnie z trzech do czterech próbek, aby utrzymać reaktywność bezwodnika propionowego.
3. Użyj dygestorium do kolejnych etapów, w których stosuje się bezwodnik propionowy. Przygotować świeży odczynnik propionylacyjny, mieszając bezwodnik propionowy z acetonitrylem w stosunku 1:3 (v/v). Dodać odczynnik propionylacji do próbki w stosunku 1:4 (v/v). W przypadku 40 μl histonów dodać 10 μl odczynnika propionylacyjnego.
   Uwaga: Na tym etapie można zaobserwować białe zanieczyszczenia. Zawiera on jednak głównie sole i kwas propionowy, a zatem nie trzeba podejmować żadnych konkretnych działań.
4. Szybko dodaj NH₄OH, aby przywrócić pH 8,0 do roztworu. Uwaga: Bezwodnik propionowy reagujący z wolnymi aminami peptydów wytwarza kwas propionowy, który obniża pH. Zwykle dodanie NH₄OH do próbki w stosunku 1:5 (v/v) jest odpowiednie do przywrócenia pH 8,0; np. 8 μl NH₄OH do 40 μl próbki.
5. Natychmiast wymieszaj przez wirowanie.
6. Sprawdź pH zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 6.2.
   Uwaga: Gdy pH jest większe niż 10,0, możliwe jest znakowanie innych reszt aminokwasowych o wyższym pKa.
7. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
8. Powtórzyć kroki 6.3 - 6.7, ściśle wykonując reakcję dla nie więcej niż 3 lub 4 próbek na partię odczynnika propionylacyjnego.
9. Próbki należy suszyć do 10 - 20 μl w koncentratorze próżniowym. Powoduje to odparowanie nieprzereagowanego bezwodnika propionowego, acetonitrylu, kwasu octowego i amoniaku uwalnianego z NH₄OH. Jeśli próbki całkowicie wyschną, nie wystąpią znaczące straty próbki.
   Uwaga: Zamiast acetonitrylu można stosować izopropanol. Jednak acetonitryl ma niższe napięcie powierzchniowe, a tym samym szybsze parowanie.
10. Zawiesić lub rozcieńczyć próbki za pomocą_ddH2O aż do uzyskania 40 μl końcowej objętości.
11. Powtórz kroki 6.2 - 6.9. Podwójna runda propionylacji histonów zapewnia > 95% zakończenia reakcji.
12. Napełnij butlę bezwodnika propionowego argonem, aby zapobiec tworzeniu się kwasu octowego w kontakcie z wilgocią w butelce.
    Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C rozpuszczona w ddH₂O lub wysuszona.

7. Trawienie proteolityczne z trypsyną

1. Zawiesić histony w 50 mM NH₄HCO₃, aby osiągnąć optymalne stężenie 1 μg/μl lub wyższe. Bardziej rozcieńczone próbki prowadzą do niższej wydajności trypsyny.
   Uwaga: Histony na tym etapie muszą mieć pH 8,0 Jeśli nadal jest kwaśny, dodaj sól NH₄HCO₃ do próbki za pomocą końcówki pipety.
2. Dodaj trypsynę do próbek histonów w stosunku 1:10 (wag./wag.).
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 - 8 godzin.
4. Zatrzymać trawienie przez zamrożenie w temperaturze -80 °C.
5. Wysuszyć próbkę do 10 - 20 μl w koncentratorze próżniowym.
   Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.

8. Propionylacja peptydów histonowych na N-końcach

Uwaga: W tej sekcji opisano derywatyzację N-końców peptydów powstałych w wyniku trawienia trypsyny. Taki zabieg poprawia retencję HPLC najkrótszych peptydów (np. aminokwasu 3 - 8 histonu H3), ponieważ grupa propionylowa zwiększa hydrofobowość peptydów.

1. Zawiesić próbki w 30 μl 100 mM NH₄HCO_3.
2. Powtórz kroki 6.1 - 6.9.
   Uwaga: To normalne, że suszenie próbek w próżni na tym etapie zajmuje więcej czasu.
3. Zawiesić lub rozcieńczyć próbki 50 - 100 μl ddH₂O + 0,1% TFA lub 0,5% kwasu octowego. Uwaga: Kwas octowy jest zalecany do długiego przechowywania, ponieważ TFA ułatwia utlenianie metioniny w dłuższej perspektywie. Z drugiej strony, TFA jest zalecane, jeśli przechylanie etapu (sekcja 9) jest wykonywane tego samego dnia, ponieważ TFA pomaga w lepszym zatrzymywaniu chromatograficznym.
   Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.

9. Odsalanie próbek za pomocą końcówek etapowych

Uwaga: Na tym etapie w próbce znajduje się sól. Sole utrudniają analizę HPLC-MS, ponieważ jonizują podczas elektrorozpylania, tłumiąc sygnał z peptydów. Sole mogą również tworzyć addukty jonowe na peptydach, zmniejszając intensywność sygnału dla peptydu nieaddukowanego. Ponieważ addukowany peptyd będzie miał inną masę, peptyd nie zostanie prawidłowo zidentyfikowany ani określony ilościowo.

1. Za pomocą końcówki do pipet P1000 przedziurkuj krążek z materiałem C₁₈ z dysku do ekstrakcji do fazy stałej. Wypchnij minidysk z końcówki P1000 za pomocą kapilary ze stopionej krzemionki i umieść minidysk na dnie końcówki pipety P100 / 200. Upewnij się, że dysk jest dobrze zaklinowany w dolnej części końcówki (Rysunek 3).
   Uwaga: Końcówka P1000 ma dość mały otwór do przebicia dysku C₁₈. Właściwe jest wycięcie ostatniego centymetra końcówki, aby uzyskać otwór o większej średnicy.
2. Użyj dwóch stempli C₁₈ w tej samej końcówce P100/P200 w przypadku odsalania ponad 25 μg próbki.
3. Użyj adaptera wirówki, aby przytrzymać końcówki etapu na miejscu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml lub 2 ml. Używaj powolnych (300 - 400 rcf) obrotów; Rozpuszczalniki zwykle przechodzą przez żywicę w czasie krótszym niż minuta.
4. Przepłukać żywicę, wirując 50 μl 100% acetonitrylu, aby aktywować materiał C₁₈ i usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
5. Wyrównać krążek przez przepłukanie 80 μl 0,1% TFA przez powolne wirowanie.
6. Zakwasić próbkę do pH 4,0 lub niższego kwasem octowym. Sprawdź pH za pomocą pasków pH, aby zminimalizować utratę próbki. Załadować próbkę na dysk przez powolne wirowanie.
7. Przepłukać próbkę, przepłukując 70 - 80 μl 0,1% TFA przez powolne odwirowywanie.
8. Elutę próbki przez przepłukiwanie 70 μl 75% acetonitrylu i 0,5% kwasu octowego przez powolne wirowanie. Pobrać próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml.
9. Sucha próbka w koncentratorze próżniowym.
   Uwaga: Tymczasowy punkt zatrzymania: Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.

10. Analiza peptydów histonowych

Uwaga: Platformę nLC-MS należy skonfigurować tak, jak w przypadku tradycyjnej analizy peptydów. Zaleca się stosowanie kolumny przepływowej 200 - 300 nl (kolumna analityczna o średnicy wewnętrznej 75 μm, cząstki C₁₈), ponieważ stanowią one doskonały kompromis między czułością a stabilnością. Metoda pozyskiwania MS może być kombinacją akwizycji zależnej od danych (DDA) z ukierunkowanymi skanami¹⁹ lub akwizycją niezależną od danych (DIA)^20,21, obie opisane w reprezentatywnych wynikach i na rysunku 4.

1. Przygotować HPLC — A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie o czystości HPLC; B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu klasy HPLC.
2. Zaprogramować metodę HPLC w następujący sposób: od 0 do 30% buforu B w ciągu 30 min, od 30 do 100% B przez następne 5 min i przy izokratycznym 100% B przez 8 min. Jeżeli HPLC nie jest zaprogramowany do automatycznego równoważenia kolumny przed załadowaniem próbki, należy uwzględnić następujące elementy: nachylenie od 100 do 0% B w ciągu 1 minuty i przepływ izokratyczny przy 0 % B przez 10 minut. Ustawić natężenie przepływu analizy na 250 - 300 nl/min.
3. Zaprogramuj metodę akwizycji MS tak, aby wykonywała DDA w połączeniu z ukierunkowanymi skanami¹⁹ lub DIA ^20,21 (rysunek 4). Upewnij się, że cykl pracy MS pozwala na jedno pełne skanowanie MS co ~ 2 sekundy, aby mieć wystarczającą liczbę punktów danych do przekroju piku chromatograficznego, co umożliwia dokładniejsze określenie ilościowe. Uwaga: W przypadku chromatografii C₁₈ średnia podstawowa szerokość piku wynosi około 30 sekund dla gradientu opisanego powyżej.
4. Załadować około 1 μg próbki do kolumny HPLC.
5. Uruchom metodę HPLC-MS/MS zgodnie z programem.
   Uwaga: W protokole nie zalecamy podawania szczegółów dotyczących kolumn, instrumentów MS ani parametrów MS, ponieważ każda optymalna konfiguracja opracowana przez indywidualne laboratorium proteomiczne będzie odpowiednia dla tej metody. Laboratoria proteomiczne powinny korzystać ze zoptymalizowanej konfiguracji, ponieważ peptydy histonowe oddzielają się jako tradycyjne peptydy.

11. Analiza danych

1. Zaimportuj surowe pliki MS do oprogramowania, aby przeprowadzić integrację obszaru szczytu. Uwaga: EpiProfile²² jest zalecany, ponieważ jest zoptymalizowany pod kątem peptydów histonowych; Wykorzystując wiedzę o czasie retencji elucji chromatograficznej, przeprowadza niezawodną ekstrakcję obszaru piku znanych peptydów histonowych. Alternatywnie, Skyline²³ to kolejne idealne oprogramowanie do tego celu.
   1. Oblicz względną obfitość danego peptydu, dzieląc jego obszar przez całkowity obszar tego peptydu we wszystkich jego zmodyfikowanych formach. Uwaga: W przypadku analizy odkrywczej zaleca się, aby Mascot zidentyfikował widma zmodyfikowanych peptydów histonowych. Wydajność tego narzędzia została opisana niedawno²⁴. Wszystkie inne wyszukiwarki baz danych dla proteomiki są również użyteczne, ale w naszych testach zapewniały niższą wydajność.

Results

Jako przykład, przeanalizowaliśmy histony wyekstrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) ze stymulacją i bez stymulacji kwasem retinowym (RA), zaczynając od 200 μl granulek komórek. Obecność RZS w hodowli komórkowej prowadzi do różnicowania ESC. Z osadu komórkowego wyekstrahowano około 50 - 100 μg histonów, co jest więcej niż wystarczające do wykonania wielu wstrzyknięć LC-MS peptydów histonowych. Po derywatyzacji, mineralizacji i odsoleniu próbki załadowano do kolumny C₁₈ o wymiarach 75 μm x 15 cm (średnica cząstek 3 μm, wielkość porów 300 A) w trybie szeregowym z wysokowydajnym systemem chromatografii nano cieczy z chipami mikroprzepływowymi sprzężonymi z hybrydowym liniowym kwadrupolem pułapkowym – spektrometrem mas orbitrap. Akwizycję stwardnienia rozsianego przeprowadzono za pomocą DIA. Równolegle próbki analizowano również metodą DDA przy użyciu nanoprzepływowego UHPLC sprzężonego z hybrydowym spektrometrem masowym z pułapką jonową i orbitrapem (dane nie pokazane). W każdym cyklu wykonywano jedną pełną detekcję orbitrapu MS z zakresem skanowania od 290 do 1 400 m/z, rozdzielczością 60 000 (przy 200 m/z) i AGC 10⁶. Następnie zastosowano tryb akwizycji zależnej od danych z dynamicznym wyłączeniem 30 sekund. Skany MS/MS śledzono na jonach macierzystych z najbardziej intensywnych. Jony o stanie naładowania równym jeden zostały wykluczone z MS/MS. Zastosowano okno izolacyjne 2 m/z. Jony zostały rozdrobnione za pomocą dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID) z energią zderzenia wynoszącą 35%. Wykrywanie pułapki jonowej było używane w normalnym trybie zakresu skanowania i normalnej szybkości skanowania z AGC 10⁴.

Surowe dane MS zostały przeanalizowane przy użyciu oprogramowania do ekstrakcji chromatogramów jonów prekursorowych i fragmentowych, a mianowicie Skyline²³ i EpiProfile²². EpiProfile został zoptymalizowany pod kątem peptydów histonowych, ponieważ integruje inteligentną ekstrakcję obszaru piku dzięki wcześniejszej wiedzy na temat czasu retencji peptydów. Z drugiej strony, Skyline jest zoptymalizowany pod kątem analiz DIA, a zatem wyświetlane dane DIA (rysunki 4 i 5A) są zrzutami ekranu z tego oprogramowania. Z wyekstrahowanego chromatogramu jonowego pobierany jest obszar pod krzywą, który służy do oszacowania obfitości każdego peptydu. Powierzchnię piku chromatograficznego obliczono dla jonów [M + H]⁺, [M + 2H]²⁺ i [M + 3H]³⁺ tego samego peptydu, mimo że w większości przypadków [M + 2H]²⁺ była postacią dominującą. Zapewnia to surową obfitość danej zmodyfikowanej formy peptydu. Aby osiągnąć względną obfitość PTM, suma wszystkich różnych zmodyfikowanych form peptydu histonowego została uznana za 100%, a obszar danego peptydu podzielono przez całkowity obszar tego peptydu histonowego we wszystkich jego zmodyfikowanych formach.

Peptydy histonowe występują w różnych formach izobarycznych (Rysunek 5). Peptydy izobaryczne, np. K18ac i K23ac, można oznaczyć ilościowo tylko na poziomie MS/MS, gdzie ich unikalne jony fragmentacyjne są wykorzystywane do określenia stosunku gatunków izobarycznych (ryc. 5A i 5B). Stosunek ten służy do podziału obszaru piku chromatograficznego między dwoma gatunkami. Podczas stosowania DDA te formy izobaryczne zostały włączone do listy docelowych mas, ponieważ peptydy te muszą być wybrane do fragmentacji przez całą ich elucję, co nie wystąpiłoby w standardowym eksperymencie DDA. Rozróżnienie względnej liczebności gatunków izobarycznych jest następnie przeprowadzane poprzez monitorowanie profilu elucji jonów fragmentacyjnych. Z drugiej strony, nabycie typu DIA nie wymaga żadnej listy włączającej. Jednak ten rodzaj metody pozyskiwania nie jest kompatybilny z tradycyjnym przeszukiwaniem baz danych, a tym samym może uniemożliwić odkrycie nieznanych zmodyfikowanych peptydów.

Acetylacja lizyny (+ 42,011 Da) została odróżniona od prawie izobarycznej trimetylacji (+ 42,047 Da) za pomocą akwizycji MS o wysokiej rozdzielczości (> 30,000). Co więcej, acetylacja jest bardziej hydrofobowa niż trimetylacja, co prowadzi do elucji acetylowanych peptydów później niż odpowiednie trimetylowane. Niezmodyfikowana forma tego samego peptydu eluuje się jeszcze później, ze względu na fakt, że lizyna jest propionylowana. Podsumowując, kolejność hydrofobowości dla peptydu z jednym modyfikowalnym miejscem jest di- i trimetylowana < acetylowana < niemodyfikowana (propionylowana) < monometylowana (propionylowana).

hESC wykazały wyraźną redukcję acetylowanych peptydów, gdy były stymulowane do różnicowania (Rysunek 6A i 6B). Nie było to zaskakujące, ponieważ poprzednie wyniki wykazały wyższą acetylację w ESC w porównaniu z różnicującymi²⁵, co odzwierciedla ogólnie permisywny charakter pluripotencjalnej chromatyny. Skupiając się na histonie H3, określono ilościowo 35 różnych zmodyfikowanych form (Figura 6C). Jednak wszystkie proteoformy histonów, które można badać za pomocą tego podejścia, to ponad 200, w tym wszystkie warianty histonów i modyfikacje o niskiej liczebności (dane nie pokazane). Ponadto przeprowadzona przez Trybunał analiza wykazała, że między kontrpróbami technicznymi można uzyskać wysoką odtwarzalność, o czym świadczy niewielki rozmiar słupków błędu (reprezentujący ± odchylenie standardowe). Podsumowując, w tej sekcji opisano, jak wyodrębnić względną obfitość peptydów zmodyfikowanych histonami przy użyciu danych nLC-MS.

Rysunek 1: Proces pracy dla oddolnej analizy histonów MS/MS. Przedstawiono dziesięć kroków analizy histonów, w tym oszacowanie czasu wymaganego na każdy krok. Numer sekcji podany jest w nawiasie, tak jak znajduje się w manuskrypcie. Sekcja 5, opisująca frakcjonowanie próbki w celu wyizolowania różnych wariantów histonów, może zostać pominięta, chyba że istnieje potrzeba bardzo czułej analizy danego wariantu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Odwrócona faza wysokiego przepływu LC do frakcjonowania wariantu histonu i żelu Coomassie. (A) Chromatogram LC-UV przedstawiający nienaruszoną separację histonów. Warianty histonu H3 można odróżnić od siebie na podstawie czasu elucji. Frakcje mogą być zbierane ręcznie lub za pomocą automatycznego kolektora frakcji. (B) Żel Coomassie składający się z trzech powtórzeń oczyszczania histonów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wykonanie zatyczki do wywrotu stolika. Za pomocą końcówki do pipety P1000 przebić krążek wykonany z materiału C₁₈ z dysku do ekstrakcji do fazy stałej (drugi panel). Minidysk wbije się w końcówkę (środkowy panel), dzięki czemu można go wypchnąć do mniejszej końcówki do pipety P100/200 za pomocą dowolnego rodzaju małej kapilary. W tym przykładzie użyliśmy rurki ze stopionej krzemionki o średnicy zewnętrznej 700 μm. Minidysk należy wsunąć na spód końcówki pipety P100/200 do momentu, aż nie będzie mógł się dalej poruszać (ostatni panel). Końcówka stolika jest gotowa do odsalania histonów, ponieważ ma wystarczającą pojemność, aby zatrzymać wystarczającą ilość materiału próbki dla wielu powtórzeń. W szczególności jeden minidysk wystarcza na 15 - 20 μg próbki. Jeśli wymagana jest większa próbka, wiele dysków można spakować jeden na drugi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie metod DDA i DIA. W przypadku stosowania DDA cykl skanowania MS charakteryzuje się sekwencyjnym doborem jonów prekursorowych do fragmentacji MS/MS w zależności od ich intensywności i stanu naładowania. Po rozdrobnieniu jonu prekursorowego umieszcza się go na liście wykluczeń, aby uniknąć powtarzającej się selekcji tego samego peptydu, dzięki czemu MS może "zakopać się" w mniej obfitych sygnałach. Ta metoda akwizycji jest techniką z wyboru w proteomice w trybie odkrywania. Oznaczanie ilościowe uzyskuje się poprzez zintegrowanie pełnego sygnału skanowania danego jonu obok zidentyfikowanego widma MS/MS. W DIA cały zakres m/z jest fragmentowany przy każdym cyklu skanowania. Podejście to jest mniej odpowiednie dla trybu wykrywania, ale tworzy profil chromatograficzny wszystkich jonów, prekursorów i produktów. Prowadzi to do pewniejszej kwantyfikacji i dyskryminacji form izobarycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Kwantyfikacja peptydów izobarycznych. (A) Przykład dwóch peptydów izobarycznych powszechnie występujących w analizie histonów. Wyekstrahowany chromatogram jonowy (XIC) ich masy prekursorowej i izotopów względnych (powyżej) jest identyczny. Jednak XIC jonów produktowych (poniżej) pozwala na rozróżnienie dwóch form izobarycznych. Warto zauważyć, że do oszacowania względnej liczebności tych dwóch gatunków należy używać tylko unikalnych jonów fragmentacyjnych. (B) Reprezentacja unikalnych jonów fragmentacyjnych dla dwóch opisanych peptydów (zaznaczonych na czerwono). (C) Wykaz powszechnie analizowanych peptydów u Homo sapiens posiadających co najmniej jeden odpowiednik izobaryczny. Wskazywane są warianty sekwencji między wymienionymi peptydami histonowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Reprezentatywne wyniki ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z i bez leczenia kwasem retinowym. (A) Względna kwantyfikacja peptydu histonu H3 KQLATKAAR (aa 18 - 26) we wszystkich jego zmodyfikowanych proteoformach. Względna liczebność została oszacowana przy użyciu wszystkich proteoform na 100% (względna zawartość procentowa niezmodyfikowanego peptydu nie jest pokazana). (B) Względna kwantyfikacja peptydu histonu H3 KSTGGKAPR (aa 9 - 17). (C) Względna obfitość wykrytych peptydów dla kanonicznego histonu H3 z leczeniem komórek kwasem retinowym i bez niego. Rysunek wskazuje, w którym z dwóch zabiegów dane modyfikacje są bardziej obfite (> 50%). Ogólnie rzecz biorąc, wykazujemy, że acetylacja histonów H3 zmniejsza się w większości reszt lizyny po indukcji różnicowania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozwiązanie # Kompozycja 1 Zapas bufora izolacji jądrowej (NIB) jest sporządzany w następujący sposób i przechowywany w stanie zamrożonym jako 100 ml porcji w temperaturze -20 °C; rozmrożony NIB może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni: 15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ i 250 mM sacharozy. pH buforu dostosowuje się do 7,5 za pomocą HCl. cyfra arabska Inhibitory proteazy (dodać świeże do przed użyciem): 1 M ditiotreitol (DTT) w ddH₂O (1,000x); 200 mM AEBSF w ddH₂O (400x) 3 inhibitor fosfatazy (dodać świeży do przed użyciem): 2,5 μM Mikrocystyna w 100% etanolu (500x) 4 Inhibitor HDAC (dodać świeży do przed użyciem): 5 M maślan sodu, otrzymany przez miareczkowanie 5 M kwasu masłowego przy użyciu NaOH do pH 7,0 (500x) 5 NP-40 Alternatywnie: 10% v/v w ddH₂O 6 0.2 M H₂SO₄ in ddH₂O 7 Kwas trichlorooctowy (TCA): 100% w/v w ddH₂O 8 Aceton+0,1% Kwas solny (HCl): 0,1% v/v HCl w acetonie

Tabela 1. Rozwiązania.

Discussion

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem kosztów, czasu i wydajności. Inne preparaty są możliwe, ale mają one ograniczenia, zwłaszcza w przypadku sprzężenia z analizą SM. Na przykład protokół ekstrakcji o wysokiej zawartości soli może być stosowany do oczyszczania histonów²⁶ zamiast wytrącania TCA (sekcja 3). Protokół o wysokiej zawartości soli jest z natury łagodniejszy, ponieważ nie używa mocnego kwasu. Zachowuje to labilne kwasowo PTM i zwiększa wydajność ekstrahowanych histonów, ponieważ wytrącanie TCA współwytrąca wiele innych białek wiążących chromatynę. Jednak ekstrakcja o wysokiej zawartości soli prowadzi do tego, że próbki zawierają zbyt skoncentrowaną sól dla HPLC-MS/MS. W alternatywnym preparacie trawienie histonów można przeprowadzić bez propionylacji (sekcja 6 - 8), na przykład poprzez skrócenie czasu inkubacji trypsyny i stosunku enzymu do substratu²⁷ lub zastosowanie ArgC jako enzymu trawiącego^28-30. Zaleca się jednak derywatyzację bezwodnikiem propionowym, ponieważ prowadzi to do wytwarzania większej ilości peptydów hydrofobowych, które są lepiej zatrzymywane podczas chromatografii cieczowej.

W przypadku derywatyzacji chemicznej oceniono różne bezwodniki kwasów organicznych i kompleksowo omówiono ich zalety¹⁸. Niemniej jednak bezwodnik propionowy okazał się najlepszym kompromisem między wydajnością, zminimalizowanymi produktami ubocznymi i poprawioną hydrofobowością peptydów. Potencjalnie bezwodnik propionowy można kupić w postaci znakowanej izotopowo; pozwala to na analizę multipleksową ze względu na możliwość mieszania wielu próbek i rozróżniania ich na poziomie MS na podstawie różnych mas przekazanych z ciężkiej etykiety. Jednak analiza ta prowadzi do zwiększenia złożoności chromatogramu LC-MS i zmniejszenia ilości próbki, którą można wstrzyknąć dla każdego pojedynczego warunku.

W związku z tym należy zwrócić uwagę na niektóre krytyczne aspekty protokołu. Poniższe informacje powinny służyć jako lista kontrolna w celu znalezienia błędów w wykonaniu procedury w przypadku uzyskania wyników negatywnych. Po pierwsze, po wytrąceniu jąder osad należy dokładnie przemyć NIB bez NP-40 Alternative (sekcja 2.10) aż do całkowitego usunięcia detergentu (zauważalnego przez brak pęcherzyków podczas mieszania). Niezastosowanie się do tego zagroziłoby ekstrakcji histonów kwasami. Po drugie, po wytrąceniu histonów za pomocą TCA (sekcja 3.9) kluczowe znaczenie ma przemycie osadu acetonem. Obecność stężonego kwasu może zaszkodzić następnemu etapowi, jeśli propionylacja i trawienie (sekcja 6.1) są wykonywane bezpośrednio. Nie byłoby to problematyczne w przypadku przeprowadzenia frakcjonowania histonów (sekcja 5). Po trzecie, ważne jest, aby reakcja propionylacji została przeprowadzona szybko (sekcja 6.3 - 6.7). W tym celu należy unikać stosowania tej samej mieszaniny propionylacji (bezwodnik propionowy + acetonitryl) dla więcej niż 3-4 kolejnych próbek. Dodatkowo pH jest najważniejszym aspektem trawienia trypsyny (sekcja 7). Jeśli nie około 8,0 (7,5 - 8,5), trawienie będzie nieefektywne. Może się tak zdarzyć, ponieważ na tym etapie próbka będzie bogata w kwas propionowy. NH₄OH można dodawać do czasu, gdy będzie to konieczne. Również dla badaczy zaznajomionych z przepływami pracy proteomiki normalne będzie zakwaszenie próbki w celu zakończenia trawienia trypsyny. Nie należy tego robić, ponieważ zagrozi to następującej reakcji, tj. propionylacji N-końców peptydu (sekcja 8.1). Wreszcie, w tym samym problemie, ważne jest, aby pamiętać o analizie danych, że niezmodyfikowane peptydy nie są w rzeczywistości niezmodyfikowane; wszystkie wolne reszty lizyny i N-końce zostaną zajęte przez propionylację (56,026 Da). W związku z tym przeprowadzenie ekstrakcji chromatografii jonowej o masie odpowiadającej jednoznacznie sekwencji peptydowej nie doprowadziłoby do uzyskania żadnych wyników.

Ograniczenia metody są głównie związane z niezdolnością do wykrywania kombinatorycznych PTM, ze względu na krótkie sekwencje peptydowe, oraz z błędami w osiąganiu prawdziwej obfitości modyfikacji, ze względu na fakt, że peptydy w różnych zmodyfikowanych formach mogą jonizować z różną wydajnością. Pierwszy problem można rozwiązać, łącząc tę technikę z podejściem środkowym lub odgórnym (omówionym w ¹⁶). Ten rodzaj analizy, nawet jeśli jest technicznie trudniejszy, jest idealny do badania częstotliwości współistnienia modyfikacji. Co więcej, pozwala to na lepszą dyskryminację wariantów histonów, co nie zawsze jest możliwe do osiągnięcia przy użyciu metody bottom-up, ponieważ niektóre peptydy mają tę samą sekwencję w różnych wariantach histonów. Drugi problem, związany ze skutecznością jonizacji, można rozwiązać za pomocą biblioteki syntetycznych peptydów³¹. Takie podejście zapewnia dokładniejsze oszacowanie względnej obfitości histonów PTM. Jednak w większości eksperymentów pożądanym wynikiem są względne zmiany danych modyfikacji między analizowanymi warunkami. W tym przypadku taka korekta nie jest konieczna, ze względu na fakt, że wszystkie próbki mają takie samo odchylenie.

Podsumowując, protokół ten pozwala na analizę histonów PTM, które można wykonać w ciągu 3 dni przy użyciu nLC sprzężonego z tandemowym MS. Porównania z technikami innymi niż MS, tj. przy użyciu strategii opartych na przeciwciałach, jak omówiono we Wprowadzeniu, nie są odpowiednie, ponieważ nie mogą osiągnąć nawet zbliżonego poziomu przepustowości. Ponadto techniki oparte na przeciwciałach nie pozwalają na odkrycie nowych modyfikacji, ale opierają się wyłącznie na potwierdzaniu i ilościowym określaniu przewidywanych znaków. Spekulujemy zatem, że oddolna proteomika peptydów histonowych zyska popularność w laboratoriach proteomicznych ze względu na intuicyjne korzyści płynące ze znajomości regulacji znaczników histonowych, które są protagonistami w dostrajaniu ekspresji genów, a tym samym wpływają na regulację proteomu. Co więcej, opisany protokół zawiera najnowsze ulepszenia w przygotowaniu próbek i oprogramowaniu do analizy danych, które sprawiają, że analiza histonów jest bardziej trywialna również dla laboratoriów, które nigdy nie miały doświadczenia z charakterystyką tego typu hipermodyfikowanych peptydów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsyna 0,25% EDTA	Invitrogen	25200056	Do zbierania komórek
PBS	Invitrogen	14200075
Tris	Roche	77-86-1
Chlorek potasu	Fisher Scientific	BP366-500
Chlorek sodu	Sigma	S9888
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma	M9272
Chlorek wapnia, bezwodny	Sigma	C1016
Sacharoza	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Invitrogen	15508-013
AEBSF	EMD Millipore Corp	101500
Microcystyna	Sigma	M4194
Maślan sodu	Sigma	B5887
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt, wolny od EDTA (100x)	Fisher Scientific	78445
NP-40 Alternatywny	CALBIOCHEM	492016
Kwas siarkowy, klasa ACS	Fisher Chemical	7664-93-9
Kwas trichlorooctowy	Sigma	T6399
Aceton	Sigma	179124
HCl	Odczynnik Bradford Fisher Chemical	A144-500
	Biorad	500-0006
30% akrylamid/bis 29:1 — 500 ml	Kolumna Biorad	1610156
Coomassie	Fisher Scientific	20278
C18 (5 µ m) 2.1  mm x 250  mm	Grace	218TP52
Kolumna C18 (5 µ m) 4,6  mm x 250  mm	Grace	218TP54
Acetonitryl klasy HPLC	Fisher Chemical	A955-4
Woda klasy HPLC	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Wodorowęglan amonu	Sigma	A6141
wodorotlenek amonu	Sigma	338818
propionowy bezwodnik	Sigma	240311
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania	Promega	PRV5113	Do trawienia histonów dla MS
Kwas octowy	Sigma	49199
C18 dysk ekstrakcyjny	Empore	2215
Kwas mrówkowy	Sigma	F0507