Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54263

⸱

5 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano dwa testy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na mikroskopii czynników gospodarza związanych z infekcją Brucellą. Test wejściowy wykrywa czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucella, a test końcowy te, które są wymagane do replikacji wewnątrzkomórkowej. Chociaż ma zastosowanie do alternatywnych podejść, badania przesiewowe siRNA w komórkach HeLa są wykorzystywane do zilustrowania protokołów.

Streszczenie

Gatunki Brucella to fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe, które infekują zwierzęta jako ich naturalni gospodarze. Przenoszenie na ludzi jest najczęściej spowodowane bezpośrednim kontaktem z zakażonymi zwierzętami lub spożyciem skażonej żywności i może prowadzić do ciężkich przewlekłych infekcji.

Brucella może atakować profesjonalne i nieprofesjonalne komórki fagocytarne i replikować się w wakuolach pochodzących z retikulum endoplazmatycznego (ER). Czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucelli do komórek gospodarza, uniknięcia degradacji lizosomalnej i replikacji w kompartmencie podobnym do ER pozostają w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy dwa testy w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w wnikanie i replikację Brucelli w komórkach HeLa. Protokoły opisują wykorzystanie interferencji RNA, podczas gdy można zastosować alternatywne metody badań przesiewowych. Testy opierają się na wykrywaniu fluorescencyjnie znakowanych bakterii w znakowanych fluorescencyjnie komórkach gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii szerokokątnej. Obrazy fluorescencyjne są analizowane przy użyciu ustandaryzowanego potoku analizy obrazu w CellProfiler, który umożliwia ocenę infekcji na podstawie pojedynczych komórek.

W teście końcowym replikacja wewnątrzkomórkowa jest mierzona dwa dni po zakażeniu. Dzięki temu bakterie mogą przemieszczać się do swojej niszy replikacyjnej, gdzie proliferacja jest inicjowana około 12 godzin po wniknięciu bakterii. Brucella, która z powodzeniem stworzyła niszę wewnątrzkomórkową, będzie więc silnie namnażać się w komórkach gospodarza. Ponieważ bakterie wewnątrzkomórkowe znacznie przewyższają liczebnie pojedyncze zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe bakterie niereplikacyjne, można zastosować szczep konstytutywnie wyrażający GFP. Silny sygnał GFP jest następnie wykorzystywany do identyfikacji zakażonych komórek.

Natomiast dla testu wejściowego niezbędne jest rozróżnienie między bakteriami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi. W tym przypadku stosuje się kodowanie szczepu dla GFP indukowanego tetracykliną. Indukcja GFP przy jednoczesnej inaktywacji bakterii zewnątrzkomórkowych przez gentamycynę umożliwia różnicowanie bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych na podstawie sygnału GFP, przy czym tylko bakterie wewnątrzkomórkowe są zdolne do ekspresji GFP. Pozwala to na solidne wykrywanie pojedynczych bakterii wewnątrzkomórkowych przed rozpoczęciem proliferacji wewnątrzkomórkowej.

Wprowadzenie

Gatunki Brucella to gram-ujemne, fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe należące do klasy α-Proteobacteria. Powodują poronienia i bezpłodność u swoich naturalnych żywicieli, takich jak bydło, kozy lub owce, powodując poważne straty ekonomiczne na obszarach endemicznych. Bruceloza jest jedną z najważniejszych chorób odzwierzęcych na świecie, powodującą rocznie ponad pół miliona nowych zakażeń u ludzi1. Przeniesienie na człowieka jest najczęściej spowodowane bezpośrednim kontaktem z zakażonymi zwierzętami lub spożyciem skażonej żywności, takiej jak niepasteryzowane mleko. Objawy choroby gorączkowej są niespecyficzne, co powoduje trudności w rozpoznaniu brucelozy. Nieleczona choroba może doprowadzić do rozwoju przewlekłej infekcji z poważniejszymi objawami, takimi jak zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia i neuropatia2.

Na poziomie komórkowym Brucella jest w stanie atakować komórki fagocytarne i niefagocytarne oraz replikować się w obrębie wewnątrzkomórkowego przedziału znanego jako wakuola zawierająca Brucellę (BCV). Internalizacja bakterii wymaga rearanżacji cytoszkieletu aktynowego przez Rac, Rho i bezpośrednią aktywację Cdc423. Wewnątrz eukariotycznej komórki gospodarza BCV przemieszcza się wzdłuż szlaku endocytarnego i pomimo interakcji z lizosomami bakteriom udaje się uniknąć degradacji4. Zakwaszenie BCV przez pęcherzykową ATPazę jest wymagane do indukowania ekspresji bakteryjnego systemu wydzielania typu IV (T4SS)5. Uważa się, że efektory bakteryjne wydzielane przez T4SS są niezbędne do utworzenia przez Brucellę niszy replikacyjnej, ponieważ delecja T4SS6 lub hamowanie pęcherzykowej ATPazy prowadzi do wad w tworzeniu niszy wewnątrzkomórkowej7. Bakterie nie replikują się w fazie transportu, dopóki nie dotrą do przedziału wakuolarnegopochodzącego z ER 8. Gdy dojdzie do proliferacji wewnątrzkomórkowej, BCV znajduje się w ścisłym związku z markerami ER, takimi jak kalneksyna i glukozo-6-fosfataza6.

Mechanizmy molekularne, dzięki którym Brucella dostaje się do komórek, unika degradacji lizosomalnej i w końcu replikuje się w komorze podobnej do ER, pozostają w dużej mierze nieznane. Czynniki gospodarza zaangażowane w różne etapy infekcji zostały zidentyfikowane głównie za pomocą metod celowanych lub badania przesiewowego małego interferującego RNA (siRNA) na małą skalę przeprowadzonego w komórkach Drosophila 9. Rzuciły one światło na udział poszczególnych czynników gospodarza w zakażeniu Brucellą, ale nadal jesteśmy dalecy od pełnego zrozumienia całego procesu.

Tutaj przedstawione są protokoły, które pozwalają na identyfikację czynników ludzkich gospodarzy za pomocą badań przesiewowych interferencji RNA (RNAi) na dużą skalę w połączeniu z automatyczną mikroskopią fluorescencyjną o szerokim polu widzenia i automatyczną analizą obrazu. Odwrotna transfekcja siRNA komórek HeLa jest wykonywana zgodnie z wcześniejszym opisem10,11 z niewielkimi modyfikacjami. Test punktu końcowego obejmuje dużą część wewnątrzkomórkowego cyklu życia Brucelli, z wyjątkiem wyjścia i infekcji sąsiednich komórek. Aby dokładniej scharakteryzować trafienia zidentyfikowane w teście punktu końcowego, stosuje się zmodyfikowany protokół identyfikacji czynników zaangażowanych we wczesne etapy infekcji.

Szczep Brucella abortus, który konstytutywnie wyraża GFP, jest używany do testu końcowego, w którym bakterie mogą infekować komórki przez dwa dni. W tym czasie bakterie dostają się do komórek, przemieszczają się do niszy replikacyjnej pochodzącej z ER i replikują się w przestrzeni okołojądrowej. Wysoki poziom sygnału GFP może być następnie wykorzystany do niezawodnego wykrywania pojedynczych komórek, które zawierają replikujące się bakterie.

Aby zbadać wejście Brucella do wysokoprzepustowego testu, ważne jest, aby móc rozróżnić bakterie wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Przedstawiona tutaj metoda omija różnicowe barwienie przeciwciałami bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych. Opiera się na szczepie Brucella wykazującym ekspresję GFP indukowanego tetracykliną w połączeniu z konstytutywną ekspresją dsRed. Obecność składowego markera dsRed pozwala na identyfikację wszystkich bakterii obecnych w próbce. Ekspresja GFP jest indukowana przez dodanie nietoksycznego analogu tetracykliny anhydrotetracykliny (aTc) jednocześnie z inaktywacją bakterii zewnątrzkomórkowych przez gentamycynę (Gm). Podczas gdy nieprzepuszczalny dla komórek antybiotyk Gm zabija bakterie zewnątrzkomórkowe, aTc może dostać się do komórki gospodarza i selektywnie indukować ekspresję GFP w bakteriach wewnątrzkomórkowych. Ten podwójny reporter umożliwia solidne oddzielenie pojedynczych bakterii wewnątrzkomórkowych (sygnał GFP i dsRed) od bakterii zewnątrzkomórkowych (tylko sygnał dsRed) przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Aby osiągnąć wykrywalną ekspresję GFP przez wewnątrzkomórkową Brucellę, stwierdziliśmy, że 4 godziny indukcji przez aTc dają wiarygodny sygnał. Podobne schematy indukcji do selektywnej ekspresji GFP w bakteriach wewnątrzkomórkowych były wcześniej wykorzystywane do badania wewnątrzkomórkowego Shigella12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wszystkie prace z żywymi szczepami Brucella abortus muszą być wykonywane w laboratorium o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL3), z uwzględnieniem wszystkich wymaganych przepisów i środków ostrożności.

1. Przygotowanie płytek do przesiewania oraz hodowla bakterii i komórek

  1. Przygotowanie kultur startowych Brucella abortus
    1. Wysiać Brucella abortus 2308 (B. abortus) z mrożonego w -80 °C zapasu w mleku na płytkę z agarem sojowo-tryptycznym (TSA) zawierającym 50 µg/ml kanamycyny (TSA/Km). Inkubować płytkę przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C. Do testu końcowego (endpoint assay) należy użyć szczepu Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT::GFP)13, a do testu wnikania (entry assay) szczepu Brucella abortus pAC042.08 (apht::dsRed,tetO::tetR-GFP).
      Uwaga: Gładki lipopolisacharyd (LPS) Brucella abortus jest istotnym determinantem wirulencji, jednak mutanty szorstkie mogą występować z relatywnie wysoką częstotliwością14. Zaleca się zatem sprawdzenie statusu szczepu hodowlanego przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. Ponownie wysiać bakterie na cztery płytki TSA/Km, pokrywając całą powierzchnię agaru, i inkubować przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C.
    3. Za pomocą jednorazowej pętli plastikowej przenieść i resuspendować bakterie z płytek TSA/Km w 10 ml 10% autoklawowanego mleka odtłuszczonego. Należy upewnić się, że bakterie zostały dobrze resuspendowane, aby zapewnić spójne stężenie bakterii we wszystkich kulturach startowych.
    4. Rozdzielić po 250 µl zawiesiny bakteryjnej do probówek z nakrętką zakręcaną o pojemności 2 ml i zamrozić w -80 °C.
    5. Rozmrozić alikwot kultury startowej i przenieść 25 µl, 50 µl oraz 100 µl bakteryjnej kultury startowej do oddzielnych butelek z nakrętką zakręcaną o pojemności 250 ml zawierających 50 ml bulionu sojowo-tryptycznego (TSB) z 50 µg/ml kanamycyny (TSB/Km). Butelki uszczelnić Parafilmem.
    6. Inkubować butelki przez noc na wytrząsarce orbitalnej przy 100 rpm i w temperaturze 37 °C.
    7. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600), aby określić objętość kultury startowej wymaganą do osiągnięcia OD600 = 0,8-1,1 po nocnej inkubacji.
  2. Przygotowanie komórek HeLa
    1. Hodować komórki HeLa w podłożu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) (DMEM/10% FCS) w inkubatorze wilgotnym w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Hodować komórki do osiągnięcia 80% konfluencji.
  3. Przygotowanie płytek przesiewowych z siRNAs.
    1. Rozcieńczyć siRNAs w wodzie wolnej od RNaz do końcowego stężenia 0,32 µM. Przenieść 5 µl/dołek do czarnych płytek 384-dołkowych z przezroczystym dnem i płaskim dnem.
      1. Kolumny 1, 2, 23 i 24 wykorzystać jako kontrole standardowe. Jako kontrole negatywne zastosować niecelujący siRNA (scrambled) oraz dołki mock (bez siRNAs, tylko odczynnik do transfekcji). Jako kontrole transfekcji zastosować siRNA indukujący śmierć komórek (KIF11) oraz kontrole pozytywne znanych czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję Brucella (np. ARPC3, komponent kompleksu Arp2/3 uczestniczący w polimeryzacji aktyny). Do pozostałych dołków przenieść dostępne komercyjnie biblioteki siRNA lub spersonalizowane siRNAs.
      2. Uszczelnić płytki odrywanymi foliami aluminiowymi. Przechowywać płytki w -20 °C.
        Uwaga: Płytki można przechowywać w -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy i do kilku lat, w zależności od zaleceń producenta.

2. Odwrócona transfekcja siRNA

  1. Rozmrozić czarną płytkę 384-dołkową poprzez wirowanie przy 300 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: pozwoli to osadzić cały płyn, który mógł przylgnąć do pokrywki lub ścianek dołków.
  2. Przygotować medium do transfekcji poprzez rozcieńczenie odczynnika do transfekcji w stosunku 1:200 w DMEM bez FCS w temperaturze pokojowej. Medium do transfekcji należy przygotować nie wcześniej niż 20 min przed użyciem. Przed użyciem ostrożnie wymieszać roztwór.
  3. Do każdego dołka dodać 25 µl medium do transfekcji za pomocą dozownika odczynników i wymieszać roztwory, przesuwając płytkę przód-tył.
  4. Inkubować płytkę przez 1 hr w temperaturze pokojowej, aby umożliwić tworzenie kompleksów siRNA/odczynnik do transfekcji.
  5. W międzyczasie przygotować komórki HeLa, przemywając raz subkonfluente komórki z kolby o powierzchni 75 cm2 za pomocą 2,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w PBS (trypsyny).
  6. Dodać 1,5 ml świeżej trypsyny i przenieść kolbę do temperatury 37 °C na 2-3 min, aż komórki przyjmą kształt kulisty.
  7. Resuspendować komórki w 10 ml podgrzanego DMEM/16% FCS.
  8. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 10 000 komórek/ml w DMEM/16% FCS.
  9. Do każdego dołka dodać 50 µl zawiesiny komórkowej za pomocą dozownika odczynników, co daje 500 komórek/dołek.
  10. Przesuwać płytkę przód-tył, aby uzyskać równomierny rozkład komórek. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez 5-10 min, aby komórki mogły osiąść.
  11. Uszczelnić płytkę Parafilmem i inkubować przez 72 hr na podgrzanej płycie aluminiowej w wilgotnym inkubatorze w 37 °C z 5% CO2.
    Uwaga: podgrzana płyta aluminiowa zapewnia równomierny rozkład temperatury w całej 384-dołkowej płytce.

3. Infekcja i utrwalanie

  1. Na jeden dzień przed infekcją należy zaszczepić ilość określoną w punkcie 1.1.7 z B. abortus kulturę startową w 50 ml pożywki TSB/Km w butelce z zakrętką o pojemności 250 ml. Butelkę szczelnie zamknąć Parafilmem i inkubować bakterie przez noc w temperaturze 37 °C oraz 100 obr./min na inkubatorze wytrząsowym do uzyskania gęstości optycznej (OD)600 = 0.8-1.1.
  2. Pomiar OD600 hodowli bakteryjnej i przygotować medium infekcyjne poprzez rozcieńczenie hodowli bakteryjnej w DMEM/10% FCS w celu uzyskania pożądanej wielokrotności infekcji (MOI).
    Uwaga: Aby uzyskać stopień zakażenia na poziomie 5-10% w komórkach HeLa, stosuje się MOI wynoszące 10 000. Dla każdego typu komórek należy wyznaczyć krzywą miareczkowania MOI w celu uzyskania optymalnego stopnia zakażenia.
  3. Wymień medium do transfekcji w płytce 384-dołkowej na 50 µl podłoża infekcyjnego przy użyciu automatycznego myjnika płytek.
  4. Wirować płytkę 384-dołkową z przyspieszeniem 400 x g i 4 °C przez 20 min.
    Uwaga: Pomaga to zsynchronizować proces infekcji.
  5. Uszczel płytkę za pomocą Parafilmu i inkubuj ją na wstępnie podgrzanej płytce aluminiowej w 37 °C inkubator wilgotnościowy z 5% CO22 przez 4 godz.
  6. Przemyj komórki pożywką DMEM/10% FCS zawierającą 100 µg/ml Gm do inaktywacji bakterii zewnątrzkomórkowych przy użyciu zautomatyzowanego myjacza płytek (użyj 200 µl/well płukanie przelewowe).
    Uwaga: Podczas płukania przelewowego automatyczna myjka płytek jednocześnie dozuje i odsysa medium.
  7. W celu przeprowadzenia testu wnikania, wypłucz komórki po raz drugi za pomocą medium DMEM/10% FCS zawierającego 100 µg/ml Gm oraz 100 ng/ml aTc przy użyciu automatycznego myjnika płytek (użyć 200 µl/well płukanie przelewowe).
  8. Uszczelnij płytkę Parafilmem i umieść ją z powrotem na podgrzanej wcześniej aluminiowej płycie w 37 °C inkubator wilgotnościowy z 5% CO22 przez kolejne 40 h lub 4 h, odpowiednio dla testu końcowego i testu wnikania.
  9. W celu utrwalenia należy przemyć dołki buforem PBS, używając automatycznego myjki do płytek (użyć 200 µl/well płukanie przelewowe).
  10. Wymień PBS na 50 µl 3,7% paraformaldehyd w 0,2 M HEPES o pH 7,4 (PFA) przy użyciu automatycznego myjacza do płytek.
    Uwaga: Ostrożnie: PFA jest toksyczny w przypadku wdychania, kontaktu ze skórą oraz połknięcia.
  11. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
  12. Wymień medium utrwalające na 50 µl PBS za pomocą automatycznej myjki do płytek. Uwaga: próbki są już gotowe do wyniesienia z laboratorium poziomu BSL3, jeśli jest to wymagane.
    Uwaga: Wywożenie jakiejkolwiek próbki z placówki poziomu BSL3 podlega ocenie ryzyka oraz walidacji procedury i jest uzależnione od obowiązujących przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

4. Barwienie

  1. Przemyć komórki dwukrotnie 50 µl PBS.
  2. Przeprowadzić permeabilizację komórek w 50 µl 0,1% Triton-X-100 w PBS przez 10 min.
  3. Przemyć komórki trzykrotnie PBS. Dodać 20 µl PBS zawierającego 1 µg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć komórki trzykrotnie w PBS i zabezpieczyć barwienie przed światłem za pomocą folii aluminiowej.

5. Obrazowanie

  1. Przygotuj zautomatyzowany mikroskop szerokopolowy do akwizycji obrazów.
    Uwaga: Poniżej opisano ustawienia dla mikroskopu Molecular Device ImageXpress z wykorzystaniem oprogramowania MetaXpress. Można użyć alternatywnych urządzeń do mikroskopii szerokopolowej 2D o odpowiednich specyfikacjach sprzętowych i oprogramowaniu do obrazowania (szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów/sprzętu).
    1. Wybierz obiektyw 10X, binning kamery = 1, wzmocnienie (gain) = 1.
    2. Wybierz format płytki odpowiadający płytce 384-dołkowej.
    3. Wykonaj akwizycję 9 pól na dołek.
    4. Użyj funkcji „Enable laser based focus” oraz „Focus on plate and well bottom”.
    5. Ustaw „First well” jako dołek początkowy do znalezienia próbki oraz „All sites” dla autofokusa pól.
    6. Użyj kanału DAPI do ręcznego ustawienia przesunięcia Z (Z-Offset) dla ostrości.
    7. Ręcznie wybierz Z-Offset z kanału DAPI dla wszystkich pozostałych kanałów.
    8. Ręcznie skoryguj czas ekspozycji dla wszystkich kanałów, aby zapewnić szeroki zakres dynamiczny przy niskim prześwietleniu.
      1. Wykonaj obraz reprezentatywnego pola przy użyciu funkcji automatycznej ekspozycji. Użyj tego czasu ekspozycji do obrazowania 3-5 pól w całej płytce i ręcznie dostosuj czas ekspozycji, aż najjaśniejsze piksele osiągną ~80% maksymalnej jasności we wszystkich polach.
    9. Obrazuj całą płytkę przy użyciu kanałów DAPI i GFP dla testu końcowego. Dla testu wejściowego wybierz dodatkowo kanał RFP.

6. Zautomatyzowana analiza obrazu

Uwaga: Program CellProfiler 215 jest wykorzystywany jako oprogramowanie do analizy obrazu w celu segmentacji obiektów komórkowych i bakteryjnych oraz wykonywania zautomatyzowanych pomiarów w ramach zidentyfikowanych obiektów. Oprogramowanie udostępnia algorytmy analizy obrazu w oddzielnych modułach, które można łączyć w potoki (pipelines) wykonujące moduły sekwencyjnie na wszystkich obrazach, aby automatycznie zrealizować określone zadanie analizy obrazu. Aby postępować zgodnie z protokołem, należy zainstalować wersję CellProfiler 2.1.1 lub nowszą. Następnie należy wczytać dostarczony potok i postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami, aby dostosować wymagane parametry w modułach. Opis poszczególnych modułów wszystkich potoków znajduje się w Plikach Uzupełniających.

Uwaga: Dla każdego testu wykorzystywane są dwa oddzielne procesy (pipeline'y). Pierwszy proces oblicza model cieniowania, który jest wykorzystywany przez drugi proces do korekcji obrazów przed analizą. Korekcja cieniowania jest stosowana do obrazów w celu zminimalizowania efektów niejednorodnej ścieżki świetlnej z mikroskopu. Obliczanie modelu cieniowania w pierwszym procesie jest czasochłonne, ale pozwala na uzyskanie wyników o wyższej dokładności.

  1. Analiza końcowa (Endpoint Assay)
    1. Obliczanie modelu cieniowania
      1. Przejdź do menu "File", wybierz "Import" → "Pipeline from File…" i wybierz dostarczony pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". W odpowiedzi na pytanie o konwersję starego pipeline'u wybierz "Don't convert".
      2. Przejdź do "Output" → "View output settings" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla powstałych modeli cieniowania.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę parametru "Text that these images have in common" tak, aby odpowiadała nazwom obrazów.
      4. Upewnij się, że żaden z modułów nie wyświetla podglądu przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oka obok modułów. Uwaga: znacząco zmniejsza to zapotrzebowanie na zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania pipeline'u.
      5. Naciśnij "Analyze Images", aby rozpocząć obliczanie modelu cieniowania.
    2. Przeprowadzenie analizy obrazu
      1. Przejdź do menu "File", wybierz "Import" → "Pipeline from File…" i wybierz dostarczony pipeline "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". W odpowiedzi na pytanie o konwersję starego pipeline'u wybierz "Don't convert".
      2. Przejdź do "Output" → "View output settings" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla wynikowej arkusza kalkulacyjnego.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę parametru "Text that these images have in common" tak, aby odpowiadała nazwom obrazów.
      4. W module (2) "LoadSingleImage" załaduj modele cieniowania obliczone w punkcie 6.1.1, wybierając lokalizację i nazwy plików dwóch modeli cieniowania.
      5. W modułach (4) - (5) "ImageMath" dostosuj parametr "Multiply the first image by" zgodnie z głębokością bitową kamery mikroskopu. Dla obrazów 8 i 16-bitowych ustaw parametr na "1.0", dla obrazów 12-bitowych ustaw parametr na "16.0".
      6. W module (9) "ImageMath" dostosuj parametr "Multiply the second image by" do wartości (zacznij od 0,25), która stłumi sygnał Brucella w barwieniu DAPI bez tłumienia jąder komórkowych.
        1. Kliknij "Start Test Mode", a następnie aktywuj symbol pauzy i funkcję wyświetlania dla modułu (9), klikając odpowiednie ikony modułu.
          Uwaga: symbol pauzy pojawi się w kolorze żółtym, a symbol oka pokaże otwarte oko, jeśli zostanie aktywowany.
        2. Kliknij "Run", aby uruchomić analizę do modułu (9) z aktywnym symbolem pauzy. Aby przetestować wartości dla modułu, naciśnij "Step".
        3. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarty obraz i ustaw "Image contrast" na "Log normalized". Wielokrotnie wracaj do modułu (9), dostosuj parametr "Multiply the second image by" i ponownie przejdź przez moduł, aż sygnał Brucella zostanie całkowicie stłumiony, a jednocześnie zminimalizowane zostaną czarne obszary wskazujące na nadmierne odejmowanie w obrazie wynikowym.
      7. W module (10) "IdentifyPrimaryObjects" ustaw parametr "Lower bound on threshold" na tyle wysoko (zacznij od zera), aby jądra były segmentowane, a tło ignorowane.
        1. Aby wyznaczyć odpowiednią wartość dla modułu (10), przejdź przez moduł i wyświetl obraz wejściowy zgodnie z opisem w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2.
        2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram.
          Uwaga: szczyt histogramu zazwyczaj wskazuje tło.
        3. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż zostanie osiągnięta prawidłowa segmentacja jąder, co będzie widoczne na obrazie wyjściowym.
          Uwaga: ustawienie progu powyżej intensywności tła jest szczególnie ważne dla pustych pól.
      8. W module (15) "FilterObjects" dostosuj parametr "Minimum value" tak, aby zachować komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze, a pozostałe odfiltrować. W tym kroku zignoruj Brucella poza jądrem.
        1. Aby wyznaczyć odpowiednią wartość, przejdź przez moduł i wyświetl obraz wyjściowy zgodnie z opisem w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2. Zacznij od zera, co zidentyfikuje wszystkie komórki jako zainfekowane, i zwiększaj wartość małymi krokami, aż zostaną zachowane tylko komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze.
      9. W module (16) "FilterObjects" dostosuj parametr "Minimum value" tak, aby zachować komórki z wyraźnie widoczną Brucella w okolicy perinuklearnej, a pozostałe komórki odfiltrować. Zastosuj podejście analogiczne do poprzedniego modułu.
      10. W module (17) "FilterObjects" dostosuj parametr "Minimum value" tak, aby zachować komórki z wyraźnie widoczną Brucella w obrębie ciała komórki Voronoi, a pozostałe komórki odfiltrować. Zastosuj podejście analogiczne do poprzedniego modułu.
        Uwaga: ciało komórki Voronoi to radialne rozszerzenie jądra o 25 pikseli, bez nakładania się na sąsiednie ciała komórek Voronoi.
      11. Wyjdź z trybu testowego i upewnij się, że żaden z modułów nie wyświetla podglądu przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oka obok modułów.
        Uwaga: znacząco zmniejsza to zapotrzebowanie na zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania pipeline'u.
      12. Naciśnij "Analyze Images", aby rozpocząć analizę.
      13. Po zakończeniu analizy sprawdź wynikowe obrazy PNG oraz arkusz CSV, aby upewnić się, że analiza przebiegła niezawodnie na całej płytce.
  2. Analiza wniknięcia (Entry Assay)
    1. Obliczanie modelu cieniowania
      1. Przejdź do menu "File", wybierz "Import" → "Pipeline from File…" i wybierz dostarczony pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". W odpowiedzi na pytanie o konwersję starego pipeline'u wybierz "Don't convert".
      2. Przejdź do "Output" → "View output settings" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla powstałych modeli cieniowania.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę parametru "Text that these images have in common" tak, aby odpowiadała nazwom obrazów.
      4. Upewnij się, że żaden z modułów nie wyświetla podglądu przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oka obok modułów.
        Uwaga: znacząco zmniejsza to zapotrzebowanie na zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania pipeline'u.
      5. Naciśnij "Analyze Images", aby rozpocząć obliczanie modelu cieniowania.
    2. Przeprowadzenie analizy obrazu
      1. Przejdź do menu "File", wybierz "Import" → "Pipeline from File…" i wybierz dostarczony pipeline "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". W odpowiedzi na pytanie o konwersję starego pipeline'u wybierz "Don't convert".
      2. Przejdź do "Output" → "View output settings" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla wynikowej arkusza kalkulacyjnego.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę parametru "Text that these images have in common" tak, aby odpowiadała nazwom obrazów.
      4. W module (2) "LoadSingleImage" załaduj modele cieniowania obliczone w punkcie 6.2.1, wybierając lokalizację i nazwy plików dwóch modeli cieniowania.
      5. W modułach (4) - (5) "ImageMath" dostosuj parametr "Multiply the first image by" zgodnie z głębokością bitową kamery mikroskopu. Dla obrazów 8 i 16-bitowych ustaw parametr na "1.0", dla obrazów 12-bitowych ustaw parametr na "16.0".
      6. W module (6) "IdentifyPrimaryObjects" ustaw parametr "Lower bound on threshold" na tyle wysoko, aby segmentowane były tylko jądra, a tło było ignorowane.
        1. Aby wyznaczyć odpowiednią wartość dla modułu (6), przejdź przez moduł i wyświetl obraz wejściowy zgodnie z opisem w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2.
        2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram.
          Uwaga: szczyt histogramu zazwyczaj wskazuje tło.
        3. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż zostanie osiągnięta prawidłowa segmentacja jąder, co będzie widoczne na obrazie wyjściowym.
          Uwaga: ustawienie progu powyżej tła jest ważne dla pustych pól.
      7. W module (8) "IdentifyPrimaryObjects" ustaw parametr "Lower bound on threshold" na tyle wysoko, aby segmentowane były tylko Brucella, a tło było ignorowane.
        1. Aby wyznaczyć odpowiednią wartość dla modułu (8), przejdź przez moduł i wyświetl obraz wejściowy zgodnie z opisem w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2.
        2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram.
          Uwaga: szczyt histogramu zazwyczaj wskazuje tło.
        3. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż zostanie osiągnięta prawidłowa segmentacja Brucella, co będzie widoczne na obrazie wyjściowym.
          Uwaga: ustawienie progu powyżej tła jest ważne dla pustych pól.
      8. W module (11) "FilterObjects" dostosuj parametr "Minimum value" tak, aby odfiltrować tło i artefakty, zachowując jedynie kolonie Brucella.
        1. Aby wyznaczyć odpowiednią wartość, przejdź przez moduł i wyświetl obraz wyjściowy zgodnie z opisem w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2. Zacznij od wartości wybranej w 6.2.2.7 i stopniowo ją zwiększaj, aż zostaną zachowane tylko obiekty Brucella.
      9. Wyjdź z trybu testowego i upewnij się, że żaden z modułów nie wyświetla podglądu przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oka obok modułów.
        Uwaga: znacząco zmniejsza to zapotrzebowanie na zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania pipeline'u.
      10. Naciśnij "Analyze Images", aby rozpocząć analizę.
      11. Po zakończeniu analizy sprawdź wynikowe obrazy PNG oraz arkusz CSV, aby upewnić się, że analiza przebiegła prawidłowo na całej płytce.

7. Ocena stopnia infekcji

Uwaga: siRNA, które mają istotny wpływ na żywotność komórek, należy rozważać z ostrożnością, ponieważ może to prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. Zmieniona liczba komórek wpływa na rzeczywistą wartość MOI, a celowanie w geny niezbędne może wywoływać efekty plejotropowe w przebiegu infekcji patogenem. Choć niepełne wyciszenie za pomocą siRNAs pozwala na badanie genów niezbędnych, takie cele muszą zostać zwalidowane alternatywnymi metodami (np. poprzez interferencję farmakologiczną), aby potwierdzić ich rolę jako czynników gospodarza podczas infekcji.

  1. Analiza punktu końcowego (Endpoint Assay)
    1. Otwórz arkusz CSV wygenerowany w kroku 6.1.2.12 i oblicz wskaźnik infekcji dla każdej studni, dzieląc liczbę zainfekowanych komórek (odczyt CellProfiler: "Count_InfectedCells") przez całkowitą liczbę komórek (odczyt CellProfiler: "CountNuclei"). Jeśli obrazowano wiele pól w jednej studni, najpierw zsumuj wszystkie pola dla każdej studni, aby uzyskać całkowitą liczbę zainfekowanych komórek oraz całkowitą liczbę komórek na studnię.
    2. Przeprowadź normalizację za pomocą wyniku Z (Z-score), aby uwzględnić różnice między płytkami, jeśli płytki zawierają wystarczającą liczbę siRNA niebędących trafieniami (non-hit siRNAs). Przyjmuje się, że liczba siRNA niebędących trafieniami na płytce jest wystarczająca w przypadku przesiewania pełnych bibliotek.
      figure-protocol-1
  2. Analiza wnikania (Entry Assay)
    1. Otwórz arkusz CSV wygenerowany w kroku 6.2.2.10 i oblicz wskaźnik infekcji dla każdej studni, dzieląc liczbę zainfekowanych komórek (odczyt CellProfiler: "Count_InfectedCells") przez całkowitą liczbę komórek (odczyt CellProfiler: "CountNuclei"). Jeśli obrazowano wiele pól w jednej studni, najpierw zsumuj wszystkie pola dla każdej studni, aby uzyskać całkowitą liczbę zainfekowanych komórek oraz całkowitą liczbę komórek na studnię.
    2. Aby określić ładunek bakteryjny zainfekowanych komórek, oszacuj średnią powierzchnię zajmowaną przez bakterie wewnątrzkomórkowe w przeliczeniu na jedną zainfekowaną komórkę. W tym celu podziel całkowitą powierzchnię wszystkich bakterii wewnątrzkomórkowych nakładających się na komórki (odczyt CellProfiler: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") przez liczbę zainfekowanych komórek w tym polu. Aby wyeliminować artefakty, jako odczyt dla studni przyjmij medianę wszystkich pól dla tego odczytu.
      Uwaga: Jeśli analiza ta jest stosowana jako analiza pogłębiona obejmująca dużą liczbę genów zaangażowanych w infekcję Brucella, nie stosuj normalizacji wynikiem Z. Zamiast tego przeprowadź normalizację, używając studni kontrolnych (mock) jako referencji, aby uwzględnić różnice między płytkami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1A przedstawia przykład analizy obrazu wykorzystywanej do automatycznej identyfikacji zakażonych komórek w teście końcowym. Zidentyfikowano jądra komórek HeLa barwione DAPI, a następnie wyznaczono obszar okojądrowy o szerokości 8 pikseli otaczający jądro oraz ciało komórki w układzie Voronoi poprzez rozszerzenie jądra o 25 pikseli. Ponieważ bakterie proliferują głównie w przestrzeni okojądrowej, intensywność GFP w tym obszarze komórki jest najbardziej wiarygodnym p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Patogeny bakteryjne wyewoluowały wiele strategii manipulowania eukariotycznymi komórkami gospodarza na swoją korzyść. Patogeny wywołujące ostre infekcje często wykazują szybką proliferację, której towarzyszy znaczne zaniepokojenie układu odpornościowego i utrata żywotności zakażonych komórek. W przeciwieństwie do tego, bruceloza i inne patogeny powodujące przewlekłe infekcje są w stanie nawiązać długotrwałe interakcje w komórkach gospodarza. Dlatego bakterie muszą precyzyjnie dostroić funkcje komórek gospodarza ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty 51RT 0_126008 i 51RTP0_151029 dla projektu badawczo-technologicznego (RTD) InfectX i TargetInfectX, odpowiednio, w ramach SystemsX.ch, Szwajcarskiej Inicjatywy na rzecz Biologii Systemów. Potwierdzamy 310030B_149886 grantów Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNSF). Prace S.H.L i A.C. były wspierane przez Międzynarodowy Program Doktorancki "Fellowships for Excellence" Biozentrum. Simone Muntwiler jest znana z pomocy technicznej. Chcielibyśmy podziękować Dirkowi Bumannowi za dostarczenie pNF106 oraz Jeanowi Celli za pJC43 i pJC44.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar sojowy tryptyczny (TSA)BD236950
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)Fluka22092
Siarczan kanamycynySigma-Aldrich60615
Odtłuszczone mleko
250 ml butelka z nakrętkąCorning8396
DMEMSigma-AldrichD5796
Płód Surowica cielęca (FCS)Gibco10270Inaktywowana termicznie
trypsyna-EDTA (0,5%)Gibco15400-05410x roztwór podstawowy, rozcieńczony 1:10 w PBS
Scepte 2.0 Licznik komórekMerck MiliporePHCC20060Można użyć alternatywnych urządzeń do liczenia komórek
Greiner CELLSTAR 384-dołkowa płytkaSigma-AldrichM2062
Zrywalna folia aluminiowaCostar6570
Dozownik odczynników: "Dozownik odczynników Multidrop 384"Thermo Scientific5840150Można użyć alternatywnego dozownika odczynników.
Odczynnik do transfekcji: "Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778-150
Automatyczna myjka do płytek: "Podkładka do płytek ELx50-16"BioTekELX5016Ta podkładka do płytek zawiera 16-kanałowy kolektor odpowiedni dla płytek 384-dołkowych. Mieści się w komorze bezpieczeństwa biologicznego i posiada pokrywę zakrywającą płytkę podczas mycia, co zmniejsza ryzyko produkcji aerozolu. Można zastosować alternatywne podkładki płytowe o podobnych właściwościach.
GentamycynaSigma-AldrichG1397
Chlorowodorek anhydrotetracyklinySigma-Aldrich37919100 μ g/ml roztworu w 100% etanolu utrzymuje się w temperaturze -20 & stopni; C zabezpieczone przed światłem w folii aluminiowej
PBSGibco20012
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Rozpuścić w 0,2 M buforze HEPES, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C i rozmrozić świeżo dzień przed użyciem. Uwaga, PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.
HEPESSigma-AldrichH3375
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPIRoche10236276001
Zaszyfrowane siRNADharmaconD-001810-10
Kif11 siRNADharmaconL-003317-00
ARPC3 siRNADharmaconL-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)Celli et al.12
pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)Konstrukcja: pJC44 4 trawiono za pomocą EcoRI, a następnie wytwarzano końce enzymem Klenova, a następnie trawiono SalI. TetR-GFP amplifikowano z pNF106 przy użyciu startera prAC090 i prAC092. Po trawieniu z SalI, produkt TetR-GFP podwiązano do strawionego wektora pJC44.
Podkład prAC090Sigma-AldrichTTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092Sigma-AldrichTTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT
TC HeLa CCL-2ATCCCCL-2
ImageXpress MicroMolecular Devices IXM IMAGING MSCOPEZautomatyzowany mikroskop do obrazowania komórkowego wyposażony w precyzyjny, zmotoryzowany stolik Z. Można zastosować alternatywne systemy do mikroskopii automatycznej oraz alternatywne komponenty do sprzętu i oprogramowania określone poniżej.
laserowe urządzenia molekularnez autofokusem1-2300-1037
Obiektyw CFI Super Fluor 10XNikon MRF00100N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Pryzmat: 10X, Sprężynowy
Fotometria CoolSNAP HQ Monochromatyczna kamera CCDUrządzenia molekularne 1-2300-10601,392 x 1,040 pikseli obrazowania, 6,45 x 6,45 i mikro; m pikseli, 12 bitów digitalizacja
Oprogramowanie MetaXpressMolecular Devices 9500-0100
LUI-Spectra-X-7LumencorSPECTRA X V-XXX-YZLekki silnik. Stosowane są następujące źródła światła: fioletowy (DAPI), cyjan (GFP), zielony/żółty (RFP)
Wzbudnica jednopasmowa do DAPISemrockFF01-377/50-25
Jednopasmowa emitera do DAPISemrockFF02-447/60-25
Jednopasmowa dichroiczna do DAPISemrockFF409-Di03-25x36
Jednopasmowa wzbudnica do GFPSemrockFF02-472/30-25
Emiter jednopasmowy do GFPSemrockFF01-520/35-25
Jednopasmowy dichroiczny do GFPSemrockFF495-Di03-25x36
zapytania ofertowegoSemrockFF01-562/40-25
Jednopasmowy emiter do RFPSemrockFF01-624/40-25
Jednopasmowy dichroiczny do RFPSemrockFF593-Di03-25x36
Szybkie   Wzbudnica jednopasmowa do

Bibliografia

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).
  10. Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162(2014).
  11. Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043(2013).
  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
  14. von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
  15. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interferencja RNAzautomatyzowana mikroskopiaanaliza obrazuCellProfilertest ko cowytest wnikania
Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.