Testy mikroskopowe do wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie komórek hela Brucellą

Podsumowanie

Opisano dwa testy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na mikroskopii czynników gospodarza związanych z infekcją Brucellą. Test wejściowy wykrywa czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucella, a test końcowy te, które są wymagane do replikacji wewnątrzkomórkowej. Chociaż ma zastosowanie do alternatywnych podejść, badania przesiewowe siRNA w komórkach HeLa są wykorzystywane do zilustrowania protokołów.

Streszczenie

Gatunki Brucella to fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe, które infekują zwierzęta jako ich naturalni gospodarze. Przenoszenie na ludzi jest najczęściej spowodowane bezpośrednim kontaktem z zakażonymi zwierzętami lub spożyciem skażonej żywności i może prowadzić do ciężkich przewlekłych infekcji.

Brucella może atakować profesjonalne i nieprofesjonalne komórki fagocytarne i replikować się w wakuolach pochodzących z retikulum endoplazmatycznego (ER). Czynniki gospodarza wymagane do wniknięcia Brucelli do komórek gospodarza, uniknięcia degradacji lizosomalnej i replikacji w kompartmencie podobnym do ER pozostają w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy dwa testy w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w wnikanie i replikację Brucelli w komórkach HeLa. Protokoły opisują wykorzystanie interferencji RNA, podczas gdy można zastosować alternatywne metody badań przesiewowych. Testy opierają się na wykrywaniu fluorescencyjnie znakowanych bakterii w znakowanych fluorescencyjnie komórkach gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii szerokokątnej. Obrazy fluorescencyjne są analizowane przy użyciu ustandaryzowanego potoku analizy obrazu w CellProfiler, który umożliwia ocenę infekcji na podstawie pojedynczych komórek.

W teście końcowym replikacja wewnątrzkomórkowa jest mierzona dwa dni po zakażeniu. Dzięki temu bakterie mogą przemieszczać się do swojej niszy replikacyjnej, gdzie proliferacja jest inicjowana około 12 godzin po wniknięciu bakterii. Brucella, która z powodzeniem stworzyła niszę wewnątrzkomórkową, będzie więc silnie namnażać się w komórkach gospodarza. Ponieważ bakterie wewnątrzkomórkowe znacznie przewyższają liczebnie pojedyncze zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe bakterie niereplikacyjne, można zastosować szczep konstytutywnie wyrażający GFP. Silny sygnał GFP jest następnie wykorzystywany do identyfikacji zakażonych komórek.

Natomiast dla testu wejściowego niezbędne jest rozróżnienie między bakteriami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi. W tym przypadku stosuje się kodowanie szczepu dla GFP indukowanego tetracykliną. Indukcja GFP przy jednoczesnej inaktywacji bakterii zewnątrzkomórkowych przez gentamycynę umożliwia różnicowanie bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych na podstawie sygnału GFP, przy czym tylko bakterie wewnątrzkomórkowe są zdolne do ekspresji GFP. Pozwala to na solidne wykrywanie pojedynczych bakterii wewnątrzkomórkowych przed rozpoczęciem proliferacji wewnątrzkomórkowej.

Wprowadzenie

Gatunki Brucella to gram-ujemne, fakultatywne patogeny wewnątrzkomórkowe należące do klasy α-Proteobacteria. Powodują poronienia i bezpłodność u swoich naturalnych żywicieli, takich jak bydło, kozy lub owce, powodując poważne straty ekonomiczne na obszarach endemicznych. Bruceloza jest jedną z najważniejszych chorób odzwierzęcych na świecie, powodującą rocznie ponad pół miliona nowych zakażeń u ludzi¹. Przeniesienie na człowieka jest najczęściej spowodowane bezpośrednim kontaktem z zakażonymi zwierzętami lub spożyciem skażonej żywności, takiej jak niepasteryzowane mleko. Objawy choroby gorączkowej są niespecyficzne, co powoduje trudności w rozpoznaniu brucelozy. Nieleczona choroba może doprowadzić do rozwoju przewlekłej infekcji z poważniejszymi objawami, takimi jak zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia i neuropatia².

Na poziomie komórkowym Brucella jest w stanie atakować komórki fagocytarne i niefagocytarne oraz replikować się w obrębie wewnątrzkomórkowego przedziału znanego jako wakuola zawierająca Brucellę (BCV). Internalizacja bakterii wymaga rearanżacji cytoszkieletu aktynowego przez Rac, Rho i bezpośrednią aktywację Cdc42³. Wewnątrz eukariotycznej komórki gospodarza BCV przemieszcza się wzdłuż szlaku endocytarnego i pomimo interakcji z lizosomami bakteriom udaje się uniknąć degradacji⁴. Zakwaszenie BCV przez pęcherzykową ATPazę jest wymagane do indukowania ekspresji bakteryjnego systemu wydzielania typu IV (T4SS)⁵. Uważa się, że efektory bakteryjne wydzielane przez T4SS są niezbędne do utworzenia przez Brucellę niszy replikacyjnej, ponieważ delecja T4SS⁶ lub hamowanie pęcherzykowej ATPazy prowadzi do wad w tworzeniu niszy wewnątrzkomórkowej⁷. Bakterie nie replikują się w fazie transportu, dopóki nie dotrą do przedziału wakuolarnego^{pochodzącego} z ER 8. Gdy dojdzie do proliferacji wewnątrzkomórkowej, BCV znajduje się w ścisłym związku z markerami ER, takimi jak kalneksyna i glukozo-6-fosfataza⁶.

Mechanizmy molekularne, dzięki którym Brucella dostaje się do komórek, unika degradacji lizosomalnej i w końcu replikuje się w komorze podobnej do ER, pozostają w dużej mierze nieznane. Czynniki gospodarza zaangażowane w różne etapy infekcji zostały zidentyfikowane głównie za pomocą metod celowanych lub badania przesiewowego małego interferującego RNA (siRNA) na małą skalę przeprowadzonego w komórkach Drosophila ⁹. Rzuciły one światło na udział poszczególnych czynników gospodarza w zakażeniu Brucellą, ale nadal jesteśmy dalecy od pełnego zrozumienia całego procesu.

Tutaj przedstawione są protokoły, które pozwalają na identyfikację czynników ludzkich gospodarzy za pomocą badań przesiewowych interferencji RNA (RNAi) na dużą skalę w połączeniu z automatyczną mikroskopią fluorescencyjną o szerokim polu widzenia i automatyczną analizą obrazu. Odwrotna transfekcja siRNA komórek HeLa jest wykonywana zgodnie z wcześniejszym opisem^10,11 z niewielkimi modyfikacjami. Test punktu końcowego obejmuje dużą część wewnątrzkomórkowego cyklu życia Brucelli, z wyjątkiem wyjścia i infekcji sąsiednich komórek. Aby dokładniej scharakteryzować trafienia zidentyfikowane w teście punktu końcowego, stosuje się zmodyfikowany protokół identyfikacji czynników zaangażowanych we wczesne etapy infekcji.

Szczep Brucella abortus, który konstytutywnie wyraża GFP, jest używany do testu końcowego, w którym bakterie mogą infekować komórki przez dwa dni. W tym czasie bakterie dostają się do komórek, przemieszczają się do niszy replikacyjnej pochodzącej z ER i replikują się w przestrzeni okołojądrowej. Wysoki poziom sygnału GFP może być następnie wykorzystany do niezawodnego wykrywania pojedynczych komórek, które zawierają replikujące się bakterie.

Aby zbadać wejście Brucella do wysokoprzepustowego testu, ważne jest, aby móc rozróżnić bakterie wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Przedstawiona tutaj metoda omija różnicowe barwienie przeciwciałami bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych. Opiera się na szczepie Brucella wykazującym ekspresję GFP indukowanego tetracykliną w połączeniu z konstytutywną ekspresją dsRed. Obecność składowego markera dsRed pozwala na identyfikację wszystkich bakterii obecnych w próbce. Ekspresja GFP jest indukowana przez dodanie nietoksycznego analogu tetracykliny anhydrotetracykliny (aTc) jednocześnie z inaktywacją bakterii zewnątrzkomórkowych przez gentamycynę (Gm). Podczas gdy nieprzepuszczalny dla komórek antybiotyk Gm zabija bakterie zewnątrzkomórkowe, aTc może dostać się do komórki gospodarza i selektywnie indukować ekspresję GFP w bakteriach wewnątrzkomórkowych. Ten podwójny reporter umożliwia solidne oddzielenie pojedynczych bakterii wewnątrzkomórkowych (sygnał GFP i dsRed) od bakterii zewnątrzkomórkowych (tylko sygnał dsRed) przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Aby osiągnąć wykrywalną ekspresję GFP przez wewnątrzkomórkową Brucellę, stwierdziliśmy, że 4 godziny indukcji przez aTc dają wiarygodny sygnał. Podobne schematy indukcji do selektywnej ekspresji GFP w bakteriach wewnątrzkomórkowych były wcześniej wykorzystywane do badania wewnątrzkomórkowego Shigella¹².

Protokół

Uwaga: Wszystkie prace z żywymi szczepami Brucella abortus muszą być wykonywane w laboratorium o 3 poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL3), biorąc pod uwagę wszystkie wymagane przepisy i środki ostrożności.

1. Przygotowanie płytek przesiewowych oraz hodowla bakterii i komórek

1. Przygotowanie kultur starterowych Brucella abortus
   1. Smuga Brucella abortus 2308 (B. abortus) z wywaru mlecznego w temperaturze -80 °C na płytce z agarem sojowym tryptycznym (TSA) zawierającej 50 μg/ml kanamycyny (TSA/km). Inkubować płytkę przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C. Użyć szczepu Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT::GFP)¹³ do testu końcowego i szczepu Brucella abortus pAC042.08 (apht::d sRed,tetO::tetR-GFP) do testu wejściowego.
      Uwaga: Gładki lipopolisacharyd (LPS) Brucella abortus jest ważnym wyznacznikiem wirulencji, ale szorstkie mutanty mogą występować ze stosunkowo wysokimi częstotliwościami¹⁴. Dlatego zalecamy przetestowanie stanu szczepu hodowlanego przed rozpoczęciem tego eksperymentu.
   2. Ponownie umieścić bakterie na czterech płytkach TSA/Km pokrywających pełną płytkę i inkubować przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C.
   3. Za pomocą jednorazowej plastikowej pętli przenieś i ponownie zawieś bakterie z płytek TSA/Km w 10 ml 10% autoklawowanego odtłuszczonego mleka. Upewnij się, że bakterie są dobrze zawieszone, aby zapewnić stałe stężenia bakterii we wszystkich kulturach starterowych.
   4. Porcję 250 μl zawiesiny bakteryjnej rozlać do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C.
   5. Rozmrozić podwielokrotność kultury starterowej i przenieść 25 μl, 50 μl i 100 μl bakteryjnej kultury starterowej do oddzielnych butelek z zakrętką o pojemności 250 ml z 50 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) zawierającego 50 μg/ml kanamycyny (TSB/km). Zamknij butelki za pomocą Parafilm.
   6. Inkubować butelki przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min i temperaturze 37 °C.
   7. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀), aby określić objętość kultury starterowej wymaganą do osiągnięcia OD₆₀₀ = 0,8-1,1 po hodowli przez noc
   .
2. Przygotowanie komórek HeLa
   1. Hoduj komórki HeLa w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) (DMEM/10% FCS) w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .} Hoduj komórki do 80% zbieżności.
3. Przygotuj płytki przesiewowe z siRNA.
   1. Rozcieńczyć siRNA w wodzie wolnej od RNaz do końcowego stężenia 0,32 μM. Przenieść 5 μl/studzienkę na czarne, klarowne, płaskodenne płytki 384-dołkowe.
      1. Użyj kolumn 1, 2, 23 i 24 dla standardowych formantów. Do kontroli ujemnych należy użyć niedocelowego siRNA (zaszyfrowanego) i pozorowanych studzienek bez siRNA (tylko odczynnik do transfekcji). Do kontroli transfekcji należy użyć siRNA, które indukuje śmierć komórki (KIF11), a także kontroli pozytywnej znanych czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie Brucellą (np. ARPC3, składnik kompleksu Arp2/3 biorącego udział w polimeryzacji aktyny). Przenieś dostępne na rynku biblioteki siRNA lub niestandardowe siRNA do pozostałych studzienek.
      2. Uszczelnij płyty zdzieralnymi foliami aluminiowymi. Przechowywać talerze w temperaturze -20 °C.
         Uwaga: Płyty można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy, a nawet do lat, w zależności od zaleceń producenta.

2. Odwrotna transfekcja siRNA

1. Rozmrażać czarną 384-dołkową płytkę przez odwirowanie przy 300 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Spowoduje to sprowadzenie całej cieczy, która może przylgnąć do pokrywy lub boku studzienek.
2. Przygotować pożywkę do transfekcji, rozcieńczając odczynnik do transfekcji w stosunku 1:200 w DMEM bez FCS w temperaturze pokojowej. Przygotuj pożywkę do transfekcji nie później niż 20 minut przed użyciem. Ostrożnie wymieszaj roztwór przed użyciem.
3. Dodać 25 μl pożywki do transfekcji do każdego dołka za pomocą dozownika odczynnika i wymieszać roztwory, przesuwając płytkę do przodu i do tyłu.
4. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksu siRNA/odczynnika do transfekcji.
5. W międzyczasie przygotuj komórki HeLa, przemywając sub-zlewające się komórki kolby o średnicy 75^cm2 raz 2,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA w PBS (trypsyna).
6. Dodać 1,5 ml świeżej trypsyny i przenieść kolbę do temperatury 37 °C na 2-3 minuty, aż komórki się zaokrąglą.
7. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM/16% FCS.
8. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i przygotuj zawiesinę komórek 10 000 komórek/ml w DMEM/16% FCS.
9. Dodaj 50 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki za pomocą dozownika odczynników, co daje 500 komórek/studzienkę.
10. Przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu, aby uzyskać równomierne rozłożenie komórek. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 5-10 minut, aby komórki się uspokoiły.
11. Uszczelnij płytkę Parafilmem i inkubuj ją przez 72 godziny na wstępnie ogrzanej aluminiowej płytce w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
    Uwaga: Wstępnie rozgrzana aluminiowa płyta umożliwia równomierny rozkład temperatury na całej płytce 384-dołkowej.

3. Infekcja i fiksacja

1. Na jeden dzień przed zakażeniem zaszczepić oznaczoną w ppkt 1.1.7 ilość kultury starterowej B. abortus w 50 ml pożywki TSB/Km w butelce z zakrętką o pojemności 250 ml. Zamknij butelkę Parafilmem i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 °C i 100 obr./min na wytrząsarce orbitalnej do OD₆₀₀ = 0,8-1,1.
2. Zmierzyć OD₆₀₀ w kulturze bakteryjnej i przygotować pożywkę infekcyjną, rozcieńczając kulturę bakteryjną w DMEM/10% FCS, aby osiągnąć pożądaną wielokrotność infekcji (MOI).
   Uwaga: Aby uzyskać wskaźnik infekcji 5-10% w komórkach HeLa, stosuje się MOI 10 000. Dla każdego typu komórek należy wykonać krzywą miareczkowania MOI, aby uzyskać optymalne wskaźniki infekcji.
3. Wymienić pożywkę transfekcyjną z płytki 384-dołkowej na 50 μl pożywki infekcyjnej za pomocą automatycznej myjki do płytek.
4. Odwirować płytkę 384-dołkową przy 400 x g i temperaturze 4 °C przez 20 min.
   Uwaga: Pomaga to zsynchronizować proces infekcji.
5. Uszczelnij płytkę Parafilmem i inkubuj ją na wstępnie ogrzanej aluminiowej płytce w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 4 godziny.
6. Umyj komórki DMEM/10% FCS zawierającym 100 μg/ml Gm w celu inaktywacji bakterii zewnątrzkomórkowych za pomocą automatycznej myjki do płytek (użyć 200 μl/studzienka do płukania przelewowego).
   Uwaga: Podczas mycia przelewowego automatyczna myjka do płyt jednocześnie dozuje i zasysa medium.
7. W celu przeprowadzenia testu wejściowego należy przemyć komórki po raz drugi DMEM/10% FCS zawierającym 100 μg/ml Gm i 100 ng/ml aTc przy użyciu automatycznej myjki płytkowej (użyć 200 μl/studzienkę do płukania przelewowego).
8. Uszczelnić płytkę Parafilmem i umieścić ją z powrotem na wstępnie ogrzanej aluminiowej płytce w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez kolejne 40 godzin lub 4 godziny, odpowiednio dla testu końcowego i testu wejściowego.
9. W celu utrwalenia umyć studzienki PBS za pomocą automatycznej myjki płytowej (użyć 200 μl/płukanie przelewowe studzienki).
10. Wymienić PBS na 50 μl 3,7% paraformaldehydu w 0,2 M HEPES przy pH 7,4 (PFA) za pomocą automatycznej myjki do płyt.
    Uwaga: Uwaga: PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.
11. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
12. Wymienić medium utrwalające na 50 μl PBS za pomocą automatycznej podkładki do płyt. Uwaga: Próbki są teraz gotowe do wyjęcia z BSL3 w razie potrzeby.
    Ostrzeżenie: Usunięcie jakiejkolwiek próbki z obiektu BSL3 podlega ocenie ryzyka i walidacji procedury oraz zależy od obowiązujących przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

4. Barwienie

1. Przemyć komórki dwukrotnie 50 μl PBS.
2. Przepuszczać komórki w 50 μl 0,1% Triton-X-100 w PBS przez 10 min.
3. Umyj komórki trzykrotnie PBS. Dodać 20 μl PBS zawierającego 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Umyj komórki trzykrotnie w PBS i chroń plamy przed światłem folią aluminiową.

5. Obrazowanie

1. Konfiguracja automatycznego mikroskopu szerokokątnego do akwizycji obrazu.
   Uwaga: Ustawienia mikroskopu Molecular Device ImageXpress za pomocą oprogramowania MetaXpress są opisane poniżej. Można stosować alternatywne urządzenia do mikroskopii szerokokątnej 2D o odpowiednich specyfikacjach sprzętowych i oprogramowaniu do obrazowania (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów/sprzętu).
   1. Wybierz obiektyw 10X, binning kamery = 1, wzmocnienie = 1.
   2. Należy wybrać format płytki odpowiadający płytce 384-dołkowej.
   3. Zdobądź 9 witryn na odwiert.
   4. Użyj opcji "Włącz ostrość opartą na laserze" i "Ustaw ostrość na płycie i dnie studzienki".
   5. Ustaw "Pierwszą studzienkę" jako początkową studnię do znalezienia próbki i "Wszystkie witryny" dla autofokusa witryny.
   6. Użyj kanału DAPI, aby ręcznie ustawić przesunięcie Z dla ostrości.
   7. Ręcznie wybierz Z-Offset z DAPI dla wszystkich innych kanałów.
   8. Ręcznie skoryguj czas ekspozycji dla wszystkich kanałów, aby zapewnić szeroki zakres dynamiki przy niskim prześwietleniu.
      1. Uzyskaj obraz reprezentatywnego miejsca za pomocą funkcji automatycznej ekspozycji. Użyj tego czasu ekspozycji, aby zobrazować 3-5 miejsc na całej płycie i ręcznie dostosuj czas ekspozycji, aż najjaśniejsze piksele osiągną ~80% maksymalnej jasności we wszystkich miejscach.
   9. Zobrazuj pełną płytkę przy użyciu kanałów DAPI i GFP dla testu końcowego. Dla testu wejściowego należy dodatkowo wybrać kanał zapytania ofertowego.

6. Automatyczna analiza obrazu

Uwaga: CellProfiler 2¹⁵ jest używany jako oprogramowanie do analizy obrazu do segmentacji obiektów komórkowych i bakteryjnych oraz wykonywania automatycznych pomiarów w obrębie zidentyfikowanych obiektów. Oprogramowanie zapewnia algorytmy analizy obrazu w poszczególnych modułach, które można połączyć w potok, który będzie wykonywał moduły kolejno na wszystkich obrazach, aby automatycznie wykonać określone zadanie analizy obrazu. Aby postępować zgodnie z protokołem, zainstaluj program CellProfiler 2.1.1 lub nowszą wersję. Następnie załaduj dostarczony rurociąg i postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami, aby dostosować wymagane parametry w modułach. Opis poszczególnych modułów wszystkich pipeline'ów znajduje się w Plikach Uzupełniających.

Uwaga: Do każdego testu używane są dwa oddzielne rurociągi. Pierwszy potok oblicza model zacienienia, który jest używany przez drugi potok do korygowania obrazów przed analizą. Korekcja cieniowania jest stosowana do obrazów w celu zmniejszenia skutków niejednorodnej ścieżki światła z mikroskopu. Obliczanie modelu zacienienia w pierwszym potoku jest długotrwałym procesem, ale wyniki będą bardziej dokładne.

1. Test punktu końcowego
   1. Obliczanie modelu zacienienia
      1. Przejdź do menu "Plik", wybierz "Importuj" → "Potok z pliku..." i wybierz dostarczony potok "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Na pytanie, czy przekonwertować starszy potok, odpowiedz "Nie konwertuj".
      2. Przejdź do "Wyjście" → "Wyświetl ustawienia wyjściowe" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla wynikowych modeli cieniowania.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę "Tekstu, który te obrazy mają wspólne", aby pasował do nazw obrazów.
      4. Upewnij się, że żaden z modułów nie jest wyświetlany przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oczu obok modułów. Uwaga: To znacznie zmniejsza wymagane zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania potoku.
      5. Naciśnij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć obliczanie modelu zacienienia.
   2. Uruchamianie analizy obrazu
      1. Przejdź do menu "Plik", wybierz "Importuj" → "Potok z pliku..." i wybierz dostarczony potok "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Na pytanie, czy przekonwertować starszy potok, odpowiedz "Nie konwertuj".
      2. Przejdź do "Wyjście" → "Wyświetl ustawienia wyjściowe" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla wynikowego arkusza kalkulacyjnego.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę "Tekstu, który te obrazy mają wspólne", aby pasował do nazw obrazów.
      4. W module (2) "LoadSingleImage" załaduj modele cieniowania obliczone zgodnie z 6.1.1, wybierając lokalizację i nazwy plików dwóch modeli cieniowania.
      5. W modułach (4) - (5) "ImageMath" dostosuj parametr "Pomnóż pierwszy obraz przez" dopasowując głębię bitową kamery mikroskopu. Dla obrazów 8 i 16 bitowych ustaw parametr na "1.0", dla obrazów 12-bitowych ustaw parametr na "16.0".
      6. W module (9) "ImageMath" dostosuj parametr "Pomnóż drugi obraz przez" do wartości (zacznij od 0,25), która stłumi sygnał Brucella w barwieniu DAPI bez tłumienia jąder.
         1. Kliknij "Rozpocznij tryb testowy", a następnie aktywuj symbol pauzy i funkcję wyświetlania modułu (9), klikając odpowiednie ikony modułu.
            Uwaga: Symbol pauzy pojawi się na żółto, a symbol oka pokaże otwarte oko, jeśli zostanie aktywowany.
         2. Kliknij "Uruchom", aby uruchomić analizę do modułu (9) z aktywnym symbolem pauzy. Aby przetestować wartości modułu, naciśnij "Krok".
         3. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarty obraz i ustaw "Kontrast obrazu" na "Znormalizowany". Kilkakrotnie cofnij się do modułu (9), dostosuj parametr "Pomnóż drugi obraz przez" i ponownie przejdź przez moduł, aż sygnał Brucella zostanie całkowicie stłumiony, podczas gdy w tym samym czasie czarne obszary wskazujące na nadmierne odejmowanie są zminimalizowane na obrazie wynikowym.
      7. W module (10) "IdentifyPrimaryObjects" ustaw parametr "Dolna granica na progu" na tyle wysoko (zacznij od zera), aby jądra były segmentowane, a tło ignorowane.
         1. Aby zidentyfikować dobrą wartość dla modułu (10), przejdź nad modułem i wyświetl obraz wejściowy, jak wyjaśniono w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2.
         2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram.
            Uwaga: Szczyt histogramu zazwyczaj wskazuje tło.
         3. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż do uzyskania dobrej segmentacji jąder, jak pokazano na obrazie wyjściowym.
            Uwaga: ustawienie progu wyższego niż intensywność tła jest szczególnie ważne w przypadku pustych witryn.
      8. W module (15) "FilterObjects" dostosuj parametr "Wartość minimalna" tak, aby komórki z wyraźnie widoczną Brucella w jądrze zostały zachowane, a wszystkie inne zostały odfiltrowane. Na tym etapie zignoruj Brucellę poza jądrem.
         1. Aby zidentyfikować dobrą wartość, przejdź przez moduł i wyświetl obraz wyjściowy, jak wyjaśniono w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2. Zacznij od zera, które identyfikuje wszystkie komórki jako zainfekowane, i zwiększaj wartość małymi krokami, aż zostaną zachowane tylko komórki z wyraźnie widoczną Brucellą w jądrze.
      9. W module (16) "FilterObjects" dostosuj parametr "Wartość minimalna" tak, aby komórki z wyraźnie widoczną Brucellą w okołojądrze zostały zachowane, a wszystkie inne komórki zostały odfiltrowane. Zastosuj podobne podejście jak w poprzednim module.
      10. W module (17) "FilterObjects" dostosuj parametr "Wartość minimalna" tak, aby komórki z wyraźnie widoczną Brucellą w ciele komórki Voronoi zostały zachowane, a wszystkie inne komórki zostały odfiltrowane. Użyj podobnego podejścia jak w poprzednim module.
          Uwaga: Ciało komórki Woronoja jest promienistym przedłużeniem jądra o 25 pikseli, bez nakładania się na sąsiednie ciała komórek Woronoja.
      11. Wyjdź z trybu testowego i upewnij się, że żaden z modułów nie pokazuje swojego wyświetlacza przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oczu obok modułów.
          Uwaga: To znacznie zmniejsza wymagane zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania potoku.
      12. Naciśnij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć analizę.
      13. Po zakończeniu analizy sprawdź wynikowe obrazy PNG oraz arkusz CSV, aby upewnić się, że analiza działała niezawodnie na całej płycie.
2. Test wejściowy
   1. Obliczanie modelu zacienienia
      1. Przejdź do menu "Plik", wybierz "Importuj" → "Potok z pliku..." i wybierz dostarczony potok "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Na pytanie, czy przekonwertować starszy potok, odpowiedz "Nie konwertuj".
      2. Przejdź do "Wyjście" → "Wyświetl ustawienia wyjściowe" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla wynikowych modeli cieniowania.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę "Tekstu, który te obrazy mają wspólne", aby pasował do nazw obrazów.
      4. Upewnij się, że żaden z modułów nie jest wyświetlany przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oczu obok modules.
         Uwaga: To znacznie zmniejsza wymagane zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania potoku.
      5. Naciśnij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć obliczanie modelu zacienienia.
   2. Uruchamianie analizy obrazu
      1. Przejdź do menu "Plik", wybierz "Importuj" → "Potok z pliku..." i wybierz dostarczony potok "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Na pytanie, czy przekonwertować starszy potok, odpowiedz "Nie konwertuj".
      2. Przejdź do "Wyjście" → "Wyświetl ustawienia wyjściowe" i wybierz folder wejściowy z obrazami oraz folder wyjściowy dla wynikowego arkusza kalkulacyjnego.
      3. W module (1) "LoadImages" dostosuj nazwę "Tekstu, który te obrazy mają wspólne", aby pasował do nazw obrazów.
      4. W module (2) "LoadSingleImage" załaduj modele cieniowania obliczone zgodnie z 6.2.1, wybierając lokalizację i nazwy plików dwóch modeli cieniowania.
      5. W modułach (4) - (5) "ImageMath" dostosuj parametr "Pomnóż pierwszy obraz przez" dopasowując głębię bitową kamery mikroskopu. Dla obrazów 8 i 16 bitowych ustaw parametr na "1.0", dla obrazów 12-bitowych ustaw parametr na "16.0".
      6. W module (6) "IdentifyPrimaryObjects" ustaw parametr "Dolna granica na progu" na tyle wysoko, aby segmentowane były tylko jądra, a tło było ignorowane.
         1. Aby zidentyfikować dobrą wartość dla modułu (6), przejdź nad modułem i wyświetl obraz wejściowy, jak wyjaśniono w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2.
         2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram.
            Uwaga: Szczyt histogramu zazwyczaj wskazuje tło.
         3. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż do uzyskania dobrej segmentacji jąder, jak pokazano na obrazie wyjściowym.
            Uwaga: ustawienie progu powyżej tła jest ważne w przypadku pustych witryn.
      7. W module (8) "IdentifyPrimaryObjects" ustaw parametr "Dolna granica na progu" na tyle wysoko, aby tylko Brucella była segmentowana, a tło było ignorowane.
         1. Aby zidentyfikować dobrą wartość dla modułu (8), przejdź nad modułem i wyświetl obraz wejściowy, jak wyjaśniono w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2.
         2. Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz wejściowy i wyświetl histogram.
            Uwaga: Szczyt histogramu zazwyczaj wskazuje tło.
         3. Zaczynając od intensywności tła, zwiększaj parametr, aż do uzyskania dobrej segmentacji Brucelli, jak pokazano na obrazie wyjściowym.
            Uwaga: ustawienie progu powyżej tła jest ważne w przypadku pustych witryn.
      8. W module (11) "FilterObjects" dostosuj parametr "Wartość minimalna" tak, aby tło i artefakty były filtrowane i zachowywane były tylko kolonie Brucella.
         1. Aby zidentyfikować dobrą wartość, przejdź przez moduł i wyświetl obraz wyjściowy, jak wyjaśniono w krokach 6.1.2.6.1 i 6.1.2.6.2. Zacznij od wartości wybranej w 6.2.2.7 i stopniowo ją zwiększaj, aż zostaną zachowane tylko obiekty Brucella.
      9. Wyjdź z trybu testowego i upewnij się, że żaden z modułów nie pokazuje swojego wyświetlacza przed uruchomieniem pełnej analizy, odznaczając wszystkie symbole oczu obok modułów.
         Uwaga: To znacznie zmniejsza wymagane zasoby obliczeniowe podczas przetwarzania potoku.
      10. Naciśnij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć analizę.
      11. Po zakończeniu analizy sprawdź wynikowe obrazy PNG oraz arkusz CSV, aby upewnić się, że analiza działała prawidłowo na całej płycie.

7. Ocena infekcji

Uwaga: siRNA, które mają znaczący wpływ na żywotność komórek, muszą być brane pod uwagę z ostrożnością, ponieważ może to sprzyjać fałszywie pozytywnym odkryciom. Zmieniona liczba komórek wpływa na rzeczywisty MOI, a celowanie w niezbędne geny może mieć plejotropowy wpływ na infekcję patogenem. Podczas gdy niepełne zubożenie przez siRNA pozwala na badanie niezbędnych genów, takie cele muszą zostać zweryfikowane za pomocą alternatywnych metod (np. interferencji farmaceutycznej), aby potwierdzić ich rolę jako czynników gospodarza podczas infekcji.

1. Test punktu końcowego
   1. Otwórz arkusz CSV wygenerowany w kroku 6.1.2.12 i oblicz wskaźnik infekcji na studzienkę, dzieląc liczbę zakażonych komórek (odczyt CellProfiler: "Count_InfectedCells") przez całkowitą liczbę komórek (odczyt CellProfiler: "CountNuclei"). Jeśli zobrazowano wiele miejsc na studzienkę, najpierw zsumuj wszystkie miejsca dla każdej studzienki, aby zbudować liczbę zainfekowanych komórek na studnię i całkowitą liczbę komórek na studnię.
   2. Wykonaj normalizację punktacji Z, aby uwzględnić różnice między płytkami, jeśli płytki zawierają wystarczającą ilość nietrafionych siRNA. Załóżmy, że na płytkę przypada wystarczająca liczba nietrafionych siRNA, jeśli przesiewane są pełne biblioteki.
      
2. Test wejściowy
   1. Otwórz arkusz CSV wygenerowany w kroku 6.2.2.10 i oblicz wskaźnik infekcji na studzienkę, dzieląc liczbę zainfekowanych komórek (odczyt CellProfiler: "Count_InfectedCells") przez całkowitą liczbę komórek (odczyt CellProfiler: "CountNuclei"). Jeśli zobrazowano wiele miejsc na studzienkę, najpierw zsumuj wszystkie miejsca dla każdej studzienki, aby zbudować liczbę zainfekowanych komórek na studnię i całkowitą liczbę komórek na studnię.
   2. Aby określić ilościowo obciążenie bakteryjne zakażonych komórek, oszacuj średni obszar zajmowany przez bakterie wewnątrzkomórkowe na zakażoną komórkę. W tym celu należy podzielić zintegrowany obszar wszystkich bakterii wewnątrzkomórkowych nakładających się na komórki (odczyt CellProfiler: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") przez liczbę zakażonych komórek w tym miejscu. Aby uwzględnić artefakty, użyj mediany wszystkich miejsc tego odczytu jako odczytu studni.
      Uwaga: Jeśli ten test jest używany jako test kontrolny zawierający dużą liczbę genów zaangażowanych w zakażenie Brucellą, nie należy stosować normalizacji wyniku Z. Zamiast tego należy przeprowadzić normalizację przy użyciu próbnych studzienek jako odniesienia, aby uwzględnić zmienność między płytkami.

Wyniki

Rysunek 1A pokazuje przykład analizy obrazu używanej do automatycznej identyfikacji zainfekowanych komórek w teście końcowym. Zidentyfikowano jądra komórek HeLa barwionych DAPI, obliczono okołojądro o szerokości 8 pikseli otaczające jądro oraz ciało komórki Woronoja przez przedłużenie jądra o 25 pikseli. Ponieważ bakterie namnażają się głównie w przestrzeni okołojądrowej, intensywność GFP w tym obszarze komórki jest najbardziej wiarygodnym pomiarem pozwalającym na rozróżn...

Dyskusja

Patogeny bakteryjne wyewoluowały wiele strategii manipulowania eukariotycznymi komórkami gospodarza na swoją korzyść. Patogeny wywołujące ostre infekcje często wykazują szybką proliferację, której towarzyszy znaczne zaniepokojenie układu odpornościowego i utrata żywotności zakażonych komórek. W przeciwieństwie do tego, bruceloza i inne patogeny powodujące przewlekłe infekcje są w stanie nawiązać długotrwałe interakcje w komórkach gospodarza. Dlatego bakterie muszą precyzyjnie dostroić funkcje komórek gospodarza ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar sojowy tryptyczny (TSA)	BD	236950
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)	Fluka	22092
Siarczan kanamycyny	Sigma-Aldrich	60615
Odtłuszczone mleko
250 ml butelka z nakrętką	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Płód Surowica cielęca (FCS)	Gibco	10270	Inaktywowana termicznie
trypsyna-EDTA (0,5%)	Gibco	15400-054	10x roztwór podstawowy, rozcieńczony 1:10 w PBS
Scepte 2.0 Licznik komórek	Merck Milipore	PHCC20060	Można użyć alternatywnych urządzeń do liczenia komórek
Greiner CELLSTAR 384-dołkowa płytka	Sigma-Aldrich	M2062
Zrywalna folia aluminiowa	Costar	6570
Dozownik odczynników: "Dozownik odczynników Multidrop 384"	Thermo Scientific	5840150	Można użyć alternatywnego dozownika odczynników.
Odczynnik do transfekcji: "Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automatyczna myjka do płytek: "Podkładka do płytek ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Ta podkładka do płytek zawiera 16-kanałowy kolektor odpowiedni dla płytek 384-dołkowych. Mieści się w komorze bezpieczeństwa biologicznego i posiada pokrywę zakrywającą płytkę podczas mycia, co zmniejsza ryzyko produkcji aerozolu. Można zastosować alternatywne podkładki płytowe o podobnych właściwościach.
Gentamycyna	Sigma-Aldrich	G1397
Chlorowodorek anhydrotetracykliny	Sigma-Aldrich	37919	100 μ g/ml roztworu w 100% etanolu utrzymuje się w temperaturze -20 & stopni; C zabezpieczone przed światłem w folii aluminiowej
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Rozpuścić w 0,2 M buforze HEPES, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C i rozmrozić świeżo dzień przed użyciem. Uwaga, PFA jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Zaszyfrowane siRNA	Dharmacon	D-001810-10
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)			Celli et al.12
pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)			Konstrukcja: pJC44 4 trawiono za pomocą EcoRI, a następnie wytwarzano końce enzymem Klenova, a następnie trawiono SalI. TetR-GFP amplifikowano z pNF106 przy użyciu startera prAC090 i prAC092. Po trawieniu z SalI, produkt TetR-GFP podwiązano do strawionego wektora pJC44.
Podkład prAC090	Sigma-Aldrich		TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092	Sigma-Aldrich		TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT
TC HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molecular Devices	IXM IMAGING MSCOPE	Zautomatyzowany mikroskop do obrazowania komórkowego wyposażony w precyzyjny, zmotoryzowany stolik Z. Można zastosować alternatywne systemy do mikroskopii automatycznej oraz alternatywne komponenty do sprzętu i oprogramowania określone poniżej.
laserowe urządzenia molekularne	z autofokusem	1-2300-1037
Obiektyw CFI Super Fluor 10X	Nikon	MRF00100	N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Pryzmat: 10X, Sprężynowy
Fotometria CoolSNAP HQ Monochromatyczna kamera CCD	Urządzenia molekularne	1-2300-1060	1,392 x 1,040 pikseli obrazowania, 6,45 x 6,45 i mikro; m pikseli, 12 bitów digitalizacja
Oprogramowanie MetaXpress	Molecular Devices	9500-0100
LUI-Spectra-X-7	Lumencor	SPECTRA X V-XXX-YZ	Lekki silnik. Stosowane są następujące źródła światła: fioletowy (DAPI), cyjan (GFP), zielony/żółty (RFP)
Wzbudnica jednopasmowa do DAPI	Semrock	FF01-377/50-25
Jednopasmowa emitera do DAPI	Semrock	FF02-447/60-25
Jednopasmowa dichroiczna do DAPI	Semrock	FF409-Di03-25x36
Jednopasmowa wzbudnica do GFP	Semrock	FF02-472/30-25
Emiter jednopasmowy do GFP	Semrock	FF01-520/35-25
Jednopasmowy dichroiczny do GFP	Semrock	FF495-Di03-25x36
zapytania ofertowego	Semrock	FF01-562/40-25
Jednopasmowy emiter do RFP	Semrock	FF01-624/40-25
Jednopasmowy dichroiczny do RFP	Semrock	FF593-Di03-25x36