Artykuł metodologiczny

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

DOI:

10.3791/54353

⸱

9 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bell Research Center for Reproductive Health and Cancer, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Nagoya University Graduate School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonkowy rak jajnika (EOC) jest związany ze złym rokowaniem, ponieważ wykazuje rozsiew otrzewnowy. Aby poprawić rokowanie, ważne jest kontrolowanie rozsiewu otrzewnej. Jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób komórki nowotworowe odłączają się od zmian pierwotnych i przyczepiają się do międzybłonia. Konieczne jest stworzenie odpowiedniego modelu zwierzęcego, aby zrozumieć mechanizm rozsiewu otrzewnowej in vivo. W niniejszym badaniu wprowadzamy proces od miejscowego wstrzyknięcia komórek EOC do powierzchni jajnika myszy do rozwoju przerzutów, w tym do otrzewnej i odległych narządów. Wykorzystano samice nagich myszy (BALB/c nu/nu) w wieku 8 tygodni. W mikroskopijnym polu widzenia komórki EOC (1 x 105 komórek/μl hydrożelu na bazie średniej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)/jednostronny jajnik/mysz) wstrzyknięto do mysich jajników przez dostęp zaotrzewnowy od strony grzbietowej. Ta proponowana metoda jest mniej inwazyjną procedurą dla myszy i minimalizuje uszkodzenie jajnika. W tym miejscu opisujemy etapy metodologiczne w rozwoju pierwotnego i przerzutowego tworzenia się guza EOC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonkowy rak jajnika (EOC) odpowiada za najwyższy wskaźnik śmiertelności związanej z rakiem wśród nowotworów ginekologicznych1. EOC wiąże się ze złym rokowaniem, głównie ze względu na późną symptomatologię i często wiąże się z mnogim rozsiewem dootrzewnowym i przerzutami odległymi2-4. Rozsiew otrzewnowy jest procesem wieloetapowym. Po pierwsze, komórki nowotworowe odrywają się od zmian pierwotnych i migrują do jamy brzusznej. Kiedy komórki nowotworowe przyczepiają się do międzybłonka otrzewnej, zaczynają atakować tkanki przez międzybłonek5,6. Aby lepiej zrozumieć biologię guza (np. progresję raka i odpowiedź terapeutyczną), modele mysie dostarczają wielu informacji. Ksenoprzeszczep z ludzkimi komórkami rakowymi jest szeroko stosowany w modelach mysich, w których ludzkie komórki rakowe są inokulowane podskórnie, dootrzewnowo, dożylnie i ortotopowo. Model zwierzęcy z guzem przeszczepionym ortotopowo może wydajniej i dokładniej generować wyniki, które odzwierciedlają środowisko guza u ludzi w porównaniu z modelem zwierzęcym z guzem przeszczepionym heterotopowo. Dlatego dla wielu nowotworów u ludzi ustalono modele transplantacji ortotopowej7-11.

Tutaj opisujemy ortotopową inokulację ludzkich komórek EOC poprzez podejście zaotrzewnowe od strony grzbietowej, które ma ograniczoną inwazyjność w porównaniu do inokulacji brzusznej. Technika ta może dostarczyć wielu przydatnych informacji na temat EOC, zwłaszcza mechanizmu rozsiewu dootrzewnowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół leczenia jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach przyjętymi przez Uniwersytet w Nagoi.

1. Przygotowanie zawiesin komórkowych

  1. Ludzka linia komórkowa raka jasnokomórkowego jajnika.
    1. Utrzymuj komórki ES-212 w pożywce RPMI-1640 za pomocą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i penicyliny/streptomycyny (penicylina: 100 jednostek/ml, streptomycyna: 0,1 mg/ml). Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .
    2. Zbierz komórki w logarytmicznej fazie wzrostu w 0,05% roztworze trypsyny/0,02% EDTA (trypsyna/EDTA).
      1. Najpierw należy usunąć stare podłoża z naczynia do hodowli komórkowych, a następnie raz przemyć komórki PBS (PBS bez Ca2+/Mg2+, 3 - 4 ml na 25 cm2).
      2. Następnie dodaj 1 ml na 25cm2 trypsyny/EDTA. Obróć naczynie do hodowli komórkowej, aby pokryć monowarstwę komórki trypsyną/EDTA. Po wyjęciu i odrzuceniu trypsyny/EDTA, należy umieścić naczynie do hodowli komórkowej z powrotem w inkubatorze na 3 - 5 minut lub do momentu odłączenia komórek.
      3. Zbadaj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są oderwane od powierzchni naczynia do hodowli komórkowej i unoszą się na wodzie.
      4. Dodać świeżą surowicę zawierającą pożywkę wzrostową, aby dezaktywować trypsynę (5 ml na 25 cm2) i ponownie zawiesić komórki. Przenieść ponownie zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Przeprowadzić wirowanie w temperaturze 4 °C lub pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki wzrostowej (5 ml na 25 cm2).
    3. Policz komórki (np. przez wykluczenie trypana-błękitu), a następnie ponownie zawiesić w pożywce wzrostowej o gęstości 2 x 108 komórek/ml. Umieść zawieszone komórki na lodzie.
  2. Rozmrozić zamrożone podwielokrotności hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w łaźni lodowej.
  3. Dodać zawiesinę komórkową do podwielokrotności hydrożelu na bazie ECM w stosunku 1:1 (końcowe stężenie komórek: 1 x 105 komórek/μl hydrożelu na bazie pożywki ECM) i dokładnie wymieszać. Przygotowane zawiesiny komórkowe umieścić w łaźni lodowej do czasu użycia.

2. Inokulacja ortotopowa za pomocą zawiesin komórkowych

UWAGA: Operacja nie wymaga dedykowanego gabinetu. Operacja może być wykonana na stole laboratoryjnym w oddzielnej części pomieszczenia, która jest aktywna i ma minimalną aktywność. Można również użyć okapu laminarnego. Do wykonywania nacięć skóry należy używać sterylnych narzędzi chirurgicznych, a nożyczek.

  1. Użyj samic nagich myszy (BALB/c nu/nu) w wieku 8 tygodni dla tego modelu inokulacji ortotopowej.
  2. Najpierw znieczulij mysz za pomocą inhalacji z izofluranem (2 - 4%). Sprawdź głębokość znieczulenia, sprawdzając brak wycofania po mocnym uszczypnięciu palca. Po znieczuleniu myszy nałóż na oczy mdłą, sterylną maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu w razie potrzeby.
  3. Umieść znieczuloną mysz na scenie operacyjnej brzuchem do dołu. Kilkakrotnie zdezynfekuj obszar operacyjny zarówno alkoholem, jak i peelingiem na bazie jodu lub chlorheksydyny.
  4. Wykonaj ~ 2-centymetrowe nacięcie pionowo w pobliżu kręgosłupa między prawym łukiem żebrowym a kością udową. Użyj sterylnej serwety chirurgicznej wokół miejsca nacięcia. Przymocuj nacięte powierzchnie skóry za pomocą zacisków, aby utrzymać otwór.
    Uwaga: Zamiast zacisków można używać zwijaczy.
  5. Następnie wykonaj drugie nacięcie (około 1 cm) w otrzewnej ciemieniowej pod pierwszym nacięciem, aby otworzyć jamę brzuszną. Zacisnąć nacięte powierzchnie brzuszne. Przytnij tkankę tłuszczową otaczającą jajnik ipsilateralny i jajowód za pomocą zacisku, aby usunąć jajnik z jamy brzusznej. Ostrożnie umieść jajnik i jajowód na gazie. Następnie umieść mysz brzuchem do dołu pod mikroskopem preparacyjnym.
  6. Zawiesinę komórkową umieścić w strzykawce insulinowej (1/2 cm³, 29 g) tuż przed wstrzyknięciem. Ostrożnie wstrzyknąć przygotowaną zawiesinę komórkową (1 - 2 μl) do jajnika. Przez kilka sekund należy przytrzymać igłę w jajniku, aby zapewnić żelowanie hydrożelu na bazie ECM. Po żelowaniu wstrzyknięte komórki nowotworowe pozostają w jajniku.
  7. Ostrożnie wwróć jajnik do organizmu. Zszyj drugie nacięcie sterylnym jedwabiem medycznym, a następnie uszczelnij skórę klipsami do ran.
  8. Po operacji myszom zostanie podana lek przeciwbólowy (np. meloksykam, domięśniowo (i.m.) lub podskórnie (s.c.), 0,2 mg / kg) przez początkowy okres 24 godzin.

3. Leczenie pooperacyjne

  1. Umieść każdą mysz w osobnej klatce na czystym papierze z gorącym opakowaniem, aby utrzymać mysz w cieple, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Następnie zwróć zwierzęta do ich klatek w celu hodowli i monitorowania. Monitoruj myszy codziennie przez 3 - 7 dni po leczeniu chirurgicznym.
  2. Monitorowanie myszy pooperacyjnych
    1. W przypadku wystąpienia objawów bólu należy codziennie podawać leki przeciwbólowe (np. meloksykam, domięśniowo lub domięśniowo, 0,2 mg/kg).
    2. Jeśli myszy mają objawy infekcji (np. zaczerwienienie, obrzęk, upława), należy codziennie wstrzykiwać odczynnik przeciwinfekcyjny (np. penicylinę, domięśniowo, 100 000 j.m./kg).
  3. Usunąć materiały zamykające skórę 10 - 14 dni po leczeniu pooperacyjnym.

4. Analiza nowotworów i przerzutów

UWAGA: Guz powstanie w jajniku, w którym wstrzyknięto szczepionkę, 2 - 3 tygodnie po zaszczepieniu.

  1. Złóż myszy w ofierze za pomocą dwutlenku węgla, a następnie zbierz próbki (np. guzy, przerzuty, narządy)13-15 do dalszej analizy14,16-20,
    UWAGA: Jeśli dostępny jest system obrazowania in vivo, w tym protokole można użyć komórek zawierających enzymy wytwarzające bioluminescencję (np. lucyferazę) lub białko fluorescencyjne (np. GFP). Ten zmodyfikowany protokół dostarczy użytecznych informacji na temat dynamiki rozprzestrzeniania się komórek rakowych z guza pierwotnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sześć nagich myszy miało zaszczepione jajniki ludzką linią komórkową raka jasnokomórkowego ES-2, zgodnie z opisem w tym protokole. Jak pokazano na rycinie 1A, po 2 tygodniach 5 z 6 myszy miało guza w jajniku zaszczepionym komórkami ES-2, ale nie było guza w przeciwległym jajniku bez inokulacji (stosowanej jako kontrola). Co więcej, 2 z 5 myszy wykazywały wielokrotne rozsiewy otrzewnej z wodobrzuszem. Komórki dają przerzuty do wątroby (ryc. 1B). Jajniki, z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zwierzęce są niezbędne do analizy mechanizmów rozwoju nowotworu, progresji, przerzutów i skuteczności leków przeciwko komórkom rakowym. Myszy z ludzkimi komórkami raka jajnika zostały również wykorzystane jako model zwierzęcy. W tym miejscu opisujemy mniej inwazyjną procedurę podawania komórek nowotworowych jajnika w miejscu ortotopowym. Zastosowanie tej procedury polega na tym, że inokulacja do jajnika przez dostęp zaotrzewnowy od strony grzbietowej ma znaczące zalety w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom Zakładu Położnictwa i Ginekologii oraz Biologii Nowotworów za ich pomocne dyskusje i pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (15K15604; dla H. Kajiyamy).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Matrigel matrix BD354234Hydrożelowa
strzykawka insulinowaTERUMOSS-05M29131/2 cc, 29 G x 1/2"
Igła do szycia ze szwem11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Aplikator do klipsa na ranyCellPoint Scientific204-1000
  Klipsy refleksyjne 7 mmCellPoint Scientific203-1000
na bazie ECM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 61 (2), 69-90 (2011).
  2. Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
  3. Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
  4. Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
  5. Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
  6. Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
  7. Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
  8. Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
  9. Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
  10. Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
  11. Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
  12. Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
  13. Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
  14. Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
  15. Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
  16. Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534(2010).
  17. Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
  18. Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
  19. Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
  20. Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
  21. Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dost p zaotrzewnowypowierzchnia jajnika mysiegorak nab onkowy jajnikasamice myszy nudeprzygotowanie linii kom rkowejtraktowanie trypsyn z EDTAprocedura wirowania

Powiązane artykuły