Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda uzyskiwania odróżnicowanych komórek tłuszczowych

DOI:

10.3791/54177

⸱

15 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmodyfikowaliśmy warunki generowania komórek DFAT i podajemy tutaj informacje dotyczące użycia ulepszonej pożywki do produkcji tych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa i terapia komórkowa są bardzo obiecujące klinicznie. W związku z tym komórki multipotencjalne, takie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), mogą być w niedalekiej przyszłości wykorzystywane terapeutycznie do przywracania funkcji uszkodzonych narządów. Niemniej jednak kilka problemów technicznych, w tym wysoce inwazyjna procedura izolacji MSC i nieskuteczność związana z ich amplifikacją, utrudnia obecnie potencjalne zastosowanie kliniczne tych metod terapeutycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy wysoce wydajną metodę generowania odróżnicowanych komórek tłuszczowych (DFAT), komórek podobnych do MSC. Co ciekawe, komórki DFAT można różnicować w kilka typów komórek, w tym komórki adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Chociaż inne grupy już wcześniej prezentowały różne metody generowania komórek DFAT z dojrzałej tkanki tłuszczowej, nasza metoda pozwala nam produkować komórki DFAT bardziej efektywnie. W związku z tym wykazujemy, że pożywka hodowlana DFAT (DCM), uzupełniona 20% FBS, jest bardziej efektywna w generowaniu komórek DFAT niż DMEM, uzupełniona 20% FBS. Dodatkowo, komórki DFAT wytworzone naszą metodą hodowli komórkowej mogą być ponownie różnicowane w kilka typów tkanek. W związku z tym przedstawiono bardzo interesujący i użyteczny model do badania dedyferencjacji tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkowa i inżynieria tkankowa to gorące tematy w dziedzinie medycyny regeneracyjnej1-5. Chociaż te metody terapeutyczne są bardzo obiecujące, kilka problemów technicznych utrudnia obecnie ich kliniczne zastosowanie. W związku z tym, podobnie jak w przypadku wytwarzania komórek iPS, wszystkie terapie inżynierii tkankowej muszą wytwarzać komórki wolne od zewnętrznych transdukcji genów, aby zapewnić bezpieczeństwo pacjenta. W związku z tym byliśmy pierwszą grupą, której udało się wyprodukować ludzkie komórki DFAT6. Od tego czasu kilka innych grup badawczych przyjęło naszą metodę generowania komórek DFAT pochodzenia ssaków7-9, co jeszcze bardziej podkreśla przydatność naszego modelu.

W trakcie kilku badań stwierdziliśmy, że jakość środowiska hodowli komórkowej może być modyfikowana poprzez dostosowanie zawartości pożywki komórkowej. Odkrycie to doprowadziło do zwiększenia wskaźnika sukcesu produkcji komórek DFAT i poprawy jakości komórek; oba te czynniki mają kluczowe znaczenie dla wydajnego generowania komórek do przyszłych badań klinicznych. W związku z tym opracowano ulepszoną pożywkę hodowlaną DFAT (DCM, pożywka podobna do pożywki z mezenchymalnych komórek macierzystych, która zawiera rekombinowaną insulinę ludzką, albuminę surowicy, kwas L-glutaminowy, kilka kwasów tłuszczowych i cholesterol) oraz metodę generowania i proliferacji komórek DFAT (więcej informacji na temat zawartości DCM można uzyskać na żądanie). Za pomocą tej metody uzyskano wysokiej jakości komórki DFAT ze zdolnością różnicowania się w kilka typów komórek, w tym komórki adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Ogólnie rzecz biorąc, ten zwalidowany protokół hodowli komórkowej poprawia jakość komórek DFAT i może być bardzo przydatny do ulepszania klinicznych zastosowań terapii komórkowej i inżynierii tkankowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki ludzkiego tłuszczu podskórnego uzyskano od pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym na Wydziale Chirurgii Plastycznej, Urologii, Chirurgii Dziecięcej i Chirurgii Ortopedycznej Szpitala Uniwersyteckiego Itabashi Nihon (Tokio, Japonia). Pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę, a Komisja Etyki Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nihon zatwierdziła badanie.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Przynieś próbkę tkanki z sali operacyjnej do laboratorium.
  2. Przemyć 1-2 g tkanki tłuszczowej 5 ml PBS(-) w temperaturze pokojowej (RT) jeden raz w probówce o pojemności 50 ml, a następnie umieścić próbkę w plastikowym naczyniu o średnicy 10 cm.

2. Trawienie kolagenazy

  1. Usunąć próbkę z PBS(-), a następnie dodać 10 ml sterylnego 0,1% (m/v) roztworu kolagenazy (kolagenazy typu II) do naczynia zawierającego próbkę tkanki.
  2. Tkankę mielić nożyczkami chirurgicznymi przez około 15 minut, aż osiągnie zmiksowaną konsystencję.
  3. Następnie trawić zmieloną tkankę w 0,1% (m/v) roztworze kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 30 minut (60 obr./min) w probówce o pojemności 50 ml, delikatnie mieszając na shakerze.
  4. Przefiltrować strawioną próbkę przez filtr 100 μm do probówki o pojemności 50 ml. Następnie przepuścić przez filtr 10 ml DCM (patrz Tabela Materiałów) uzupełnionego o 2% FBS.

3. Izolacja komórek

  1. Odwirować przefiltrowane komórki przy 100 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  2. W tym momencie należy przygotować 5 ml DCM uzupełnionego o 2% FBS w probówce o pojemności 50 ml.
  3. Następnie narysuj pływające komórki tłuszczowe za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i dodaj komórki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę.
  4. Następnie delikatnie wstrząsnąć probówką o pojemności 50 ml, aby wymieszać pożywkę DCM z komórkami.
  5. Następnie odwirować probówkę o sile 100 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić pożywkę znajdującą się na dnie probówki za pomocą igły 18 G i strzykawki o pojemności 20 ml.
  7. Następnie do pobranych komórek dodać 10 ml DCM uzupełnionego o 2% FBS.
  8. Wymieszać DCM z komórkami, delikatnie potrząsając probówką o pojemności 50 ml.
  9. Odwirować probówkę o sile 100 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.

4. Komórki poszycia

  1. Dodać 41 ml DCM lub DMEM uzupełnionego 20% FBS do kolby o średnicy 12,5 cm.
  2. Następnie za pomocą pipety o pojemności 200 μl dodaj 40 μl komórek tłuszczowych do kolby.
  3. Następnie napełnij kolbę DCM lub DMEM uzupełnionym 20% FBS. KROK KRYTYCZNY: W tym momencie upewnij się, że komórki są rozrzucone po całym podłożu. Sprawdzić wzrokowo oderwane komórki, a następnie trzymać kolbę na pokrywie okrągłej szalki Petriego, aby była płaska.
  4. Na koniec umieścić kolbę w inkubatorze i pozostawić ją w spokoju w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 7 dni.
  5. Po tygodniu inkubacji odwrócić kolbę i sprawdzić, czy nie ma komórek DFAT. Następnie oceń biegłość w generowaniu komórek DFAT zgodnie z opisem10, ponieważ w tym momencie komórki podobne do fibroblastów (komórki DFAT) znajdują się w regionach innych niż komórki tłuszczowe.
  6. Dodać 5 ml DCM lub DMEM uzupełnionego 20% FBS do kolby po usunięciu poprzedniej pożywki do hodowli komórkowych. Pozwól komórkom DFAT rosnąć przez kolejny tydzień po zmianie podłoża.
  7. Korzystając z licznika komórek, policz liczbę komórek DFAT wygenerowanych w różnych warunkach hodowli komórkowej (DCM vs. DMEM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu metoda i zestaw narzędzi do generowania komórek DFAT zostały ulepszone (Rysunek 1). Nasza metoda pozwala nam generować komórki DFAT przy użyciu zarówno pożywki DCM, jak i DMEM zawierającej 20% FBS (rysunek 2A). W związku z tym porównaliśmy wydajność DCM i DMEM w generowaniu ogniw DFAT. W związku z tym DCM zwiększył proliferację komórek DFAT trzykrotnie w porównaniu z DMEM, niezależnie od liczby adipocytów (Figura 2A i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dojrzałe adipocyty, które przechodzą dedyferencjację in vitro , proces znany jako hodowla sufitowa, mogą powrócić do bardziej prymitywnego fenotypu i uzyskać zdolności proliferacyjne. Komórki te są określane jako odróżnicowane komórki tłuszczowe (DFAT). Oceniono potencjał różnicowania wieloliniowego komórek DFAT. Analiza cytometrii przepływowej i analiza ekspresji genów wykazały, że komórki DFAT były wysoce jednorodne w porównaniu zASCs 6. W rzeczywistości profil antygenu powierzchniowego komórek DFAT...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Program Tworzenia Start-upów z Zaawansowanych Badań i Technologii (Program START) z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (ST261006IP, TM) oraz przez Program dla Fundacji Badań Strategicznych na Prywatnych Uniwersytetach (2014-2019) (S1411018, TM) z Ministerstwa Edukacji, Sportu, Nauki i Technologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CSTI303-MSC średnie CSTI87-671To podłoże jest zdefiniowane jako DCM w tekście
PBS(-)Wako166-23555Nie zawiera Mg2+ i Ca2+
DMEMGibco11965-092
Nożyczki
Kolagenaza typu IISigmaC-6885
Takasago Medical Industry Co., LtdTKZ-F2194-1
WytrząsarkaTAITECBioshaker V.BR-36
Filtr siatkowy Falcon Cell 100 μ m ŻółtyCORNING LIFE SCIENCES DL 352360
Sokół 12,5 cm² Prostokątna kolba do hodowli komórkowych z przechyloną szyjką i niebieską wentylowaną zakrętkąCORNING LIFE SCIENCES 
Igła 18 GNIPRO02-002
Strzykawka 20 ml NIPRO08-753
Licznik redlic serii ZBECKMAN COULTER383550
do płodu bydlęcego Sigma 172012 353107

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
  2. de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
  3. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
  4. Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
  5. Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
  6. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  7. Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).
  9. Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651(2015).
  10. Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
  11. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki DFATtrawienie kolagenazizolacja tkanekmetoda hodowli kom rkowejpod o e DCMr nicowanie adipogenner nicowanie osteogenner nicowanie chondrogenneproliferacja kom rek

Powiązane artykuły