Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Podsumowanie

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Streszczenie

Małe niekodujące RNA (miRNA) są zaangażowane w różne choroby ludzkie, w tym zespoły metaboliczne. Mogą być wykorzystywane jako biomarkery do diagnozowania i prognozowania lub mogą służyć jako cele do opracowywania leków. Ostatnio wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach, szczególnie lipoproteinach o wysokiej gęstości (HDL) i są dostarczane do komórek biorców w celu wychwytu. Stwarza to możliwość, że miRNA odgrywają kluczową i kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek i narządów poprzez regulację ekspresji genów, a także jako przekaźnik komunikacji komórka-komórka i przesłuchy między narządami. Obecne metody izolacji miRNA z oczyszczonego HDL są niepraktyczne w przypadku wykorzystania małych próbek na dużą skalę. Wynika to w dużej mierze z czasochłonnych i pracochłonnych metod stosowanych do izolacji lipoprotein. Opracowaliśmy uproszczone podejście do szybkiego wyizolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z próbek osocza. Metoda ta powinna ułatwić badania nad rolą miRNA w zdrowiu i chorobie, a w szczególności dostarczyć nowych informacji na temat różnorodności funkcji biologicznych, poza odwrotnym transportem cholesterolu, które przypisuje się HDL. Ponadto gatunki miRNA, które są obecne w HDL, mogą dostarczyć cennych informacji na temat biomarkerów klinicznych do diagnozowania różnych chorób.

Wprowadzenie

MikroRNA to endogenne, niekodujące, maleńkie gatunki RNA, które są wysoce konserwatywne i są uważane za kluczowych graczy w regulacji różnych procesów biologicznych poprzez degradację lub tłumienie specyficznych docelowych informacyjnych RNA¹. Ponieważ miRNA działają wewnątrzkomórkowo, zostały zbadane jako biomarkery pochodzenia tkankowego, co doprowadziło do odkrycia specyficznych dla tkanek funkcji tych miRNA. Jednak miRNA występują również zewnątrzkomórkowo albo związane z białkami, albo w egzosomach/mikropęcherzykach, które skutecznie mogą chronić je przed degradacją przez zewnątrzkomórkowe RNazy². Nowsze badania wykazały, że ochronne działanie HDL może nie być ściśle związane z jego zdolnością do promowania wypływu cholesterolu, ale raczej z jego ładunkiem niezwiązanym z cholesterolem, w szczególności jako krążącego nośnika miRNA ^{3, 4}. Te miRNA mogą nie tylko modulować metabolizm lipidów, ale są również związane z przeciwzapalnym, przeciwutleniającym i przeciwzakrzepowym działaniem kompleksu HDL-miRNA ^{5, 6}.

Aby dokładniej zbadać rolę miRNA przenoszonych w cząsteczkach HDL, należy ustalić prosty i łatwy protokół ekstrakcji miRNA z izolowanego wysoko oczyszczonego HDL do użytku klinicznego. Opisano wiele metod izolacji HDL. Metody te są albo bardzo czasochłonne, albo wymagają dużej objętości osocza, co może wymagać łączenia próbek, rozległej dializy w celu odsalania izolowanych lipoprotein i nie usuwają całkowicie egzosomów jako źródła miRNA³, odpowiednio. Tutaj opisujemy prostą i szybką metodę, która może wyizolować miRNA z wysoko oczyszczonego HDL przy użyciu małej objętości próbek krwi na większą skalę. Uważamy, że metoda ta może służyć jako dobre odniesienie do promowania badań nad rolą krążących miRNA, a w szczególności nad rolą HDL w ułatwianiu komunikacji między różnymi komórkami i narządami.

Protokół

1. Pobieranie próbek krwi

1. Pobrać próbki krwi z żył obwodowych na czczo do 10 ml plastikowych probówek zawierających antykoagulant kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (który ma kilka zalet w porównaniu z innymi antykoagulantami) przez standardowe nakłucie dożylne wystającej żyły w dole przedłokciowym.
2. Odwirować próbki krwi przy 1 600 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej w celu uzyskania osocza wolnego od czerwonych krwinek i niewielkich ilości RNA.
3. Sekwencyjnie odwirować supernatant w temperaturze 3 000 g (4 °C) w obracającym się wirniku kubełkowym przez 10 minut w celu usunięcia WBC i płytek krwi, a następnie dodatkowe 15 minut w celu usunięcia pozostałych resztek komórek.
4. Zmierz gęstość osocza za pomocą densytometru o temperaturze pokojowej zgodnie z instrukcją producenta.
   UWAGA: Dostosowanie gęstości (d = 1,023 g/ml) 0,9% roztworem soli może być wymagane po usunięciu egzosomów, ale przed ultrawirowaniem w gradiencie gęstości.

2. Usuwanie egzosomów z osocza

1. Usuń krążące egzosomy, które mają gęstość podobną do HDL i reprezentują ilościowo istotne źródło miRNA³.
   1. W tym celu należy dodać 252 μl roztworu wytrącającego egzosomy do 1 ml osocza, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Aby wydrobować egzosomy, należy odwirować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 1 500 g w temperaturze 4 °C.
   2. Aby wyizolować HDL, należy przenieść 1 ml powstałego supernatantu do grubościennej probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w celu dalszego przetwarzania z ultrawirowaniem w gradieniu gęstości (patrz poniżej).

3. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (Rysunek 1).

1. Aby oddzielić HDL, należy zastosować 3-etapowy proces wykorzystujący ultrawirówkę podłogową z wirnikiem o stałym kącie działania, pracującą odpowiednio w temperaturze 448 811 x G i 8 °C.
2. Dla każdej izolacji należy przygotować trzy roztwory o różnej gęstości sekwencyjnie i na świeżo.
   1. Przygotować roztwór A (izolacja VLDL, d = 1,006 g/ml) rozpuszczając 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na i 1 ml 1N NaOH w 1,000 ml autoklawowanej wody destylowanej. Następnie dodaj dodatkowe 3 ml autoklawowanej wody destylowanej.
   2. Przygotować roztwór B (izolacja LDL, d = 1,182 g/ml) dodając 25,2 g NaBr do 100 ml roztworu A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Przygotować roztwór C (izolacja HDL, d=1,470 g/ml) mieszając 78,8 g NaBr ze 100 ml roztworu A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Potwierdzić odpowiednią gęstość przy RT za pomocą densytometru. Wszystkie roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

4. Izolacja VLDL

1. Wymieszać 1 ml osocza (średnia gęstość = 1,023 g/ml) i wolne od nukleaz 200 μl Fat Red 7B w grubościennej probówce ultrawirówkowej z poliwęglanu o pojemności 6,5 ml.
2. Następnie ostrożnie ułóż 5 ml roztworu A na wierzchu mieszaniny. W razie potrzeby dodaj dodatkowy Fat Red 7B na wierzch roztworu A, aby zrównoważyć wagę każdej probówki. Wirować przez 2 godziny (przyspieszenie - 5), (opóźnienie - 7).
   UWAGA: Podczas wirowania lipoproteiny są gromadzone jako pasmo w ich obszarach gęstości równowagi.
3. Pod koniec biegu obserwuj 2 warstwy. Usunąć 1,5 ml frakcji VLDL stanowiącej wierzchnią warstwę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Na koniec, za pomocą pipety, przenieść 4 ml z dna probówki zawierającej frakcję LDL, HDL, albuminę i kwasy tłuszczowe do nowej probówki z poliwęglanu w celu izolacji LDL.

5. Izolacja LDL

1. Zmieszać 2 ml roztworu B i 100 μl wolnego od nukleaz Fat Red 7B w probówce zawierającej odpowiednio frakcję LDL i HDL (sekcja 4).
2. Następnie odwirowywać przez 3 godziny (przyspieszenie 9, opóźnienie 7). Następnie usunąć 1,5 ml frakcji LDL stanowiącej wierzchnią warstwę i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -80 °C. Na koniec przenieść 4 ml z dna probówki zawierającej frakcję HDL do nowej probówki z poliwęglanu.

6. Izolacja HDL

1. Zmieszać odpowiednio 2 ml roztworu C, 100 μl wolnego od nukleaz Fat Red 7B i 15 μl 98% β-merkaptoetanolu z probówką zawierającą frakcję HDL.
2. Wirować przez 3 godziny (przyspieszenie 9, opóźnienie 7). Następnie usunąć 2 ml frakcji HDL reprezentującej wierzchnią warstwę i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Odsalanie i zagęszczanie frakcji lipoprotein

1. Aby uniknąć zakłóceń w późniejszej elektroforezie w żelu agarozowym i PCR, należy usunąć nadmiar soli dodanej podczas ultrawirowania w gradiencie gęstości za pomocą filtrów odśrodkowych z odpowiednią granicą masy cząsteczkowej (probówka 3K dla VLDL i probówka 10K dla LDL/HDL) zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Krótko, po dodaniu 2,5 ml zimnego PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4; pH 7,4) odwirować całą frakcję VLDL zebraną podczas ultrawirowania w gradiencie gęstości w temperaturze 4 °C przez 60 minut za pomocą wahadłowego wirnika kubełkowego.
   2. Odsolić frakcję LDL dwukrotnie za pomocą 10 ml lodowatego PBS przez 30 minut każde. Następnie dwukrotnie użyj 13 ml lodowatego PBS do odsalania frakcji HDL. Większa objętość PBS jest niezbędna do poprawy mobilności za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po odwirowaniu usunąć lipoproteiny zawierające substancje rozpuszczone i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Elektroforeza w żelu agarozowym

1. Elektroforeza w żelu agarozowym lipoprotein Perfrom z wykorzystaniem zestawu z niewielkimi modyfikacjami instrukcji producenta w następujący sposób.
   UWAGA: Ten krok ma na celu jedynie ocenę jakości i czystości skoncentrowanych próbek lipoprotein.
   1. Na krótko uzyskać 6 μl odsolonej frakcji lipoprotein za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości i załadować na wstępnie złożony żel lipoproteinowy. Użyj ludzkich wzorców lipoprotein dla VLDL, LDL i HDL jako odniesienia do rozmiaru. Przeprowadzać elektroforezę w temperaturze pokojowej przy napięciu 100 V przez 60 minut przy użyciu bufora Rep Prep.
   2. Suszyć żel przez 10 minut, a następnie barwić przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą Fat Red 7B. Żel należy odbarwić w mieszaninie metanol-woda w stosunku 75:25 (v/v) i ponownie schnąć przez 5 minut.

9. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA

1. Perfrom izolacja miRNA przez oczyszczony ludzki HDL przy użyciu zestawu do izolacji i oczyszczania miRNA surowicy/osocza.
   1. Na krótko dodać 1 ml odczynnika do lizy RNA do 200 μl oczyszczonego HDL, wymieszać z wirownikiem, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych i inaktywację RNaz.
   2. Następnie wprowadzić do mieszaniny 3,5 μl syntetycznego mikroRNA Caenorhabditis elegans (cel-miR-39; 1,6 x 10⁸ kopii/μl). Następnie przeprowadzić ekstrakcję RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Przeprowadzić oczyszczanie wyekstrahowanego miRNA za pomocą eluujących kolumn spinowych zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz stężenie miRNA z oczyszczonego HDL za pomocą spektroforometru.
   UWAGA: Elucja miRNA z kolumn wirowych wykorzystywała 16 μl wody wolnej od RNaz.

10. Odwrotna transkrypcja (RT-PCR)

1. Wyizolować 100 ng miRNA z HDL wzbogaconego syntetycznym miRNA (cel-miR-39) i poddać odwrotnej transkrypcji w objętości reakcyjnej 20 μl przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji i zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Wykonaj odpowiednie kontrole bez matrycowego miRNA (NTC) i bez mieszanki enzymów odwrotnej transkryptazy (NRT).

11. PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

1. Perfrom Real-time PCR w całkowitej objętości 20 μl z 2 μl cDNA w rozcieńczeniu 1:2, 10 μl mieszanki PCR, 2 μl startera uniwersalnego, 2 μl starterów miRNA i 4 μl wody wolnej od RNaz.
2. Przeprowadzić reakcję w 96-dołkowych płytkach w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie w 45 cyklach w temperaturze 94 °C przez 15 sekund i 55 °C przez 30 s oraz fazę przedłużającą w temperaturze 70 °C przez 30 s.ec Z wszystkich reakcji w trzech egzemplarzach.
3. Następnie oblicz względne ilości miRNA za pomocą metody ^2-ΔΔCt po normalizacji do syntetycznego genu porządkowego zgodnie z instrukcjami producenta .

Wyniki

Izolacja lipoprotein o wysokiej gęstości po usunięciu egzosomów
Aby uzyskać miRNA z wysoko oczyszczonego HDL, konieczne jest usunięcie egzosomów, które stanowią źródło zanieczyszczenia miRNA⁷. Dokonano tego przed ultrawirowaniem w gradiencie gęstości za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Ze względów praktycznych zmodyfikowano trzyetapowy protokół ultrawirowania z gradientem gęstości standardowej, opracowany przez firmę komercyjną (...

Dyskusja

Identyfikacja nowych biomarkerów z krwi pomoże w diagnostyce klinicznej i prognozowaniu różnych chorób. Wiadomo, że mikroRNA posiadają wszystkie cechy biomarkerów i wykazano w różnych badaniach, że są ^{one 14-17}. W tym badaniu pokazaliśmy szybką i prostą, łatwą metodę izolacji miRNA z osocza HDL. Konwencjonalna metoda ultrawirowania z gradientem gęstości polegająca na izolacji VLDL, LDL i HDL polega na dokładnym pobraniu próbek osocza, precyzyjnym przygotowaniu roztworu buforowego, pomiarze gęstości i transferz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastikowe tuby Vacutainer Lavender K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	366643
Wirówka	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R
Densytometr 75004261 Densito 30PX	Rozwiązanie Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick	Invitrogen	4484451
Grubościenna ultrawirówka z poliwęglanu	Thermo Scientific	O3237
Ultrawirówka Sorvall WX100	Thermo Scientific	46902
Tłusta Czerwień 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Filtry odśrodkowe 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-odśrodkowe urządzenia filtrujące 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo	Laboratoria Helena	3344,3544T
Wzorce lipoprotein ludzkich dla lipotroli VLDL, LDL i HDL	; Helena Laboratories	5069
Bufor przygotowawczy Rep	Laboratoria Helena	Kolumny wirujące 3100
RNeasy MinElute	Analizator Qiagen
NanoDrop 1000	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Testy Primer	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0,20 i #181; M sterylny filtr strzykawkowy	SIGMA-ALDRICH	Z227536