W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Testy transkrypcji in vitro zostały opracowane i szeroko stosowane przez wiele lat do badania mechanizmów molekularnych związanych z transkrypcją. Proces ten wymaga wielopodjednostkowej polimerazy RNA zależnej od DNA (RNAP) i szeregu czynników transkrypcyjnych, które działają w celu modulowania aktywności RNAP podczas ekspresji genów. Sekwencjonowanie elektroforezy żelowej transkryptów znakowanych radioaktywnie służy do dostarczania szczegółowych informacji mechanistycznych na temat przebiegu transkrypcji i jakie parametry mogą na nią wpływać. W tym artykule opisano protokół badania, w jaki sposób niezbędny czynnik elongacyjny NusA reguluje pauzę transkrypcji, a także metodę identyfikacji środka przeciwbakteryjnego ukierunkowanego na inicjację transkrypcji poprzez hamowanie tworzenia holoenzymów RNAP. Metody te mogą być wykorzystane jako platforma do opracowania dodatkowych podejść do badania mechanizmu działania czynników transkrypcyjnych, które nadal pozostają niejasne, a także nowych środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na transkrypcję, która jest niedostatecznie wykorzystywanym celem leków w badaniach i rozwoju antybiotyków.
Wprowadzenie
Transkrypcja to proces, w którym RNA jest syntetyzowane z określonego szablonu DNA. W komórkach eukariotycznych występują trzy odrębne RNAP: RNAP I transkrybuje prekursory rRNA, RNAP II jest odpowiedzialny za syntezę mRNA i niektórych małych jądrowych RNA, a synteza 5S rRNA i tRNA jest przeprowadzana przez RNAP III. U bakterii istnieje tylko jeden RNAP odpowiedzialny za transkrypcję wszystkich klas RNA. Istnieją trzy etapy transkrypcji: inicjacja, wydłużenie i zakończenie. Transkrypcja jest jednym z najbardziej regulowanych procesów w komórce. Każdy etap cyklu transkrypcji stanowi punkt kontrolny dla regulacji ekspresji genów1. W celu inicjacji RN....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Eksperymenty obejmują użycie radioaktywnego izotopu 32P i nie należy podejmować żadnych prac, dopóki nie zostaną spełnione wszystkie odpowiednie warunki bezpieczeństwa. Ogólnie rzecz biorąc, personel jest zobowiązany do uczestnictwa w kursie bezpieczeństwa i poddania się nadzorowanej praktyce przed eksperymentami z użyciem odczynników radioaktywnych. Podczas przeprowadzania reakcji należy nosić środki ochrony osobistej (dozymetr termoluminescencyjny, okulary ochronne, rękawice, fartuchy laboratoryjne do radiacji, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).
1. Przygotowanie materiałów testowych
- Uzyskać białka wymagane do testu transk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wydajność transkrypcji można określić poprzez pomiar poziomu promieniowania w prążkach w różnych punktach czasowych. Test pauzy służący do zbadania funkcji czynnika NusA umożliwił wizualizację produktów pauzy, terminacji oraz run-off (Rycina 1A). W obecności domeny N-końcowej białka NusA (NusA NTD; reszty aminokwasowe 1-137) pojawienie się produktów RNA było znacznie opóźnione w porównaniu z eksperymentem kontrolnym bez udziału NusA. Delecja reszt aminokwasowych 104-137 (.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
We wszystkich organizmach transkrypcja jest ściśle regulowanym procesem. Testy transkrypcji in vitro zostały opracowane w celu zapewnienia platformy do testowania wpływu czynników transkrypcyjnych, małych cząsteczek i inhibitorów transkrypcji. W pracy tej metody opisano test ogólnej transkrypcji bakteryjnej. Testy transkrypcyjne w połączeniu z sekwencjonowaniem elektroforezy transkryptów w żelu są bardzo ważne dla badań mechanistycznych, ponieważ umożliwiają wizualizację wszystkich produktów transkrypcji na osi .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca potwierdza przyznanie stypendium na wczesną karierę naukową z Uniwersytetu w Newcastle (CM).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Otrzymać białka wymagane do oznaczenia | |||
| E. coli | Epicentrum | S90250 | |
| uzdatnionego | |||
| DEPC (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Woda wolna od RNaz | |||
| przygotowania | |||
| ThermoFisher | AM9937 | Ambient Nuclease-Free Water | |
| Plus SV Minipreps System oczyszczania DNA | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| Startery PCR | |||
| Wizard SV Gel i PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparat | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| rNTP o wysokiej czystości | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | związku promieniotwórczego |
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1– 1 kb | Milipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Preparat | |||
| Komórka do sekwencjonowania kwasów nukleinowych Sequi-Gen GT | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | Mocznik SL2 | |
| Sigma-Aldrich | U6504 | ||
| tris(hydroksymetylo)aminometan | Sigma-Aldrich | ||
| kwas borowy | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| kwas etylenodiaminotetraoctowy | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Akrylamid/bis-akrylamid | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| nadsiarczan amonu | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N',-tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Test transkrypcji | |||
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| ryfampicyna | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamid | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| błękit bromofenolowy | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cyjanol ksylenowy | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparyna | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Inhibitor rybonukleazy | Promega | N2511 | |
| Bufor transkrypcyjny | |||
| Baza Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Naziemna Telewizja Cyfrowa | Sigma-Aldrich | Glicerol DTT-RO | |
| Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| Bibuła | |||
| Whatman Bibuła chromatograficzna 3MM Chr | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioaktywny dekontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Leczenie | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Nauki przyrodnicze | 63-0055-89 |
Bibliografia
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
