Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

19.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54176

⸱

22 lipca 2016

 ,  , 
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care, and Sleep Medicine, University of Miami, Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology, University of Miami, Miller School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli są trudne do transdukcji. Protokół ten opisuje produkcję lentiwirusów i ich koncentrację, a także optymalne warunki hodowli niezbędne do osiągnięcia wysoce wydajnych transdukcji w tych komórkach poprzez różnicowanie do pseudostratyfikowanego nabłonka.

Streszczenie

Hodowla in vitro pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) przy użyciu warunków granicy powietrze-ciecz dostarcza użytecznego modelu do badania procesów różnicowania i funkcjonowania komórek dróg oddechowych. W ciągu ostatnich kilku lat powszechną praktyką stało się stosowanie wektorów lentiwirusowych do dostarczania transgenów. Chociaż istnieją doniesienia o transdukcji w pełni zróżnicowanych komórek nabłonka dróg oddechowych z niektórymi lentiwirusami niebędącymi typami HIV, ogólna skuteczność transdukcji jest zwykle mniejsza niż 15%. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia niezawodną i wydajną metodę wytwarzania lentiwirusów i transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Wykorzystując niezróżnicowane komórki nabłonka oskrzeli, transdukcja w pożywce wzrostu nabłonka oskrzeli, podczas gdy komórki przyczepiają się, z wielokrotnością czynnika infekcji 4, zapewnia wydajność bliską 100%. Protokół ten opisuje krok po kroku przygotowanie i stężenie wektorów lentiwirusowych o wysokim mianie oraz proces transdukcji. Omówiono w nim eksperymenty, które określiły optymalne warunki hodowli w celu uzyskania wysoce wydajnych transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli.

Wprowadzenie

Rozwój wadliwych replikacyjnie, pseudotypowanych lentiwirusów (LV) dostarczył badaczom bezpiecznej i efektywnej metody dostarczania transgenów in vitro 1. Ze względu na ich długotrwałą ekspresję, te LV mogą być również wykorzystywane do dostarczania środków terapeutycznych in vivo 2,3. Wytwarzanie LV wymaga kotransfekcji ludzkich embrionalnych komórek nerki (HEK) z kilkoma plazmidami: wektorem transferowym, opakowaniem GAG/POL, opakowaniem rev i plazmidami glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G). Systemy pakowania trzeciej generacji są uważane za bezpieczniejsze niż systemy drugiej generacji, ponieważ gen rev jest kodowany na oddzielnym plazmidzie pakującym, co zmniejsza możliwość rekombinacji w celu wytworzenia lentiwirusa kompetentnego do replikacji. Chociaż systemy pakowania drugiej generacji dają pięciokrotnie wyższe całkowite jednostki transdukcji, podział oryginalnego genomu wirusa w celu stworzenia systemu trzeciej generacji zmniejszył poziom transdukcji tylko minimalnie 3,4.

Podczas gdy linie komórkowe mogą być łatwiej i skuteczniej transdukowane, badacze skupili się na komórkach pierwotnych, ponieważ są one bardziej reprezentatywne dla tkanek in vivo 5,6. Jednak komórki pierwotne są oporne na transdukcję. Chociaż donoszono o transdukcji w pełni zróżnicowanych komórek nabłonka dróg oddechowych, ogólna skuteczność nie przekroczyła 15% 7.

Opisany tutaj jest protokół, który pozwala na produkcję LV o wysokim mianie. Przedstawiono podejście krok po kroku w celu osiągnięcia prawie 100% skuteczności transdukcji do pierwotnych komórek HBE. Dokładniej rzecz ujmując, w protokole opisano optymalne warunki hodowli, które mają zasadnicze znaczenie dla powodzenia 3. Krótko mówiąc, komórki HEK 293T są transfekowane przy użyciu lentiwirusowego wektora ekspresyjnego pCDH z promotorem EF-1 napędzającym ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) lub mCherry, białka czerwonej fluorescencji i systemu pakowania trzeciej generacji. Wnioski o niskiej wartości uwalniane do pożywek są zbierane od 24 do 72 godzin później. Cząsteczki wirusa są zagęszczane za pomocą glikolu polietylenowego (PEG), wygodnej i łatwej metody zagęszczania wirusa, przed oszacowaniem miana przy użyciu zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA) antygenu p24. Następnie niezróżnicowane pierwotne komórki HBE są transdukowane w pożywce proliferacyjnej (pożywka do wzrostu nabłonka oskrzeli lub BEGM) 8, podczas przyłączania (po trypsynizacji) przy współczynniku wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącym 4, dodając bromek heksadimetryny i inkubując przez 16 godzin (przez noc). Komórki mogą się następnie różnicować. Ponieważ transgen wirusowy ulega długotrwałej ekspresji (przy użyciu odpowiedniego promotora, patrz dyskusja), ekspresja będzie utrzymywana przez cały okres różnicowania w pseudostratyfikowany nabłonek dróg oddechowych lub może być indukowana (przy użyciu indukowalnego promotora) po różnicowaniu.

Ten protokół jest bardzo interesujący dla badaczy, którzy chcą używać pierwotnych komórek HBE zamiast linii komórkowych, i może być dostosowany do innych trudnych do transdukcji typów komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Etap 1: Kultura HEK 293T

  1. Przygotować pożywkę z komórek HEK (określaną jako pożywka HEK), dodając 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) o wysokim poziomie glukozy.
  2. Posmaruj jedno 10 cm naczynie do hodowli tkankowych kolagenem I. Wymieszaj 30 μl kolagenu I w 2 ml wody destylowanej. Rozprowadzić mieszankę na szalce i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Wyjmij mieszankę i pozostaw naczynie do wyschnięcia w komorze z przepływem laminarnym na 15 minut.
  4. Umieścić komórki HEK na pokrytym naczyniu o gęstości 1 x 106 komórek w 10 ml pożywki HEK i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Gdy komórki HEK zlewają się w 50-60% (ryc. 1a, 2-3 dni po posiewie, przejdź do etapu 2. Wizualna ocena zbiegania jest wystarczająca. Kwantyfikacja nie jest wymagana.
    Uwaga: Komórki HEK są hodowane w pożywkach HEK (patrz wyżej). Gdy osiągną zbieg, można je rozłupać (np. 1/5) lub zamrozić do późniejszego wykorzystania.

2. Etap 2: Produkcja i koncentracja lentiwirusów (LV) w komórkach HEK

Uwaga: Protokoły powinny być wykonywane zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi w warunkach BSL-2+ (enhanced BSL-2) w USA.

  1. Transfekcja przy użyciu procedury wytrącania wapnia (lipofektamina i inne środki do transfekcji nie były tak skuteczne jak procedura wytrącania wapnia). W celu zapewnienia odtwarzalności zaleca się użycie komercyjnego zestawu do transfekcji, chociaż procedura jest modyfikowana w następujący sposób. Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. To jest dzień 0.
  2. Na każde 10 cm naczynie komórek HEK293 wymieszaj 4,5 μ5 μg otoczki DNA pMD2-VSVG, 7,5 μg opakowania DNA pMDLg/pRRE, 3,75 μg DNA pRSV-rev, 10 μg DNA lentiwirusowego wektora ekspresyjnego, 86 μl 2 M roztworu wapnia i sterylnej wody w 15 ml probówce wirówkowej do końcowej objętości 700 μl (te dwa ostatnie roztwory znajdują się w komercyjnym zestawie do transfekcji).
  3. Kroplami dodaj 700 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (HBS, dostarczanej w zestawie do transfekcji) podczas wirowania (w komorze laminarnej) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut (wykonaj krok 4 podczas oczekiwania).
  4. We wczesnym okresie inkubacji umieścić 5 μl mieszanki na szkiełku. Sprawdź kroplę pod mikroskopem z obiektywem 10X, powoli ustawiając ostrość w górę iw dół. Powinien być widoczny drobny osad, potwierdzający proces wytrącania fosforanu wapnia (ryc. 1b).
  5. Zatrzymaj wytrącanie po 30 minutach, dodając 10 ml pożywki z komórek HEK i pipetując w górę iw dół, aby wymieszać.
  6. Weź szalkę z komórkami HEK z kroku 2.1-2.5 i usuń pożywkę (dzień 0). Ostrożnie i powoli dodaj roztwór osadu z kroku 2.5 wzdłuż krawędzi naczynia.
  7. Następnego dnia (dzień 1) usunąć i wyrzucić pożywkę zawierającą osad i zastąpić ją 10 ml pożywki HEK. Sprawdzić, czy pod mikroskopem nie ma drobnego osadu: powinien on być widoczny w naczyniu w pustych przestrzeniach między komórkami (ryc. 1c i d).
  8. W 2 dniu zebrać pożywkę za pomocą strzykawki, przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 μm do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 3,8 ml 40% roztworu glikolu polietylenowego (PEG). Odwrócić 5 razy, aby wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny (aby wytrącił się osad PEG, ale nie dłużej niż 5 dni), aż wszystkie zbiory wirusa zostaną zakończone.
  9. Powtórz krok 2.8 w dniach 3 i 4. W dniu 4 nie zastępuj go pożywką HEK, ale odkaż 10% wybielaczem i wyrzuć naczynie.
  10. Odwirować wszystkie probówki zbiorcze (zwykle wszystkie grupy razem w dniu 5) przy 1 650 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wirusa. Usunąć i wyrzucić supernatant i ponownie wirować w temperaturze 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania i usunięcia wszelkich pozostałości supernatantu PEG.
  11. Zawiesić osad z każdej probówki w 200 μl pożywki do wzrostu nabłonka oskrzeli (BEGM) bez amfoterycyny B 8. Połączyć je razem i podzielić na porcje w ilości 200 μl. Wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Podać dodatkowe 10 μl w celu przeprowadzenia testu ELISA na obecność antygenu HIV-1 Gag (p24).
  12. Korzystając z dostępnego w handlu zestawu ELISA, wykonaj test antygenu p24 zgodnie z protokołem producenta. Test daje oszacowanie wirusa p24 w pg/ml.

3. Etap 3: Hodowla pierwotnych komórek HBE

  1. Umieścić komórki HBE w 10 ml pożywce BEGM (ze 100 μl amfoterycyny B, jeśli stosuje się pasaż 0 komórek w celu wyeliminowania ewentualnego zanieczyszczenia grzybiczego) o gęstości 1 x 106 komórek w pokrytym kolagenem I naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Następnego dnia usunąć pożywkę i zastąpić ją 10 ml BEGM (ze 100 μl amfoterycyny B dla pasażu 0 komórek) w sumie przez 4 dni. Wróć do inkubatora.
  3. Po 4 dniach należy stosować wyłącznie BEGM bez amfoterycyny B. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
  4. Gdy komórki są zlewane w 80-90% (ryc. 2a; ~ 7 dni po posiewie), przystąp do transdukcji (zwróć uwagę na 3,5 w celu przygotowania przed transdukcją). Ponownie, wizualna ocena zbiegu jest wystarczająca. Nie jest wymagana żadna kwantyfikacja.
  5. Przed transdukcją należy pokryć przepuszczalne wkładki nośne roztworem kolagenu dożylnym rozcieńczonym w stosunku 1/10 sterylną wodą destylowaną. Dodać 200 μl do każdej wkładki i pozostawić do wyschnięcia na noc w komorze z przepływem laminarnym.

4. Etap 4: Transdukcja komórek HBE

  1. Usunąć pożywkę, dodać 3 ml 0,1% trypsyny do 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (EDTA/PBS) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sprawdź pod mikroskopem (obiektyw 10X), czy wszystkie komórki są odłączone. Jeśli nie, wróć do inkubatora na dodatkowe 5 minut.
  2. Po odłączeniu wszystkich komórek dodać 3 ml inhibitora trypsyny sojowej (SBTI 1 mg/ml), wymieszać i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Granulować komórki, wirując z prędkością 460 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml BEGM i przystąpić do liczenia.
  4. Ponownie zawiesić komórki HBE (teraz przejście 1 lub P1) w stosunku 2 x 105 komórek na jedną 12 mm przepuszczalną wkładkę nośną w 400 μl BEGM (patrz tabela 2). Ekstrapoluj te liczby na podstawie ilości przepuszczalnych wkładek podporowych, które zostaną przetransportowane.
PowierzchniapowierzchniaLiczba komórekmediaObjętość (nośnik)
Naczynie 10 cm52,7 cm21 x 106BEGM (Organizacja Zarządzania RybamiPojemność 10 ml
Filtr 12 mm1,13 cm22 x 105BEGM (Organizacja Zarządzania Rybami400 μl
Filtr 24 mm4,52 cm28 x 105BEGM (Organizacja Zarządzania Rybami800 μl

Tabela 2: Ekstrapolacja mediów na liczbę komórek.

  1. Stosując współczynnik wielokrotności infekcji (MOI) wynoszący 4, dodaj odpowiednią objętość wirusa do zawiesiny komórki.
  2. Dodać bromek heksadimetryny do końcowego stężenia 2 μg/ml.
  3. Dozować 400 μl mieszaniny (BEGM, komórki HBE, wirus i bromek heksadimetryny) na przepuszczalną wkładkę podporową do komory wierzchołkowej i dodać 1 ml samego BEGM do komory podstawno-bocznej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zawsze umieszczaj komórki HBE bez wirusa jako kontroli i przetestuj wybór puromycyny, jeśli ma to zastosowanie.
  4. Następnego dnia usuń pożywkę wierzchołkową i podstawno-boczną, przemyj PBS i zastąp obie komory mediami na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) 8.
  5. Kiedy komórki zlewają się, usuń płyn wierzchołkowy (znany jako ustanowienie granicy faz powietrze-ciecz). Kontynuuj wymianę pożywki (ALI) w dolnej komorze co drugi dzień, aż osiągną pełną dojrzałość; zwykle 3 do 4 tygodni później.
    Uwaga: Jeśli wektor lentiwirusowy zawiera gen selekcyjny, taki jak puromycyna, komórki można wybrać, dodając puromycynę zgodnie z krzywą stężenia selekcyjnego. W przypadku komórek HBE stężenie 1 μg/ml zostało określone jako idealne do konsekwentnej selekcji transdukowanych komórek. Jednak stężenie to może się różnić dla innych komórek lub warunków i powinno być określone za pomocą krzywych zabijania. Dodawanie puromycyny można rozpocząć już jeden dzień po zastąpieniu pożywki pożywką ALI lub później (2-3 dni), aby umożliwić pełną ekspresję genu selekcyjnego. Pamiętaj, aby dodać puromycynę do jednej wkładki, która nie została wyprodukowana. Puromycynę można dodawać do momentu, aż komórki zostaną w pełni zróżnicowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia kluczowe etapy oceny komórek i roztworów podczas procesu transfekcji. Rysunek 1a pokazuje optymalną konfluencję komórek HEK293T przed transfekcją w celu produkcji wirusa. Ważne jest, aby komórki były rozmieszczone równomiernie na całej powierzchni naczynia. Rysunek 1b ukazuje osad w kropli mieszaniny do transfekcji przy użyciu optyki w jasnym polu i obiektywu 10X. Im bardziej osad przypomina ziarna piasku niż aglomer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia blisko 100% wydajność transdukcji. Istnieją jednak kroki w trakcie procesu, które są ważne, aby osiągnąć ten cel. Na przykład, podczas procesu transfekcji, obecność osadów w mieszaninie transdukcyjnej (kropla) lub w naczyniu następnego dnia po transdukcji (rysunki 1b i d) są istotne dla dobrej transfekcji. Brak osadu lub obecność aglomeratów może być spowodowana pominięciem jednego z odczynników do transfekcji, problemem z pH lub złym preparatem plaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Life Alliance Organ Recovery Agency Uniwersytetu w Miami za dostarczenie płuc. Dziękujemy również dr Lisie Künzi za preparat DNA użyty w eksperymentach pokazanych na rycinie 2B i 3-D, dr Ben Gerovac i Lisie Novak za wirusa mCherry użytego w eksperymentach na rysunkach od 3A do C. Dziękujemy również Gabrielowi Gaidoshowi z zakładu obrazowania na Wydziale Okulistyki Uniwersytetu w Miami.

To badanie było sponsorowane przez granty z NIH, Fundacji CF i Flight Attendant Medical Research Institute dla dr Matthiasa Salathe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HEK293T/17 komórekATCCCRL-11268
Surowica bydlęca płodu (FBS) Sigma12306Cstosować w 10%
DMEMThermo Scientific11995-040
Penicylina/Streptomycyna (100x)Thermo Scientific15140-122stosować przy 1x
Collagen IBD Biosciences354231rozcieńczyć 1:75 w wodzie destylowanej
CalphosClontech631312Zestaw do transfekcji zawierający 2 M roztwór wapnia, 2x roztwór buforowany przez HEPES (HBS) i sterylny glikol polietylenowy H2O
8000VWR scientific101108-210zapas 40%
amfoterycyny BSigmaA9528do stosowania przy 1x
TrypsinSigmaT4799
Inhibitor trypsyny sojowejSigmaT9128
Transwell 12 mmCorning3460
Collagen IVSigmaC7521rozcieńczyć 1:10 w wodzie destylowanej
Bromek heksadimetrynySigmaH9268zapas 2 mg / ml
Puromycyna (10.000x)Thermo ScientificA11138-03stosować przy 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISAPerkinElmerNEK050001KT
F12Thermo Scientific11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-PuroSystem BiosciencesCD532A-2lentiwirusowy wektor ekspresyjny
pMD2-VSVGOpakowanie Addgene12259DNA
pMDLg/pRREOpakowanie Addgene12251Opakowanie DNA
pRSV-revAddgene12253opakowanie DNA

Bibliografia

  1. Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
  2. Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
  3. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
  4. Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
  5. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
  6. Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
  7. Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
  8. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
  9. Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
  10. Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
  11. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
  12. Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
  13. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
  14. Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
  15. Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
  16. Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
  17. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
  18. Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
  19. Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
  20. Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
  21. Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
  22. Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
  23. Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wydajność transdukcjiwielokrotność infekcjigranica faz powietrze-ciecztransfekcja HEK293wytrącanie fosforanu wapniakoncentracja wirusawytrącanie PEGpożywka do wzrostu nabłonka oskrzeli
Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.