Artykuł metodologiczny

Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

DOI:

10.3791/54207

⸱

22 lipca 2016

 ,  ,  , 
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pull-down RNA jest tutaj zoptymalizowany do wykrywania interakcji między białkami wiążącymi RNA (RBP) a niekodującymi i kodującymi RNA. Fragment RNA z receptora androgenowego (AR) został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego RBP z listanu pierwotnych brązowych adipocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka wiążące RNA (RBP) pojawiają się jako warstwa regulacyjna w rozwoju i funkcji tkanki tłuszczowej. RBP odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym, wpływając na stabilność i wydajność translacyjną docelowych mRNA. Technika ściągania RNA jest szeroko stosowana do badania interakcji RNA-białko, która jest niezbędna do wyjaśnienia mechanizmu leżącego u podstaw funkcji RBP, a także długich niekodujących RNA (lncRNA). Jednak wysoka obfitość lipidów w adipocytach stanowi wyzwanie techniczne w przeprowadzeniu tego eksperymentu. Tutaj szczegółowy protokół ściągania RNA jest zoptymalizowany pod kątem pierwotnej hodowli adipocytów. Fragment RNA z nieuleganego translacji regionu 3' receptora androgenowego (AR) (3'UTR) zawierający element bogaty w adenylan-urydylan został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego partnera RBP, białko HuR, z listanu adipocytów. Opisana tutaj metoda może być stosowana do wykrywania interakcji między RBP a niekodującymi RNA, a także między RBP a kodującymi RNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RBP to białka, które wiążą się z dwu- lub jednoniciowym RNA w komórkach i uczestniczą w tworzeniu kompleksów RNA-białko. RBP mogą wiązać różne gatunki RNA, w tym mRNA i długie niekodujące RNA (lncRNA), i wywierać wpływ na poziomie potranskrypcyjnym. Zarówno RBP, jak i lncRNA stają się nowymi regulatorami rozwoju i funkcji tkanki tłuszczowej1,2,3. Aby zrozumieć mechanizm regulacji szlaków komórkowych za pośrednictwem RBP i lncRNA, często konieczne jest wykrycie interakcji między określoną cząsteczką RNA a jednym lub kilkoma RBP, a czasami zidentyfikowanie pełnego spektrum partnerów białkowych transkryptu RNA. Jednak eksperyment może być trudny ze względu na wysoką zawartość lipidów w adipocytach. Opisany tutaj protokół RNA pull-down można zastosować do pobrania partnerów białkowych określonego RNA z lizatów adipocytów kultur pierwotnych4,5.

Uzasadnienie dla tego protokołu jest podsumowane w następujący sposób. Przynęta RNA jest transkrybowana in vitro z matrycy DNA, znakowana biotyną i sprzężona z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną4. Przynęta RNA jest inkubowana z lizatami komórkowymi, aby umożliwić tworzenie kompleksów RNA-białko, które są następnie ściągane w dół na stojaku magnetycznym. Dokładniej rzecz ujmując, opisany poniżej protokół ściągania RNA wykorzystuje fragment RNA z AR 3'UTR jako przynętę do pobrania białka HuR, powszechnie wyrażanego RBP związanego z 3'UTR mRNA6,7, z teadipocytelizatu hodowli pierwotnej. Aby przetestować swoistość wiązania tego testu, jako kontrolę dołącza się nieistotny RNA, a także ślepe kulki streptawidyny. Protokół ten jest zgodny z western blotting lub spektrometrią mas (MS) w celu potwierdzenia wychwycenia określonego RBP lub identyfikacji pełnego repertuaru wychwyconych RBP, odpowiednio8.

Dostępnych jest kilka technik do badania interakcji RNA-białko. Aby ujawnić RNA związane przez daną RBP, MOŻNA ZASTOSOWAĆ RIP (immunoprecypitacja RNA) i CLIP (sieciowanie UV i immunoprecypitacja). Natomiast w celu identyfikacji partnerów białkowych danego RNA można zastosować pull-down RNA, ChIRP (izolacja chromatyny przez oczyszczanie RNA), CHART (analiza hybrydyzacji wychwytywania celów RNA) i RAP (oczyszczanie antysensowne RNA). W porównaniu z późniejszymi, technika ściągania RNA wymaga mniej wysiłku do skonfigurowania. Może być stosowany do wychwytywania białek in vitro i in vivo. Podejście in vivo polegające na ściąganiu RNA, które jest technicznie trudniejsze niż jego odpowiednik in vitro, zachowuje interakcje RNA-białko poprzez sieciowanie w komórkach, wychwytuje interesujące komórki RNA znakowane aptamerem, a następnie wykrywa związane RBP. Ściąganie RNA można wykorzystać do wzbogacenia mniej obfitych RBP oraz do izolowania i identyfikacji kompleksów RNA-białko, które odgrywają różne role funkcjonalne w kontrolowaniu regulacji komórkowej9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: RNA, które jest przedmiotem zainteresowania w kontekście tego badania, to fragment AR 3'UTR.

1. Przygotowanie RNA znakowanego biotyną

  1. Aby uzyskać RNA, należy amplifikować T7-AR-oligo metodą PCR, a następnie transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu komercyjnego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta11.
    UWAGA: Startery do PCR są wymienione w Tabeli 4: T7-AR-F i T7-AR-R.
  2. W celu kontroli niespecyficznego wiązania, amplifikuj częściową sekwencję DNA lucyferazy świetlika (FL) metodą PCR z plazmidu psiCHECK-2, a następnie transkrypcję in vitro.
    UWAGA: Startery do PCR są wymienione w Tabeli 4: hluc(+)-T7-probe-F i hluc(+)-probe-R. Tabela 4. Sekwencje matrycy i starterów do amplifikacji PCR.
  3. W przypadku reakcji PCR 50 μl wymieszaj 50 ng DNA (oligo lub plazmid), 4 μl dNTP (2,5 mM każdego pojedynczego dNTP), 5 μl 10x buforu reakcyjnego, 1 μl polimerazy DNA 2,5 U/μl, 2 μl 10 μM startera do przodu, 2 μl 10 μM startera odwrotnego i wodę wolną od nukleaz.
    1. Uruchom amplifikację PCR w termocyklerze za pomocą następującego programu. KROK 1: jeden cykl w temperaturze 95 °C przez 2 minuty; KROK 2: 35 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund (AR) lub 60 sekund (FL); KROK 3: jeden cykl w temperaturze 72 °C przez 10 min.
  4. Zsyntetyzuj biotynylowane RNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcjami producenta11. W tym eksperymencie użyj produktów PCR jako matryc do syntezy RNA. W przypadku 20 μl reakcji transkrypcji in vitro wymieszaj 200 ng amplifikowanego DNA PCR, 2 μl każdego pojedynczego NTP, 1 μl 10mM biotyny-CTP, 2 μl 10x buforu reakcyjnego i 2 μl polimerazy T7 RNA. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
  5. Po transkrypcji in vitro mieszaninę reakcyjną należy traktować 1 μl 2 U/μl DNazy w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu degradacji matrycowego DNA. Na koniec rozcieńczyć biotynylowane RNA do całkowitej objętości 60 μl w celu późniejszego oczyszczenia.
  6. Oczyść biotynylowane RNA w celu usunięcia soli i nieinkorporowanych nukleotydów za pomocą kolumn oczyszczających zgodnie z instrukcjami producenta12. Zmierzyć stężenie RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C do kolejnych testów pull-down.
  7. Aby zapewnić prawidłową strukturę drugorzędową dla RNA będącego przedmiotem zainteresowania w interakcji RNA-białko, należy podgrzać 50 μl biotynylowanego RNA (50 pM) w temperaturze 90 °C przez 2 min, schłodzić na lodzie przez 2 min, a następnie dostarczyć 50 μl bufora struktury 2x RNA (Tabela 3) i pozwolić na fałdowanie RNA w temperaturze RT przez 30 min13,14.

2. Przygotowanie koralików sprzężonych z RNA

UWAGA: Użyj magnetycznego stojaka do oddzielenia kulek magnetycznych od supernatantu.

  1. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne pokryte streptawidyną w oryginalnej fiolce, krótko wirując, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś 150 μl zawieszonych kulek do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę. Wyrzuć supernatant. Zachowaj granulat koralików.
    UWAGA: W testach RNA pull-down, podczas podawania zawieszonych kulek z oryginalnej fiolki, użyj kulek 50 μl do testu, a następnie western blotting i 200 μl kulek do testu, po którym następuje MS.
  2. Umyj koraliki raz, ponownie zawieszając granulat kulki z 1 ml zalecanego przez producenta bufora 1x W&B (wiążącego i myjącego) (Tabela 3), a następnie obracając rurkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej w rotatorze. Odrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.
  3. Aby dezaktywować RNazę na kulkach, umyj kulki dwukrotnie, za każdym razem poprzez ponowne zawieszenie granulki z 400 μl buforu A. Bufor A jest roztworem alkalicznym zawierającym 0,1 M NaOH i 0,05 M NaCl (Tabela 3). Obracaj rurkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w rotatorze. Odrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.
  4. Aby usunąć NaOH z kulek, należy umyć kulki dwukrotnie, za każdym razem poprzez ponowne zawieszenie granulatu kulek z 400 μl buforu B (Tabela 3), a następnie obracanie rurki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w rotatorze. Odrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.
  5. Zawiesić granulat kulek za pomocą 300 μl bufora 2x W&B, równo podzielić kulki i przenieść do trzech probówek o pojemności 1,5 ml (100 μl kulek na probówkę). Zaopatrz probówki zawierające kulki odpowiednio w 100 μl wody wolnej od RNazy, 100 μl biotynylowanego FL RNA i 100 μl biotynylowanego AR 3'UTR RNA.
  6. Inkubuj każdą mieszaninę kulek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z rotacją. Umieść rurki na magnesie na 1 minutę. Odrzucić cały supernatant. Zachowaj granulki koralików.
  7. Umyj koraliki dwukrotnie, za każdym razem ponownie zawieszając każdą granulkę kulki za pomocą 400 μl 1x bufor W&B, a następnie obracając rurki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w rotatorze.
  8. Umieść probówki na magnesie na 1 minutę. Wyrzuć cały supernatant. Zawiesić każdą granulkę kulki za pomocą 50 μl buforu do izolacji jądrowej (tabela 3).

3. Izolacja preadipocytów i indukcja adipogenezy

  1. Jak opisano w poprzednich publikacjach5, wypreparuj preadipocyty z brązowej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami (myszy C57BL6 typu dzikiego, 3 tygodnie).
  2. Wzrost i in vitro różnicowanie preadipocytów5. Komórki są gotowe do dalszej aplikacji 4-5 dni po rozpoczęciu różnicowania.

4. Przygotowanie lizatu komórkowego z pierwotnych adipocytów

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury przygotowania lizatu komórkowego są wykonywane na lodzie, a wszystkie są schładzane na lodzie. Homogenizatory szklane do odbijania przed schładzaniem na lodzie.

  1. Hodować i różnicować preadipocyty w 15-centymetrowych szalkach5 (patrz punkt 3.2). Każda szalka dostarcza odpowiednich komórek do jednego testu ściągania RNA. W 4 lub 5 dniu różnicowania odrzuć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyj komórki raz 1x PBS.
  2. Aby zebrać komórki, dodać 10-15 ml 1x PBS do komórek, zeskrobać, aby zebrać komórki w probówce o pojemności 50 ml i granulować komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu hipotonicznego (Tabela 3) i inkubować komórki na lodzie przez 15 minut. Przenieść komórki do homogenizatora szklanego o pojemności 15 ml i mechanicznie ścinać komórki na lodzie za pomocą 20 uderzeń.
  4. Osadzać jądra komórkowe przez odwirowanie w stężeniu 3 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Osad jądra komórkowego przechowywać na lodzie do dalszego użycia (patrz sekcja 4.6). Przenieść supernatant do probówek o pojemności 1,5 ml, dodać 3M KCl do supernatantu do uzyskania końcowego stężenia 150 mM i wirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Po odwirowaniu ostrożnie usuń warstwę lipidową na wierzchu za pomocą pipety o pojemności 1 ml i zbierz supernatant jako cytoplazmatyczny lizat komórkowy.
  6. Zawiesić osad jądrowy (patrz sekcja 4.4) w 1 ml buforze do izolacji jądrowej. Przenieść jądra do homogenizatora ze szkła o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i mechanicznie ścinać jądra na lodzie za pomocą 100 uderzeń. Osadzać szczątki jądrowe przez odwirowywanie w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant jako jądrowy lizat komórkowy.
  7. Albo połącz jądrowe i cytoplazmatyczne lizaty komórkowe, albo użyj każdej frakcji osobno, do dalszej aplikacji pull-down. W tym eksperymencie demonstracyjnym te dwie frakcje lizatu komórkowego połączono w stosunku objętościowym 1:1.
  8. Dodaj inhibitor RNazy do tego niefrakcjonowanego lizatu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 U/μl. Odłóż 100 μl lizatu komórkowego jako kontrolę wejściową do western blotting15.

5. Wiązanie i elucja RBP

  1. Podzielić lizat komórkowy na trzy równe podwielokrotności (1 ml lizatu komórkowego w probówce o pojemności 1,5 ml) i inkubować z kulkami ślepymi, odpowiednio sprzężonymi z FL RNA i AR 3'UTR RNA (patrz sekcja 2.8) przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją.
  2. Umieść probówki na magnesie na 1 minutę. Zebrać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml, a następnie wyizolować RNA z supernatantu, aby potwierdzić integralność RNA. Wyizolować RNA za pomocą kwaśnego roztworu tiocyjanianu guanidyny-fenolu zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela 2). Oceń nienaruszoność RNA, analizując podjednostki 28S i 18S rybosomalnego RNA. Trzymaj granulki koralików na lodzie.
  3. Umyj kulki magnetyczne sześć razy, za każdym razem przez ponowne zawieszenie każdej granulki z 1 ml buforu izolacji jądrowej zawierającego 40 U inhibitor RNazy i 0,25% IGEPAL, a następnie obracaj probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w rotatorze. Użyj stojaka magnetycznego do oddzielenia kulek magnetycznych i supernatantu. Odrzucić cały supernatant. Trzymaj granulki koralików na lodzie.
  4. Wykonaj następujące czynności, aby wymyć kompleksy RNA-białko z kulek do western blot. Po pierwsze, ponownie zawieś każdą granulkę kulki w buforze izolacji jądrowej o pojemności 75 μl; następnie dodać 25 μl 4x western blot bufor ładujący (zawierający SDS), aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl. Na koniec gotuj kulki w tym 100 μl roztworu w temperaturze 95 °C przez 5 min.
    UWAGA: Wykonaj następujące kroki, aby wymyć kompleksy RNA-białko z kulek dla SM. KROK 1: ponownie zawiesić każdą osadkę kulki w 100 μl buforu elucyjnego (Tabela 3); KROK 2: inkubować próbki kulek przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją; KROK 3: odwirować i zebrać supernatant zawierający białko; KROK 4: Skoncentrować roztwory białkowe do 20-30 μl przed złożeniem do stwardnienia rozsianego.
  5. Odwirować każde 100 μl próbki kulki o sile 12 000 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Podwielokrotność 15 μl supernatantu do analizy western blot (patrz punkty 6.1 i 6.2). Zbadaj powstałą błonę rozcieńczonym mysim przeciwciałem monoklonalnym HuR (rozcieńczenie 1:1,000) przez noc.

6. Western Blotting do weryfikacji RBP

  1. Oddziel RBP za pomocą SDS-PAGE przy użyciu standardowych technik.
  2. Przeprowadź western blot przy użyciu standardowych technik, sondując RBP związane z interesującym RNA.
    UWAGA: W tym eksperymencie demonstracyjnym mysie przeciwciało monoklonalne HuR zostało użyte do immunodetekcji białka HuR.
  3. Powstałą błonę inkubować z rozcieńczonym przeciwciałem HuR (rozcieńczenie 1:1 000) w beztłuszczowym mleku w proszku o stężeniu 5% wag., 1x TBS, 0,1% Tween-20 w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając, przez noc. Umyj membranę trzykrotnie za pomocą 1x TBST. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-mysie IgG-HRP) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyć membranę. Rozwijaj i nagrywaj sygnał.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym eksperymencie demonstracyjnym fragment AR RNA został użyty jako przynęta do wychwycenia białka wiążącego HuR. Zarówno przynęta FL RNA, która nie ma związku z białkiem HuR, jak i podwielokrotność niesprzężonych ślepych kulek streptawidyny służyły jako kontrola ujemna. Interakcje RNA-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie, a ten protokół pull-down może być stosowany do całkowitych lub frakcjonowanych (jądrowych lub cytoplazmatycznych) lizatów komórkowych. Analiza bi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

lncRNA i RBP odgrywają istotną rolę w zdrowiu i chorobie, jednak mechanizmy molekularne tych cząsteczek są słabo poznane. Identyfikacja białek, które oddziałują z cząsteczkami lncRNA, jest kluczowym krokiem w kierunku wyjaśnienia mechanizmów regulacyjnych. Wzbogacanie RBP za pomocą systemu testów pull-down RNA opiera się na wychwytywaniu w roztworze oddziałującego kompleksu, dzięki czemu białka z lizatu komórkowego mogą być selektywnie ekstrahowane przy użyciu biotynylowanych przynęt RNA związanych z kulkami magnetycznym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace zostały sfinansowane przez Singapore NRF fellowship (NRF-2011NRF-NRFF001-025) oraz CBRG (NMRC/CBRG/0070/2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Główne materiały użyte w tym badaniu.
MEGAscript kit  Ambion
Biotyna-14-CTP Kolumny spinowe Invitrogen
NucAway Ambion
Dynabeads M-280 Streptawidyna Invitrogen
HuR (3A2) (sc-5261) Santa Cruz Biotechnology
Goat anty-mysie IgG-HRP (sc-2005) Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (bez nukleaz) HyClone
Solanka (1 i razy; PBS)  Inhibitor
 Bioline
 Polimeraza DNA Sigma
Pfu Turbo Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Nazwa>FirmaNumer katalogowyUwagi
>Główne urządzenia użyte w tym badaniu.
Wirówka Sorvall Legend Micro 21R Wirówka Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R Termocykler Thermo Scientific
Bio-Rad T100 Bio-Rad
Nanodrop 2000 Rotator Thermo Scientific
BOECO Multi Bio RS-24 BOECO,Niemcy
Aparatura do elektroforezy i bibuły w żelu białkowym Magnes Bio-Rad
DynaMag-2 Technologie
Mysie przeciwciało monoklonalne Bufor fosforanowy RNazy HyCloneInhibitor proteazy życiowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973(2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203(2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Tagi

In Vitro TranscriptionBiotinylated RNAStreptavidin BeadsCell Lysate PreparationWestern BlottingHuR ProteinAR 3 UTR

Powiązane artykuły