Artykuł metodologiczny

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/54190

⸱

30 lipca 2016

 ,  ,  , 
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje metody monitorowania postępu przeprogramowania w czasie rzeczywistym poprzez pomiar kinetyczny dodatnich i ujemnych markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje również obrazową ocenę morfologii oraz ekspresję markera lub reportera podczas generowania iPSC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatyczne przeprogramowanie umożliwiło konwersję dorosłych komórek do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z różnych środowisk genetycznych i fenotypów chorobowych. Ostatnie postępy pozwoliły zidentyfikować bardziej efektywne i bezpieczne metody wprowadzania czynników przeprogramowujących. Istnieje jednak kilka narzędzi do monitorowania i śledzenia postępu przeprogramowywania. Obecne metody monitorowania przeprogramowania opierają się na jakościowej kontroli morfologii lub barwieniu barwnikami i przeciwciałami specyficznymi dla komórek macierzystych. Narzędzia do analizy progresji wytwarzania iPSC mogą pomóc w lepszym zrozumieniu procesu w różnych warunkach pochodzących z różnych źródeł komórkowych.

To badanie przedstawia kluczowe podejścia do kinetycznego pomiaru progresji przeprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej, jak również monitorowania w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania. Aby zmierzyć kinetykę przeprogramowania, przeprowadzono analizę przepływu w dyskretnych punktach czasowych przy użyciu przeciwciał przeciwko dodatnim i ujemnym markerom pluripotencjalnych komórek macierzystych. Połączenie wizualizacji w czasie rzeczywistym i analizy przepływu umożliwia ilościowe badanie przeprogramowania na różnych etapach i zapewnia dokładniejsze porównanie różnych systemów i metod. Analiza obrazu w czasie rzeczywistym została wykorzystana do ciągłego monitorowania fibroblastów podczas ich przeprogramowywania w systemie pożywki bez zasilania. Kinetykę powstawania kolonii mierzono na podstawie konfluencji w kanałach kontrastu fazowego lub fluorescencji po barwieniu żywym barwnikiem fosfatazy alkalicznej lub przeciwciałami przeciwko SSEA4 lub TRA-1-60. Wyniki wskazują, że pomiar konfluencji dostarcza półilościowych wskaźników do monitorowania postępu przeprogramowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące od pacjentów są obiecującymi narzędziami do terapii komórkowej i badań przesiewowych leków. Stanowią autologiczne źródło komórek do terapii. Ponadto obejmują one bardzo szeroki zestaw tła genetycznego, umożliwiając szczegółową analizę chorób genetycznych in vitro w zakresie wykraczającym poza to, co pozwoliłyby obecne linie embrionalnych komórek macierzystych (ESC). Ostatnie postępy doprowadziły do opracowania kilku metod generowania iPSC, w tym przeprogramowania za pomocą wirusa Sendai, plazmidów episomalnych lub mRNA 1,2. Warto zauważyć, że różne metody przeprogramowania wiążą się z różnymi poziomami wydajności i bezpieczeństwa oraz prawdopodobnie będą się różnić pod innymi względami, które wpływają na ich przydatność do różnych zastosowań. Ze względu na dostępność różnorodnych technologii przeprogramowywania ważne stało się opracowanie metod oceny procesu przeprogramowywania. Większość istniejących metod opiera się na jakościowej kontroli morfologii lub barwieniu barwnikami i przeciwciałami specyficznymi dla komórek macierzystych. Jedna z niedawno opracowanych metod wykorzystuje reportery fluorescencji lentiwirusowej, które są wrażliwe na miRNA specyficzne dla PSC lub zróżnicowane mRNA specyficzne dla komórek 3. Takie metody monitorowania ułatwiają wybór i optymalizację technik przeprogramowania dla różnych sytuacji. Na przykład CDy1 był używany jako sonda fluorescencyjna dla wczesnych iPSC w celu przeprogramowania modulatorów 4. Możliwość obserwowania i porównywania różnych eksperymentów związanych z przeprogramowywaniem ma również kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia samego procesu. Na przykład obecnie wiadomo, że niektóre typy komórek somatycznych są łatwiejsze do przeprogramowania niż inne5 i że komórki przechodzą przez stany pośrednie podczas przeprogramowania 6-8. Niestety, mechanizmy leżące u podstaw procesu przeprogramowania wciąż nie są do końca poznane, a co za tym idzie, dokładne różnice między metodami przeprogramowania również pozostają do zdefiniowania. W związku z tym metody monitorowania, oceny i porównywania zdarzeń związanych z przeprogramowaniem nadal mają kluczowe znaczenie dla dziedziny komórek macierzystych.

Metody opisane w tym protokole pozwalają na monitorowanie i ocenę procesu przeprogramowania oraz ilustrują, jak te techniki mogą być używane do porównywania różnych zestawów odczynników do przeprogramowywania. Pierwsze podejście polega na analizach cytometrii przepływowej z wykorzystaniem kombinacji przeciwciał przeciwko dodatnim i ujemnym markerom pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Drugie podejście łączy obrazowanie w czasie rzeczywistym i pomiar całkowitej konfluencji (procentowej powierzchni pokrytej przez komórki) i zbieżności sygnałów markerowych (procentowej powierzchni pokrytej sygnałami fluorescencyjnymi).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Przygotowanie roztworu i podłoża

  1. Macierz błony podstawnej (oczyszczona z guza Engelbreth-Holm-Swarm)
    1. Powoli rozmrażać matrycę błony podstawnej (5 ml) na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1:1 5 ml lodowatego, sterylnego podłoża DMEM/F-12 w sterylnej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dozować porcje do wstępnie schłodzonych, sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przed użyciem rozmrozić zamrożoną podwielokrotność matrycy błony podstawnej w stosunku 1:1 w temperaturze 4 °C. W momencie użycia należy następnie rozcieńczyć podwielokrotność 1:1 kolejne 50 razy lodowatym, sterylnym podłożem DMEM/F-12 do końcowego rozcieńczenia 1:100.
    4. Dodać odpowiednią ilość rozcieńczonego roztworu matrycy błony podstawnej w stosunku 1:100 do odpowiednich naczyń do hodowli tkankowych (TC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zazwyczaj użyć 3 ml rozcieńczonego roztworu matrycy błony podstawnej do pokrycia szalki TC o powierzchni 20cm2, pokryć wszystkie inne rodzaje szalek/płytek TC w proporcji 0,15 ml rozcieńczonej matrycy nacm2 powierzchni. Odessać pozostały roztwór przed dodaniem jakiejkolwiek pożywki hodowlanej i komórek.
  2. Pożywka fibroblastowa
    1. Rozmrozić 100 ml butelki kwalifikowanej przez ES płodowej surowicy bydlęcej (ES-FBS) w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Dodać 50 ml rozmrożonego ES-FBS i 5 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (1x) do 445 ml pożywki DMEM. Wysterylizuj połączone składniki przez filtr 0,22 μm i przechowuj pożywkę w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.
  3. iMEF Średni
    1. Butelkę ES-FBS o pojemności 100 ml rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Dodać 50 ml rozmrożonego FBS, 5 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (1x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu do 445 ml pożywki DMEM.
    3. Wysterylizuj połączone składniki przez filtr 0,22 μm i przechowuj pożywkę w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.
  4. Podstawowy roztwór czynnika wzrostu fibroblastów (b-FGF)
    1. Dodać 10 μl surowicy zastępczej do 990 μl D-PBS i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    2. Dodać 1 ml 1% (v/v) roztworu zastępczego surowicy do jednej fiolki z 10 μg liofilizowanego b-FGF. Dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    3. Porcję roztworu b-FGF podzielić na 200 μl porcji w probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu uzyskania potrzebnej przez okres do 4 tygodni.
  5. Pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)
    1. Rozmrozić przez noc 100 ml butelkę z preparatem Serum Replacement w temperaturze 4°C.
    2. Dodać 100 ml rozmrożonego zamiennika surowicy, 5 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (1x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu do 395 ml pożywki DMEM/F-12.
    3. Wysterylizuj połączone składniki przez filtr 0,22 μm i przechowuj pożywkę w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.
    4. W momencie użycia podgrzej pożywkę hPSC do temperatury 37 °C i uzupełnij 4 ng/ml bFGF.
  6. Podłoże kondycjonowane iMEF (CM)
    1. Dodać 18 ml 0,1% żelatyny do kolby hodowlanej T-175 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Usunąć 0,1% roztwór żelatyny po godzinie inkubacji. Dodać 9,1 x 106 mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF) w 45 ml pożywki iMEF i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    3. Po całonocnej inkubacji usunąć starą pożywkę iMEF i przemyć raz 25 ml D-PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odessać płuczkę z D-PBS i dodać 90 ml wstępnie podgrzanej pożywki hPSC, uzupełnionej 4 ng/ml bFGF. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C dokładnie przez 24 godziny.
    5. Po 24 godzinach inkubacji w asepcie usunąć pożywkę hPSC z kolby iMEF i wysterylizować przez filtr 0,22 μm. Porcjować do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i zamrażać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. iMEF CM może być przechowywany do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.
    6. Dodać kolejne 90 ml wstępnie podgrzanej pożywki hPSC uzupełnionej 4 ng/ml bFGF do kolby iMEF. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C dokładnie przez 24 godziny. Powtarzaj zbiór CM do 7 dni.
    7. W momencie użycia podgrzej iMEF-CM do 37 °C i uzupełnij 4 ng/ml bFGF.
  7. E8 Średni
    1. Rozmrozić 10 ml suplementu E8 w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Usunąć 10 ml podłoża podstawowego E8 i w asepcie dodać zawartość rozmrożonego suplementu E8 do pozostałego podłoża podstawowego. Dokładnie wymieszaj i wysterylizuj przez filtr 0,22 μm. Kompletną pożywkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
    3. W momencie użycia należy wstępnie podgrzać podwielokrotność użytego podłoża do temperatury pokojowej. Nie zaleca się wstępnego podgrzewania E8 Medium do 37 °C.
  8. Bufor sortowania komórek
    1. Przygotuj świeży bufor do sortowania tuż przed sortowaniem komórek, dodając roztwór EDTA (1 mM stężenie końcowe), bufor HEPES (25 mM stężenie końcowe), roztwór penicyliny/streptomycyny (100 jednostek/ml stężenie końcowe) i albuminę surowicy bydlęcej (1% stężenie końcowe) do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (bez wapnia i magnezu).
    2. Przed użyciem wysterylizuj bufor przez filtr 0,22 μm.
  9. Podłoże do odzyskiwania sortowania komórek
    1. Zmodyfikuj 50 ml pożywki fibroblastowej, dodając penicylinę/streptomycynę (100 jednostek/ml stężenie końcowe) i inhibitor skały Y-27632 (stężenie końcowe 10 μM). Podgrzej to podłoże do temperatury 37 °C przed wysiewem posortowanych komórek.

2. Przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pośrednictwem Sendai

  1. 24 godziny przed transdukcją wirusami Sendai należy zasiać fibroblasty o gęstości 2 × 105 komórek na studzienkę do pożądanych dołków 6-dołkowej płytki TC.
  2. Wykonaj transdukcję w dniu 0 w następujący sposób.
    1. Podgrzej 2 ml pożywki Fibroblast w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjąć jeden zestaw probówek z wirusem Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmrozić każdą probówkę pojedynczo, zanurzając najpierw dno probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 - 10 sekund, a następnie wyjąć probówkę z łaźni wodnej i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu krótko odwiruj probówkę i natychmiast umieść ją na lodzie.
    2. Stosować komercyjnie wirusy Sendai drugiej generacji, dodając odpowiednie objętości (zgodnie z Certyfikatem Autentyczności) dla każdej z probówek w celu uzyskania następującej wielokrotności infekcji (MOI) do 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża fibroblastowego na studzienkę, która ma być transdukowana w następujący sposób: KOS = 5 x 106 CIU, hc-Myc = 5 x 106 CIU, hKlf4 = 3 x 106 CIU .
    3. Dokładnie wymieszaj roztwór wirusa, delikatnie pipetując mieszaninę w górę i w dół. Wykonaj kolejny krok w ciągu 5 minut.
    4. Odessać pożywkę fibroblastów z dołka fibroblastów, które mają zostać przeprogramowane, i dodać 1 ml roztworu wirusa do każdej studzienki. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez noc.
  3. Po całonocnej inkubacji odessać pożywkę transdukcyjną i odpowiednio zutylizować starą pożywkę (10% roztwór wybielacza przez 30 minut). Zastąp 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej i kontynuuj hodowlę transdukowanych komórek.
  4. Hoduj komórki jeszcze przez 6 dni, zastępując starą pożywkę świeżą pożywką Fibroblastów co drugi dzień.
    Uwaga: Nie należy przechodzić przez przeprogramowane komórki do 7 dni po transdukcji.
  5. Dzień 6: Przygotowanie potraw do generacji iPSC
    1. W celu wytwarzania iPSC w zależności od podajnika, dodać 1,5 ml 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka na 6-dołkowej naczyniu do hodowli tkankowej (TC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Usunąć 0,1% roztwór żelatyny po 1 godzinie inkubacji. Dodać 3 x 105 mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF) do 2 ml pożywki iMEF na dołek i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    3. W celu wytworzenia iPSC niezależnego od źródła należy dodać 1,5 ml rozcieńczonej matrycy błony podstawnej (rozcieńczenie 1:100) do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (TC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  6. Siedem dni po transdukcji zbierz transdukowane fibroblasty i ponownie umieść je na przygotowanych wcześniej szalkach hodowlanych w celu wytworzenia kolonii iPSC.
    1. Odessać normalną pożywkę hodowlaną z fibroblastów i przemyć komórki raz 2 ml D-PBS.
    2. Odessać płyn do płukania D-PBS i dodać 0,5 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Gdy komórki się zaokrąglą, dodaj 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża fibroblastowego do każdej studzienki, aby zatrzymać trypsynizację. Usuń komórki z dołka, delikatnie pipetując pożywkę po powierzchni naczynia. Zawiesinę komórkową zebrać do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować komórki przy 200 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej.
    5. Policzyć komórki przy użyciu żądanej metody (hemocytometr lub automatyczny licznik komórek) i wysiać wstępnie przygotowane szalki hodowlane z 5 x 104 komórek w warunkach zależnych od karmienia i 1 x 105 komórek w warunkach niezależnych od karmienia, na studzienkę 6-dołkowej szalki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 inkubator przez noc.
    6. Po całonocnej inkubacji należy zmienić pożywkę na pożywkę hPSC, pożywkę E8 lub pożywkę kondycjonowaną iMEF, w zależności od zastosowania. Następnie codziennie wymieniaj starą pożywkę na świeżą.

3. Sendai Przeprogramowanie wtórnych fibroblastów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) BGO1v hOct4-GFP

  1. Wyprowadzić wtórne ludzkie fibroblasty z linii reporterowej hESC BG01v hOct4-GFP zgodnie z procedurą opisaną wcześniej 9.
  2. Dwa dni przed transdukcją płytkę BGO1v / hOG poprowadzi fibroblasty do dwóch dołków 6-dołkowej płytki o wymiarach 2 x 105 komórek na dołek, używając pożywki Fibrobblast.
    1. W dniu transdukcji podgrzej 2 ml pożywki fibroblastowej do temperatury 37 °C.
    2. Wyjmij jeden zestaw probówek Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C. Wyjąć fiolki z torebki i rozmrozić każdą probówkę pojedynczo, zanurzając najpierw dno probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 - 10 sekund, po czym pozostawić probówki do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu krótko odwiruj probówkę i natychmiast umieść ją na lodzie.
    3. Dodać wskazane objętości każdej z trzech probówek Sendai (patrz CoA dla odpowiedniej objętości) do 2 ml pożywki z fibroblastami, wstępnie ogrzanej do 37 °C i dokładnie wymieszać roztwór wirusa, pipetując w górę i w dół. Następny krok wykonaj w ciągu 5 minut.
      Uwaga: W tym eksperymencie wykorzystano MOI 5:5:6.
    4. Odessać pożywkę fibroblastów ze studzienek fibroblastów, które mają być transdukowane. Dodać 1 ml zawiesiny wirusa do każdej z dwóch studzienek, które mają być wydedukowane. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez noc.
    5. Po całonocnej inkubacji należy usunąć pożywkę transdukcyjną i odpowiednio ją zutylizować (10% roztwór wybielacza przez 30 minut). Zastąp każdą studzienkę 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża Fibroblastów i kontynuuj hodowlę transdukowanych komórek.
  3. Hoduj komórki przez kolejne 6 dni, zmieniając starą pożywkę na świeżą pożywkę Fibroblast co drugi dzień.
    1. Siedem dni po transdukcji zbierz transdukowane fibroblasty i ponownie umieść je na przygotowanych szalkach hodowlanych w celu wytworzenia kolonii iPSC.
    2. Odessać normalną pożywkę hodowlaną z fibroblastów i przemyć komórki raz 2 ml D-PBS.
    3. Odessać płyn do płukania D-PBS i dodać 0,5 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Gdy komórki się zaokrąglą, dodaj 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża fibroblastowego do każdej studzienki, aby zatrzymać trypsynizację. Usuń komórki z dołka, delikatnie pipetując pożywkę po powierzchni naczynia. Zawiesinę komórkową zebrać do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    5. Odwirować komórki przy 200 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej.
    6. Policz komórki za pomocą żądanej metody (hemocytometr lub automatyczny licznik komórek).
    7. Wysiewać transdukowane komórki o gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Po całonocnej inkubacji zmień pożywkę na pożywkę kondycjonowaną iMEF, uzupełnioną 10 ng/ml b-FGF. Następnie codziennie wymieniaj starą pożywkę na nową iMEF CM.
  5. Trzy tygodnie po transdukcji należy mechanicznie wypreparować i przenieść pożądane kolonie do ekspansji klonalnej lub wykorzystania do analizy.

4. Obrazowanie żywych komórek w przeprogramowaniu fibroblastów

  1. Monitorowanie w czasie rzeczywistym
    1. 7 dni po transdukcji za pomocą zestawu do przeprogramowania Sendai, wysiewaj żądaną ilość komórek na 6-dołkowe szalki z żądaną pożywką i systemami matrycowymi, jak opisano wcześniej. Umieść naczynia z nasionami w termowizorze, znajdującym się w nawilżanym inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 .
    2. Ustaw oprogramowanie do obrazowania tak, aby rejestrowało obrazy całej studzienki każdego pojedynczego dołka w ustalonych odstępach czasu (co 6 - 8 godzin) ciągłego przechwytywania obrazu przez następne 14 dni zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Ustawienia obrazu kontrastu fazowego są wybierane do normalnego przeprogramowania w celu oceny postępu kolonii. W przypadku przeprogramowania fibroblastów pochodzących z BG01v/hOG najlepiej jest rejestrować obrazy w kontraście fazowym i w zielonym kanale fluorescencyjnym, ponieważ reaktywacja endogennego reportera OCT4-GFP może być śledzona przez cały proces przeprogramowywania.
    3. Zmieniaj pożywkę codziennie, może to być pożywka hPSC, pożywka E8 lub iMEF-CM, w zależności od eksperymentu, jak opisano wcześniej od 8 do 21 dnia po transdukcji. Studzienki można dalej analizować pod kątem tworzenia kolonii za pomocą immunofluorescencji pośredniej.
    4. Pod koniec eksperymentu, w dniach od 19 do 21, należy usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, aby poddać ją przeciwciałom dla wybranych markerów fibroblastów i komórek macierzystych.
    5. Umyj każdą studzienkę raz 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża DMEM/F-12.
    6. Przygotować podwielokrotności każdej dodatniej/ujemnej pary przeciwciał pierwszorzędowych w 1 ml pożywki DMEM/F-12 w następujący sposób: anty-mysie SSEA4 (1:200) i anty-szczur CD44 (1:50), anty-mysie TRA-1-60 (1:200) i anty-szczur CD44 (1:50) oraz Alkaliczna fosfataza Live Stain (1:50) i anty-szczur CD44 (1:50). Dodać 1 ml roztworów przeciwciał pierwszorzędowych do każdego odpowiedniego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
    7. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć dwukrotnie wstępnie podgrzaną pożywką DMEM/F-12.
    8. Przygotować drugorzędowe roztwory przeciwciał (1 ml na każdą studzienkę) przy użyciu koziego anty-mysiego sprzężonego wtórnego Alexa Fluor 488 (1:500) dla zielonej fluorescencji i koziego anty-szczura Alexa Fluor 594 sprzężonego wtórnego (1:500) dla czerwonej fluorescencji w pożywce DMEM/F-12. Dodaj do każdego dołka po ostatnim umyciu. Inkubować przeciwciała drugorzędowe przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Ze względu na przejściowy sygnał żywego barwienia fosfatazy alkalicznej (APLS), pierwotna inkubacja anty-CD44 powinna być najpierw wykonana samodzielnie, a APLS powinien zostać dodany w czasie inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi
    9. Po inkubacji przeciwciał wtórnych odessać roztwór i dwukrotnie przemyć pożywką DMEM/F-12. Dodaj świeże, wstępnie podgrzane podłoże DMEM/F-12 do każdego dołka przed ostatecznym przechwyceniem obrazu.
    10. Ustaw oprogramowanie imagera tak, aby rejestrowało obrazy całej studzienki każdego dołka przy użyciu wszystkich trzech parametrów skanowania: kontrastu fazowego, fluorescencji zielonej i fluorescencji czerwonej. Twórz obrazy w różnych powiększeniach i twórz filmy poklatkowe za pomocą oprogramowania do monitorowania wzrostu i ekspresji markera. Korzystaj z protokołu producenta.
    11. Korzystając z oprogramowania analitycznego, oceń zbieg studni w czasie w kontraście fazowym i w jednostkach fluorescencyjnych na zielono do przeprogramowania BG01v/hOG.
  2. Monitorowanie produktów pośrednich przeprogramowywania za pomocą markerów powierzchni komórki
    1. Monitoruj zdarzenia przeprogramowywania w różnych punktach czasowych, sondując naczynia przeprogramowywania w różnych punktach czasowych za pomocą przeciwciał przeciwko różnym dodatnim/ujemnym markerom komórek macierzystych w celu monitorowania procesu przeprogramowywania. Hodowle sondowe należy przeprowadzać co 2 do 3 dni w zależności od dostępności kontrprób. Zbadaj przeprogramowane naczynia w dniach od 19 do 21, stosując strategię podwójnego barwienia, aby zidentyfikować w pełni przeprogramowane kolonie iPSC i częściowo przeprogramowane kolonie na podstawie wzorców barwienia.
    2. W pożądanym punkcie czasowym odessać normalną pożywkę wzrostową z każdej studzienki, która ma być sondowana przeciwciałami dla wybranych markerów.
    3. Umyj każdą studzienkę raz 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża DMEM/F-12.
    4. Przygotować podwielokrotności każdej dodatniej/ujemnej pary przeciwciał pierwszorzędowych w 1 ml pożywki DMEM/F-12 w następujący sposób: SSEA4 sprzężony z fluoroforem fluorescencyjnym zielonym (1:200), TRA-1-60 sprzężony z fluoroforem fluorescencyjnym zielonym (1:50), Alkaliczne żywe barwniki (1:500), CD24 sprzężone z fluoroforem fluorescencyjnym zielonym (1:50), B2M sprzężone z fluoroforem fluorescencyjnym zielonym (1:50), EpCAM sprzężony z fluoroforem fluorescencyjnym zielonym (1:50), mysz CD73 (1: 100), którą badano za pomocą drugorzędowego przeciwciała anty-mysiego sprzężonego z zielonym fluoroforem fluorescencyjnym (1: 500) i szczura CD44 (1: 50), który jest badany z przeciwciałem drugorzędowym anty-szczurzym sprzężonym z czerwonym fluoroforem fluorescencyjnym (1: 500). Dodać 1 ml roztworów przeciwciał pierwszorzędowych do każdego odpowiedniego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
    5. Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć dwukrotnie wstępnie podgrzanym podłożem DMEM/F12.
    6. W przypadku przeciwciał niesprzężonych należy zastosować metodę 2-etapową, przygotowując odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Potwierdzić, że przeciwciała drugorzędowe są skierowane do pierwotnych gospodarzy i nie wchodzą w reakcję krzyżową. Wykonaj dodatkowe kroki prania, jak opisano wcześniej.
    7. Po wszystkich odpowiednich myciach dodaj świeże, wstępnie ogrzane podłoże DMEM/F-12 do każdego dołka przed ostatecznym przechwyceniem obrazu.
    8. Uchwyć obrazy fluorescencyjne pod odpowiednim filtrem przy 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i przeanalizuj obrazy za pomocą dostępnego oprogramowania analitycznego.

5. Pomiar kinetyki przeprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Ilościowy pomiar kinetyczny przeprogramowania przy użyciu przeciwciał powierzchniowych komórki
    1. Przed przeprogramowaniem należy skonfigurować odpowiednią liczbę eksperymentów przeprogramowywania dla każdego punktu czasowego. W celu zmierzenia kinetyki przeprogramowania przez pierwsze 7 dni przeprogramowania, wykonywane są indywidualne transdukcje dla każdego żądanego punktu czasowego. W przypadku punktów czasowych po dniu 7 zasiej wystarczającą liczbę punktów czasowych niezależnych od zasilacza, aby kontynuować pomiar zdarzeń przeprogramowania. Pojedynczy dołek z 6-dołkowej płytki da wystarczającą ilość komórek do przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej.
    2. Zmierz wszystkie pożądane punkty czasowe przeprogramowania z poszczególnych dołków, ponieważ jest to test punktu końcowego. Odessać pożywkę Fibroblast z żądanej studzienki. Umyj raz za pomocą D-PBS.
    3. Odessać płuczkę D-PBS. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do studzienki, która ma być badana. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Po inkubacji należy rozdzielić komórki na pojedyncze komórki, spłukując zawiesinę komórek o objętości 1 ml z powierzchnią studzienki i przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Użyj 3 ml D-PBS, aby zmyć wszelkie pozostałe komórki z dołka i dodaj je do 15 ml stożkowego naczynia. Użyć 10 ml dodatkowego D-PBS w celu dalszego rozcieńczenia roztworu komórkowego w stożkowej probówce.
    5. Odwirować komórki przy 200 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki DMEM/F-12. W razie potrzeby wykonaj zliczanie komórek, aby utworzyć standardową zawiesinę komórek, która jest mniejsza niż 1 x 106 komórek/ml.
    6. Przygotować każdą podwielokrotność dodatnich/ujemnych przeciwciał bezpośrednio sprzężonych z wyboru w 1 ml pożywki DMEM/F-12 dla mniej 1 x 106 komórek/ml, stosując następujące kombinacje: SSEA4 sprzężony z zielonym fluoroforem fluorescencyjnym (1:200) z CD44 sprzężonym z PE-Cy5 lub CD44 sprzężony z zielonym fluoroforem fluorescencyjnym i SSEA4 sprzężony z fluoroforem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni. Inkubować przeciwciała z zawiesiną komórkową przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć dwukrotnie wstępnie podgrzaną pożywką DMEM/F-12.
    8. Odessać końcowe płukanie i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml D-PBS. Odpipetować zawartość każdej zawiesiny w oddzielnych probówkach FACS.
    9. Stosując odpowiednie kontrole ujemne (kontrole niebarwione i izotypowe), potwierdzić prawidłowy profil rozproszenia do przodu i po bokach oraz napięcia na cytometrze. Ustaw napięcia dla odpowiednich fluoroforów zgodnie z początkowymi parametrami pojedynczego barwienia, tak aby zielone fluorofory były aktywowane przez niebieski laser i sygnały odbierane w kanale BL1, podczas gdy fluorofor fluorescencyjny dalekiej czerwieni i fluorofor PE-Cy5 były aktywowane przez czerwony laser i sygnały uzyskane w kanale RL1. Zdobądź podwójnie splamioną populację dla każdego punktu czasowego.
    10. Przeanalizuj pliki FCS dla każdego punktu czasowego za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego i użyj edytora, aby uporządkować dane, aby zaobserwować zmianę wyrażenia populacji w czasie.
    11. Wykonaj kroki od 5.1.1 do 5.1.6, jeśli pożądane jest sortowanie komórek w różnych punktach czasu. Stosować odpowiednie kombinacje fluoroforów w zależności od konfiguracji lasera sortera komórek, który ma być używany.
    12. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml buforu do sortowania komórek. Skonfiguruj sortownik komórek do odpowiednich ustawień rozproszenia do przodu i z boku, korzystając z niebarwionej kontrolki. Użyj pojedynczych barwionych elementów sterujących, aby skonfigurować odpowiednie ustawienia dla każdego fluoroforu.
    13. Użyć małej próbki podwójnie barwionej zawiesiny komórek; wybrać 2 populacje do sortowania i przypisać odpowiedni ładunek, aby zapewnić prawidłowe pobranie posortowanych komórek.
    14. Dodać 200 μl pożywki do odzyskiwania komórek do probówek zbiorczych, aby upewnić się, że posortowana zawiesina komórek jest amortyzowana i chroniona w czasie sortowania. Zbierz żądaną liczbę komórek i przenieś na nowe szalki iMEF zawierające świeżo przygotowane podłoże do odzysku.
    15. Zmienić pożywkę po całonocnej inkubacji z pożywką regeneracyjną. Hodowle muszą być następnie karmione i rutynowo pasażowane przy użyciu pożywki hPSC zawierającej penicylinę/streptomycynę (100 jednostek/ml stężenia końcowego).

6. Analiza punktów końcowych

  1. Barwienie końcową fosfatazą alkaliczną (AP)
    1. Użyj końcowego chromogennego barwienia AP, aby skorelować obserwowane zdarzenia kinetyczne i morfologiczne z ostateczną wydajnością przeprogramowania.
    2. Po 21 dniach przeprogramowania wyjmij pożywkę hodowlaną z dołka, która ma być zabarwiona końcowym barwnikiem AP i przemyj raz 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
    3. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu barwiącego zgodnie z zaleceniami w instrukcji producenta w 200 mM Tris-HCl.
    4. Odessać popłuczynę i dodać 2 ml przygotowanego roztworu barwiącego do każdej studzienki. Inkubować przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej i z dala od światła.
    5. Odessać roztwór barwiący i przemyć raz 200 mM Tris HCl. Usuń płukanie i dodaj wodę destylowaną przed wizualizacją.
    6. Uchwyć sygnał kolorymetryczny za pomocą zwykłej kamery fotograficznej. Policz ręcznie liczbę dodatnio zabarwionych kolonii. Wizualizuj plamę za pomocą analizy fluorescencyjnej w kanale Trit-C, ponieważ plama ma również charakter fluorescencyjny i wykonaj obrazowanie całej studni i analizuj ją za pomocą imagera całej studzienki. Korzystaj z protokołu producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie kinetyki przeprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej

CD44 to marker fibroblastów, podczas gdy SSEA4 to marker PSC 6,10. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z tego wzorca ekspresji, cytometria przepływowa fibroblastów BJ wykazuje populację SSEA4-CD44 +, która ułatwia tworzenie bramek kwadrantowych w połączeniu z niebarwioną próbką. Podczas przeprogramowania fibrobla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to dostarcza strategii monitorowania i śledzenia procesu przeprogramowywania przy użyciu cytometrii przepływowej i analizy opartej na obrazowaniu w czasie rzeczywistym. Krytycznymi krokami w protokole są inicjowanie przeprogramowywania, mierzenie postępu przeprogramowywania w oparciu o ekspresję znaczników oraz monitorowanie przeprogramowania w czasie rzeczywistym. Można zastosować dowolną metodę przeprogramowania, ale tutaj skupiamy się na przeprogramowaniu ludzkich fibroblastów na podstawie Sendai. Zaletą tej m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy [RHQ, JSTA, KS i UL] są pracownikami firmy Thermo Fisher Scientific, która produkuje niektóre z odczynników i przyrządów użytych w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Chadowi MacArthurowi za pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAXSplement, pirogronianThermo Fisher Scientific10569-010
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana do embrionalnych komórek macierzystych, pochodzenie amerykańskieThermo Fisher Scientific16141-061
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Thermo Fisher Scientific11140-050
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa Thermo Fisher Scientific25300-054
Mysz (ICR) Inaktywowane fibroblasty embrionalneThermo Fisher ScientificA24903
Białko czynnika przyczepu (1x)Thermo Fisher ScientificS-006-100
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565-018
Zamiennik serum KnockOutThermo Fisher Scientific
2-merkaptoetanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
Kolagenaza, Typ IV, proszekThermo Fisher Scientific17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), bez fenolu czerwony Thermo Fisher Scientific12563-011
DPBS, bez wapnia, bez magnezu Thermo Fisher Scientific14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC, matryca membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostuThermo Fisher ScientificA1413302
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinowane białko ludzkieThermo Fisher ScientificPHG0264
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-020
Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)Thermo Fisher Scientific15260-037
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630-080
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
InSolution Y-27632EMD Milipore 688001
Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS SendaiThermo Fisher ScientificA1378001
Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS 2.0 SendaiThermo Fisher ScientificA16517
Automatyczny licznik komórek Countess IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Countess Prowadnice komory do liczenia komórekThermo Fisher ScientificC10228
BJ ATCC Ludzkie fibroblasty napletka, noworodkiATCCCRL-2522
DF1 Dorosły ludzki fibroblast skórnyThermo Fisher ScientificN/A
BG01V/hOG Wariant komórek hESC hOct4-GFP Komórki reporteroweThermo Fisher ScientificR7799-105
IncuCyte ZOOMEssen BioScience
Przeciwciało SSEA-4, koniugat Alexa Fluor 647 (MC813-70)Thermo Fisher ScientificSSEA421
Przeciwciało SSEA-4, koniugat Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70))PrzeciwciałoThermo Fisher ScientificA14810
SSEA-4 (MC813-70)Przeciwciało Thermo Fisher Scientific41-4000
TRA-1-60 (kl.A)Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 MAb anty-ludzka/mysia szczura (klon IM7), koniugat PE-Cy5Thermo Fisher ScientificA27094
CD44 Alexa Fluor 488 Zestaw sprzężony do obrazowania żywych komórekThermo Fisher ScientificA25528
CD44 MAb anty-ludzka/mysia szczura (klon IM7)Thermo Fisher ScientificRM-5700 (już niedostępny)
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific  A-11029
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific  A-11007
Fosfataza alkaliczna Live StainThermo Fisher ScientificA14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Zestaw koniugatów do obrazowania żywych komórekThermo Fisher ScientificA25618
CD24 Mysi anty-ludzki mAb (klon SN3), koniugat FITCThermo Fisher ScientificMHCD2401
przeciwciało mikroglobuliny beta-2, koniugat FITC (B2M-01)Thermo Fisher Przeciwciało ScientificA15737
EpCAM / CD326, koniugat FITC (VU-1D9)Przeciwciało Thermo Fisher ScientificA15755
CD73 / NT5E (7G2)Thermo Fisher Scientific41-0200
VECTOR Zestaw substratów czerwonej fosfatazy alkalicznej (AP)Vector LaboratoriesSK-5100
Mikroskop Zeiss Axio Observer.Z1 Carl Zeiss491912-0003-000
Oprogramowanie do analizy danych FlowJoFLOJO, LLCN/A
Attune Cytometr z akustycznym ogniskowaniem, niebiesko-czerwony laserThermo Fisher Zastosowanie naukoweAttune NXT 
S3e\ Sorter komórek (488/561 nm)BIO-RAD1451006
Falcon 12 x 75 mm Probówka z filtrem siatkowymCorning352235
Falcon 15 ml, o wysokiej przejrzystości, nakrętka z uszczelką kopułkowąCorning352097
Falcon T-75 KolbaCorning353136
Falcon T-175 KolbaCorning353112
Miska 6-dołkowa FalconCorning353046
Heraeus Inkubator rolkowy Heracell CO2Thermo Fisher Scientific51013669
Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofuge, 1,5 mlAM12450
Mieszalnik15920D
10828010 próbek HulaMixer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834(2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419(2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728(2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

iPSC GenerationFlow CytometryReal Time ImagingCell Surface MarkersReprogramming KineticsFibroblast ReprogrammingConfluence MeasurementAntibody StainingLive Cell Imaging

Powiązane artykuły