Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ciągły wlew dożylny jest preferowaną drogą leczenia blokera receptora argininy-wazopresyny Koniwaptanu u myszy w celu zbadania obrzęku mózgu wywołanego udarem mózgu

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54170

⸱

1 września 2016

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Nasze badania wykazały, że korzystne działanie koniwaptanu zależy od metody dostarczania po eksperymentalnym udarze u myszy. Opracowaliśmy protokół badawczy dotyczący dostarczania blokera receptora przez cewnik dożylny w przypadku powstawania obrzęku mózgu wywołanego udarem mózgu u myszy.

Streszczenie

Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na świecie. Udar jest powikłany obrzękiem mózgu i innymi zdarzeniami patofizjologicznymi. Jednym z najważniejszych czynników w rozwoju i ewolucji obrzęku mózgu wywołanego udarem mózgu jest hormon arginina-wazopresyna i jego receptory, V1a i V2. Ostatnio koniwaptan bloker receptorów V1a i V2 przyciąga uwagę jako potencjalny lek zmniejszający obrzęk mózgu po udarze. Jednak modele zwierzęce, które obejmują zastosowania koniwaptanu w badaniach nad udarem, muszą być modyfikowane w oparciu o możliwe drogi podawania. W tym miejscu porównano wyniki 48-godzinnego ciągłego dożylnego (IV) leczenia koniwaptanem dootrzewnowym (IP) po eksperymentalnym udarze u myszy. Opracowaliśmy protokół, w którym niedrożność tętnicy środkowej mózgu połączono z instalacją cewnika do żyły szyjnej w celu dożylnego leczenia koniwaptanem (0,2 mg) lub nośnikiem. Różnym grupom zwierząt podawano w bolusie 0,2 mg koniwaptanu lub IP podłoża na dobę. Eksperymentalny obrzęk mózgu wywołany udarem oceniano u myszy po ciągłym leczeniu dożylnym i IP. Porównanie wyników wykazało, że ciągłe dożylne podawanie koniwaptanu łagodzi poniedokrwienny obrzęk mózgu u myszy, w przeciwieństwie do podawania IP koniwaptanu. Wnioskujemy, że nasz model może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad zastosowaniami koniwaptanu w kontekście udaru mózgu i obrzęku mózgu.

Wprowadzenie

Udar nadal stanowi ogromne obciążenie dla pacjentów i klinicystów. Modele udaru u zwierząt są wykorzystywane w warunkach laboratoryjnych od prawie dwóch dekad. 1 Niemniej jednak eksperymentalne terapie, które działają u zwierząt, często nie sprawdzają się u ludzi. 2 Ta rozbieżność w wynikach leczenia może wynikać z różnych czynników, takich jak drogi podawania leków stosowanych w badaniach na zwierzętach, metabolizm leków i szybkość eliminacji oraz wiele innych aspektów. Jedno z głównych powikłań udaru, obrzęk mózgu, jest przedmiotem obecnych badań w neurobiologii. Mechanizmy powstawania obrzęków mózgu obejmują zaburzenia równowagi wodno-elektrolitowej wywołane odpowiedzią arginina-wazopresyna (AVP) na niedokrwienne uszkodzenie mózgu. 3 Dlatego AVP i jego receptory (V1a i V2) są głównym przedmiotem badań nad powstawaniem obrzęku mózgu po niedokrwieniu. 3

Opracowaliśmy metodologię badania wpływu mieszanego blokera receptorów argininy i wazopresyny (V1a i V2) koniwaptanu na postniedokrwienny obrzęk mózgu u myszy. 4 Cele molekularne koniwaptanu5 sprawiają, że lek jest odpowiednim kandydatem do zbadania jego właściwości w łagodzeniu obrzęku mózgu. Ponadto koniwaptan musi być badany w kontekście patofizjologicznych zdarzeń udaru. 6 Projektując to badanie, rozważaliśmy porównanie wyników leczenia przy użyciu dwóch różnych dróg podawania koniwaptanu: dożylnie (IV)4 i dootrzewnowo (IP). 7 Oceniano wpływ leczenia na obrzęk mózgu wywołany udarem. Opisano tu szczegółowe protokoły chirurgicznej indukcji eksperymentalnego udaru mózgu przez niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO), a następnie ciągłego leczenia koniwaptanem z wykorzystaniem instalacji cewnika dożylnego szyjnego. Po indukcji udaru mózgu zwierzęta zostały losowo przydzielone do następujących grup: podłoże lub koniwaptan (0,2 mg/dobę) leczone dożylnie lub IP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szwedzkiego Centrum Medycznego. Wszystkie zabiegi zostały wykonane z zachowaniem odpowiednich technik aseptycznych. Zwierzętami doświadczalnymi wykorzystanymi do badania były 3-miesięczne samce dzikich myszy typu C57 o masie ciała od 25 do 27 g.

1. Indukcja udaru in vivo

  1. Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć włókno żywicą dentystyczną.
    1. Wytnij kawałek filamentu o długości 12 mm z nylonowego szwu 7-0. Wymieszaj 2 części żywicy z 1 częścią utwardzacza, a następnie natychmiast zanurz końcówkę filamentu w mieszance, aby pokryć około 1/3 całej długości. Usuń go szybko i sprawdź, czy jest pokryty gładką warstwą żywicy dentystycznej.
    2. Suszyć filament na powietrzu przez 2 godziny przed użyciem.
  2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia (objętość 2 l) i ustaw przepływ 1,5% izofluranu w 25% wzbogaconym w tlen powietrzu w pomieszczeniu na 2 l/min wpływający do komory.
  3. Pozwól myszy pozostać w komorze indukcyjnej do czasu całkowitego znieczulenia,8 zgodnie z brakiem reakcji na uszczypnięcie ogona.
  4. Umieść mysz na stole operacyjnym z podgrzewaną podkładką i ustaw stężenie izofluranu na 1% w celu podtrzymania znieczulenia podawanego spontanicznie przez stożek nosowy.
  5. Przypnij włosy z przodu i z tyłu szyi i spryskaj szyję alkoholem. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oba oczy.
  6. Aby stale monitorować temperaturę ciała, podczas operacji należy używać sondy temperatury w odbycie podłączonej do wyświetlacza cyfrowego.
  7. Umieść mysz w pozycji leżącej, nałóż 10% roztwór do peelingu z jodonem powidonu do dezynfekcji, przykryj sterylną serwetą, a następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż szyi za pomocą chirurgicznego ostrza skalpela w rozmiarze 10.
  8. Tymczasowo podwiązać lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA) za pomocą szwu jedwabnego 6,0.
  9. Umieść kolejną opaskę na lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA).
  10. Umieść klips mikronaczyniowy na tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA).
  11. Wytnij mały otwór na tętnicy szyjnej zewnętrznej nożyczkami mikronaczyniowymi. Włóż filament wykonany z nylonowego szwu 7-0 pokrytego żywicą dentystyczną do otworu w ECA i przesuwaj go głowo, jednocześnie wyjmując klips, aż do wyczucia oporu (około 5-7 mm od punktu rozwidlenia CCA).
  12. Umieść tymczasowe wiązanie na tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zabezpieczyć włókno na miejscu. Patrz schemat, rysunek 1A. Zamknąć skórę jedwabnym szwem i naciekać ranę z przodu szyi 0,2 ml 0,5% bupiwakainy, jak w kroku 2.6.
  13. Pozwól myszy obudzić się ze znieczulenia i odzyskać przytomność w komorze regeneracyjnej przez 60 minut. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
  14. Przetestuj mysz pod kątem oceny deficytu neurologicznego (NDS) w następujący sposób: 0 = normalna funkcja motoryczna, 1 = zgięcie tułowia i przeciwległej kończyny przedniej przy uniesieniu ogonowym, 2 = krążenie w stronę przeciwległą, ale normalna postawa w spoczynku, 3 = pochylanie się na przeciwległą stronę w spoczynku, 4 = brak spontanicznej aktywności motorycznej. 4,9 pkt.
    1. W celu przeprowadzenia testu NDS podnieś mysz za ogon i umieść ją na płaskiej powierzchni do obserwacji (2-3 min). Alternatywnie, obserwuj myszy w komorze regeneracyjnej. Wyklucz z eksperymentu myszy, które wykazują NDS niższy niż 2 z powodu niewystarczającej okluzji MCA.
      Uwaga: Technika laserowej przepływomierza dopplerowskiego może być użyta do potwierdzenia okluzji MCA. 9-11
  15. Ponownie znieczulić zwierzę po 60 minutach rekonwalescencji w komorze indukcyjnej, jak opisano powyżej, ponownie wysterylizować poprzednie nacięcie skóry 10% roztworem peelingu powidonowo-jodowego i ponownie otworzyć ranę chirurgiczną z przodu szyi, przecinając i usuwając szew jedwabny.
  16. Aby wyjąć filament z ECA, wykonaj następujące czynności:
    1. Umieść klips mikronaczyniowy na ICA. Rozwiąż szew na ICA i wyciągnij filament, trzymając otwarty klips.
    2. Zamknij klips i umieść krawat na ECA proksymalnie do nacięcia.
    3. Usuń klips i usuń ligaturę z CCA, aby przywrócić przepływ krwi do mózgu. Patrz schemat, rysunek 1B.

2. Instalacja cewnika dożylnego do żyły szyjnej w celu ciągłego leczenia trwającego 48 godzin

Uwaga: Przystąp do instalacji cewnika natychmiast po kroku 1.16.3 bez budzenia myszy.

  1. Używaj dwóch różnych rozmiarów elastycznych przewodów: włóż rurkę wewnętrzną (średnica zewnętrzna 0,94 mm; aby pomieścić podawany lek) do rurki zewnętrznej (średnica zewnętrzna 3,18 mm; w celu ochrony rurki wewnętrznej).
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej, nałóż 10% roztwór peelingujący z jodonem powidonu do dezynfekcji i wykonaj 1 cm nacięcie z tyłu szyi za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego w rozmiarze 10. Obróć mysz do pozycji leżącej, ponownie wysterylizuj przód szyi 10% roztworem peelingu jodowidonowego i ponownie otwórz ranę pooperacyjną z przodu szyi. Przedrążyć rurkę pod skórą od nacięcia wykonanego z tyłu do przodu szyi i wyprowadzić ją na zewnątrz od otwartej rany na 1 cm.
  3. Usuń podskórną tkankę tłuszczową z lewej strony przedniej części szyi około 1 cm w bok od linii środkowej. Zlokalizuj lewą żyłę szyjną, umieść dwie opaski wzdłuż żyły w odległości 5 mm od siebie i lekko rozciągnij żyłę. Zrób mały otwór w żyle szyjnej między dwoma wiązaniami za pomocą nożyczek mikronaczyniowych; Włóż końcówkę rurki wewnętrznej na głębokość 5 mm doogonowo (w kierunku serca).
  4. Przymocuj rurkę obiema opaskami do żyły szyjnej. Zamknij skórę z przodu szyi za pomocą jedwabnego szwu 3-0. Patrz schemat, rysunek 1C.
  5. Przymocuj rurkę do skóry z tyłu szyi za pomocą szwu i podłącz rurkę do pompy dożylnej do mikroinfuzji za pomocą krętlika. Krętlik umożliwia swobodne przemieszczanie się myszy wewnątrz klatki z pełnym dostępem do pokarmu i wody.
  6. Naciekać nacięcia skóry z przodu i z tyłu szyi za pomocą 0,2 ml 0,5% bupiwakainy, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.
    Uwaga: W zależności od instytucjonalnych protokołów dotyczących zwierząt, zwierzęta mogą być leczone opioidami, NLPZ lub antybiotykami przed i po operacji. Jednak wspomniane leczenie może zmienić wyniki leczenia niedokrwiennego udaru mózgu (patrz punkt Dyskusja). 11-14
  7. Pozwól zwierzęciu obudzić się w komorze rekonwalescencyjnej, a następnie umieść je w oddzielnej klatce do momentu zakończenia eksperymentu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
  8. Ustawić szybkość infuzji dla ciągłego, 48-godzinnego leczenia dożylnego koniwaptanem (0,14 mg/ml w 5% dekstrozie) lub podłożem na poziomie 1,5 ml/kg mc./godz.4 i rozpocząć infuzję.
    Uwaga: Całkowita ilość koniwaptanu podawanego dożylnie powinna wynosić około 0,2 mg/mysz/dobę w całkowitej objętości 1,44 ml.
    Uwaga: Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) koniwaptanu dwa razy na dobę w całkowitej ilości 0,2 mg w 1,44 ml 5% dekstrozy. Implementacja wstrzykiwania adresów IP była zgodna z wcześniejszym opisem. 15 Powstrzymaj myszy, chwytając skórę tylnej powierzchni ciała i ogona. Wstrzyknąć koniwaptan lub nośnik w lewą dolną ćwiartkę brzucha za pomocą igły 26 G/1/2 cala. 15
  9. Obserwuj zwierzęta dwa razy dziennie przez cały czas trwania eksperymentu (48 godzin). Zapewnij zwierzętom pełny dostęp do pożywienia i wody. Jeśli zwierzę wykazuje oznaki niepokoju lub duszności, skonsultuj się z weterynarzem. Jeśli eutanazja jest konieczna w przypadku zwierzęcia znajdującego się w ciężkim stanie, należy zapoznać się z krokiem 3.1 poniżej i wykluczyć zwierzę z badania.

3. Ocena obrzęku mózgu wywołanego udarem mózgu w punkcie końcowym

  1. Poświęć mysz poprzez nadmierne znieczulenie 5% izofluranem.
  2. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie skóry nad kością czaszki wzdłuż linii środkowej i cofnij skórę, aby odsłonić całą czaszkę nad mózgiem. Zaczynając od otworu wielkiego, przetnij kość czaszki bocznie wzdłuż obwodu mózgu po każdej stronie i podnieś ją ostrożnie, nie dotykając mózgu pod nią. Odetnij mózg od kręgosłupa i nerwy przyczepione do podstawy czaszki.
  3. Usuń mózg, oddziel go od opuszki węchowej i móżdżku, a następnie rozkrój mózg wzdłuż szczeliny międzypółkulowej na niedokrwienne i nieniedokrwienne półkule mózgowe, jak opisano wcześniej. 9
  4. Oceń obrzęk mózgu, porównując stosunek mokrej do suchej (WDR), jak opisano wcześniej4,9. Ważyć chusteczki przed i po suszeniu przez 3 dni w temperaturze 100 °C w suszarce. Obliczyć zawartość wody w mózgu (BWC) jako % H2O = (1 sucha masa / mokra waga) x 100%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Temperatura ciała zwierząt mieściła się w zakresie fizjologicznym i pozostawała stabilna przez cały czas trwania procedury chirurgicznej indukcji udaru. Dwie myszy, u których bezpośrednio po MCAO stwierdzono wartość NDS niższą niż 2, zostały wykluczone z badania.

Model MCAO u myszy powoduje powstanie objętości zawału w półkuli przeciwległej po 48 h. Ocena skrawków barwionych TTC wykazuje, że po MCAO zawał obejmuje około 50% półk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to ma ważną wartość dla przedklinicznych badań nad udarem mózgu. Badanie to ujawnia, że ciągły wlew dożylny koniwaptanu (0,2 mg / dobę) po eksperymentalnym udarze mózgu u myszy skutecznie zmniejsza obrzęk mózgu po 48 godzinach leczenia. Badano również wpływ wstrzyknięcia tej samej dawki koniwaptanu w IP, na obrzęk mózgu. Leczenie koniwaptanem zarówno drogą dożylną, jak i IP powoduje akwarezę u myszy, na co wskazują: 1) wzrost osmolalności osocza nieco powyżej poziomów fizjologicznych; oraz 2) zmniejszenie osmolal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Szwedzkiemu Centrum Medycznemu za udostępnienie funduszy i udogodnień. Dziękujemy również szpitalowi Craig Hospital za hojne wykorzystanie przestrzeni laboratoryjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podgrzewana podkładkaK& H Manufacturing Inc1060
Monitor temperatury z sondą doodbytnicząPhysitemp7029
Szpula do szwów jedwabnych, 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
Jedwabny szew na igle, 3-0Ethicon1684G
Szew nylonowy, 7-0Ethicon1696G
Żywica dentystyczna Polisiloksan z utwardzaczemHeraeus Kulzer65817930
Pompa dożylna do mikroinfuzjiKent ScietificGT0897
Krętlik 22GA RurkaInstech375/22PS
, 0,94 mm x 0,51 mmRurka laboratoryjna Dow Corning508-002
, 3,18 mm x 1,98 mmDow Corning508-009
laboratoryjna

Bibliografia

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podawanie koniwaptanuleczenie domięśniowezamknięcie tętnicy środkowej mózgukaniulacja żyły szyjnejocena obrzęku mózgumysi model udarudroga podania lekubloker receptorów V1a i V2poiskemiczny obrzęk mózgu
Ciągły wlew dożylny jest preferowaną drogą leczenia blokera receptora argininy-wazopresyny Koniwaptanu u myszy w celu zbadania obrzęku mózgu wywołanego udarem mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.